Recent studies show that angiotensin II (AngII) can act from within the cell, possibly via intracellular receptors pharmacologically different from typical plasma membrane AngII receptors. The role of this intracellular AngII (AngIIi) is unclear. Besides direct effects of AngIIi on cellular processes one could hypothesise a possible role of AngIIi in modulation of cellular responses induced after heterologous receptor stimulation. We therefore examined if AngIIi influences [Ca2+]i in A7r5 smooth muscle cells after serotonin (5HT) or UTP receptor stimulation. Application of AngIIi using liposomes, markedly inhibited 45Ca2+ influx after receptor stimulation with 5HT or UTP. This inhibition was reversible by intracellular administration of the AT1-antagonist losartan and not influenced by the AT2-antagonist PD123319. Similar results were obtained in single cell [Ca2+]i measurements, showing that AngIIi predominantly influences Ca2+ influx and not Ca2+ release via AT1-like receptors. It is concluded that AngIIi modulates signal transduction activated by heterologous receptor stimulation.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte1.pdf: 1450137 bytes, checksum: 1838bf2efddf0ca147f276df88417bb6 (MD5) Previous issue date: 2009-09-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / It was been demonstrated that curine and reticuline, induced a vasodilator effect in the rat small mesenteric arteries through inhibition of voltage-gated Ca2+ channels (VGCC). These compounds, curine and reticuline were isolated from the root barks of Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, therefore the aim of this work was to evaluate the vasodilator mechanism of curine and reticuline, bisbenzylisoquinoline alkaloids (BBA), isolated from the root barks of Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, using functional and molecular approaches. Tension measurements in aorta rings, whole-cell patch-clamp and confocal techniques were employed to study the action of these alkaloids. The A7r5 smooth muscle derived cell line was used for Ca2+ currents measuring and the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) were evaluated using confocal microscopy. The main results are as follows: in aortic rings, curine (3 - 300 μM) antagonized KCl (60 mM) and Bay K8644 (3 x 10-7 M) induced contractions. In whole-cell configuration, curine reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner. However, the Ca+2 current density versus voltage relationship and maximal activation voltage of ICa,L were not changed. Moreover curine did not also affect the steady-state activation of ICa,L, but shifted the steady-state inactivation curve of ICa,L for more negative potentials, however this effect was not changed in the presence of IBMX, dbcAMP and 8-brcGMP, suggesting that cyclic mononucleotides, such as cAMP and cGMP, are not involved in curine effect. In confocal experiments, curine inhibited the rise on the [Ca2+]i induced by KCl (60 mM) in dispersed vascular smooth muscle cells. In reference to reticuline (3 300 μM) was verified that alkaloid agonized CaCl2 and KCl-induced contractions and elicited vasorelaxation in aortic rings. In whole-cell configuration, reticuline reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner, but did not change the characteristics of current density versus. voltage relationship. Reticuline shifted leftwards the steady-state inactivation curve of ICa,L, however this effect was not changed after application of dibutyryl cyclic adenosine monophosphate to the cell. In cells pretreated with forskolin, an adenylate cyclase activator, the addition of reticuline caused further inhibition of the Ca2+ currents suggesting an additive effect, indicating that cyclic mononucleotides were not involved. Taken together the results have shown that curine and reticuline elicits vasorelaxation due to the blockade of the L-type voltage-dependent Ca2+ current in rat aorta smooth muscle cells. The reported effect may contribute to the potential cardioprotective efficacy of curine and reticuline. / Curina e reticulina são alcalóides isolados das cascas do caule e raízes de Chondrondendron platyphyllum e de Ocotea duckei Vattimo, respectivamente. Estudos anteriores demonstraram que esses alcalóides são capazes de induzir efeito vasodilatador em artéria mesentérica e aorta de rato, respectivamente, devido possível inibição dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem (VGCC). O objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo vasodilatador de curina e reticulina realizando experimentações funcionais e moleculares. Foram utilizadas medidas de tensão em anéis de aorta de rato, e empregadas técnicas de patch-clamp e de microscopia confocal para estudos da ação desses alcalóides. Também foram utilizadas células A7r5, uma linhagem de células musculares lisas embrionária derivada de aorta torácica de rato, que foram usadas para medir as correntes de Ca2+ macroscópicas e a concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i), que foram avaliadas usando a técnicas de patch-clamp e microscopia confocal, respectivamente. Os principais resultados são: em anéis de aorta, curina (3 - 300 μM) antagonizou as contrações induzidas por KCl (60 mM) e Bay K8644 (3 x 10-7 M). Na configuração whole-cell patch clamp , curina reduziu a amplitude da corrente de cálcio do tipo L (ICa,L) de maneira dependente de concentração. Porém, curina não alterou as características das correntes na relação corrente-voltagem. A voltagem de ativação máxima para ICa,L não foi diferente em relação ao controle. Além disso, curina também não afetou a ativação no estado estacionário das ICa,L, mas deslocou a curva da inativação estacionária para potenciais mais negativos. No entanto, esse efeito promovido por curina não foi alterado na presença de IBMX, dbcAMP e 8- brcGMP, sugerindo que os mononucleotídeos cíclicos, como APMc e GMPc, não estão envolvidos no efeito da curina. Em experimentos com microscopia confocal curina inibiu os transientes de cálcio intracelulares, e reduziu o aumento de [Ca2+]i induzidos por KCl (60 mM) em células de músculo liso vascular. Em relação à reticulina (3 300 μM), foi verificado que esse alcalóide antagonizou as contrações induzidas por CaCl2 e KCl, provocando vasorelaxamento em anéis de aorta. Na configuração whole-cell patch clamp , reticulina também reduziu a amplitude das ICa,L de maneira dependente de concentração, mas não mudou as características da corrente na relação corrente-voltagem. A reticulina deslocou para potenciais mais negativos a curva de inativação estacionária para as ICa,L. Porém, esse efeito não foi alterado após a aplicação de dbcAMP e 8-brcGMP. Em células pré-tradadas com forskolina, um ativador da adenilil ciclase, a adição da reticulina causou uma inibição adicional das correntes de Ca2+ que sugere um efeito aditivo da reticulina, indicando que os mononucleotídeos cíclicos não estão envolvidos. Dessa forma, curina e reticulina provocaram vasorelaxamento, devido ao bloqueio das correntes de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo-L em células de músculo liso, em cultura e recémdispersas, de aorta de rato, revelando que esses alcalóides têm um importante potencial como modelo químico para a concepção e posterior desenvolvimento de novos fármacos com propriedade protetora cardiovascular.