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Herstellung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol Konstruktion und Charakterisierung einer Mutante des Lösungsmittel tolerierenden Pseudomonas putida Idaho /Germer, Andrea. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2002--Stuttgart.
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Die Bedeutung der Rhizosphäre von Bromus mollis L. als Ort erhöhter mikrobieller Aktivität im Boden für eine mögliche Mineralisation von XenobiotikaAletsee, Manfred. Unknown Date (has links) (PDF)
Techn. Hochsch., Diss., 2002--Aachen.
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Mikrobieller Abbau von IminodisuccinatCokesa, Željko. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2004--Stuttgart.
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Untersuchungen zum mikrobiellen Abbau von chlorierten Aromaten in einem Suspensions-MembranreaktorKappler, Axel. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2002--Bremen.
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The methionine biosynthesis operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Role of concerted RNA decay in transcript stability and T-box riboswitch turnover / Das Methioninbiosynthese-Operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Der Einfluss von koordiniertem RNA Abbau auf Transkriptstabilität und T-Box-Riboswitch-ProzessierungWencker, Freya Dorothea Ruth January 2022 (has links) (PDF)
Methionine is the first amino acid of every newly synthesised protein. In combination with its role as precursor for the vital methyl-group donor S-adenosylmethionine, methionine is essential for every living cell. The opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is capable of synthesising methionine de novo, when it becomes scarce in the environment. All genes required for the de novo biosynthesis are encoded by the metICFE-mdh operon, except for metX. Expression is controlled by a hierarchical network with a methionyl-tRNA-specific T-box riboswitch (MET-TBRS) as centrepiece, that is also referred to as met leader (RNA). T-box riboswitches (TBRS) are regulatory RNA elements located in the 5’-untranslated region (5’-UTR) of genes. The effector molecule of T-box riboswitches is uncharged cognate tRNA. The prevailing mechanism of action is premature termination of transcription of the nascent RNA in the absence of the effector (i.e. uncharged cognate tRNA) due to formation of a hairpin structure, the Terminator stem. In presence of the effector, a transient stabilisation of the alternative structure, the Antiterminator, enables transcription of the downstream genes (‘read-through’). Albeit, after the read-through the thermodynamically more stable Terminator eventually forms. The Terminator and the Antiterminator are two mutually exclusive structures. Previous work of the research group showed that in staphylococci the MET-TBRS ensures strictly methionine-dependent control of met operon expression. Uncharged methionyl-tRNA that activates the system is only present in sufficient amounts under methionine-deprived conditions. In contrast to other bacterial TBRS, the staphylococcal MET-TBRS has some characteristic features regarding its length and predicted secondary structure whose relevance for the function are yet unkown.
Aim of the present thesis was to experimentally determine the structure of the met leader RNA and to investigate the stability of the met operon-specific transcripts in the context of methionine biosynthesis control. Furthermore, the yet unknown function of the mdh gene within the met operon was to be determined.
In the context of this thesis, the secondary structure of the met leader was determined employing in-line probing. The structural analysis revealed the presence of almost all highly conserved T-box riboswitch structural characteristics. Furthermore, three additional stems, absent in all T-box riboswitches analysed to date, could be identified. Particularly remarkable is the above average length of the Terminator stem which renders it a potential target of the double-strand-specific endoribonuclease III (RNase III). The RNase III-dependent cleavage of the met leader could be experimentally verified by the use of suitable mutants. Moreover, the exact cleavage site within the Terminator was determined.
The unusual immediate separation of the met leader from the met operon mRNA via the RNase III cleavage within the Terminator stem induces the rapid degradation of the met leader RNA and, most likely, that of the 5’-region of the met mRNA. The met mRNA is degraded from its 5’-end by the exoribonuclease RNase J. The stability of the met mRNA was found to vary over the length of the transcript with an instable 5’-end (metI and metC) and a longer half-life towards the 3’-end (metE and mdh). The varying transcript stability is reflected by differences in the available cellular protein levels. The obtained data suggest that programmed mRNA degradation is another level of regulation in the complex network of staphylococcal de novo methionine biosynthesis control.
In addition, the MET-TBRS was studied with regard to a future use as a drug target for novel antimicrobial agents. To this end, effects of a dysregulated methionine biosynthesis on bacterial growth and survival were investigated in met leader mutants that either caused permanent transcription of the met operon (‘ON’) or prevented operon transcription (‘OFF’), irrespective of the methionine status in the cell. Methionine deprivation turned out to be a strong selection pressure, as ‘OFF’ mutants acquired adaptive mutations within the met leader to restore met operon expression that subsequently re-enabled growth.
The second part of the thesis was dedicated to the characterisation of the Mdh protein that is encoded by the last gene of the met operon and whose function is unknown yet. At first, co-transcription and -expression with the met operon could be demonstrated. Next, the Mdh protein was overexpressed and purified and the crystal structure of Mdh was solved to high resolution by the Kisker research group (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg). Analysis of the structure revealed the amino acid residues crucial for catalytic activity, and zinc was identified as a co-factor of Mdh. Also, Mdh was shown to exist as a dimer. However, identification of the Mdh substrate was, in the context of this thesis, (still) unsuccessful. Nevertheless, interactions of Mdh with enzymes of the met operon could be demonstrated by employing the bacterial two-hybrid system. This fact and the high conservation of mdh/Mdh on nucleotide and amino acid level among numerous staphylococcal species suggests an important role of Mdh within the methionine metabolism that should be a worthwhile subject of future research. / Methionin ist die erste Aminosäure in jedem neu gebildeten Protein. Zusammen mit seiner Funktion als Vorläufermolekül für die Synthese des essenziellen Methylgruppendonors S-Adenosylmethionin ist Methionin damit für jede lebende Zelle unverzichtbar. Staphylococcus aureus, ein opportunistisches Humanpathogen, ist in der Lage, Methionin de novo zu synthetisieren, wenn es nicht in ausreichender Menge in der Umgebung vorhanden ist. Mit Ausnahme von MetX sind alle für die Methioninsynthese benötigten Enzyme im metICFE-mdh-Operon kodiert. Die Expression des Operons wird durch ein komplexes hierarchisches Netzwerk reguliert, dessen zentrales Steuerelement ein Methionyl-tRNA-spezifischer T-Box-Riboswitch (MET-TBRS) ist, der auch als met-leader (RNA) bezeichnet wird. T-Box Riboswitches (TBRS) sind regulatorische RNA-Elemente, die in der untranslatierten Region am 5'-Ende (5'-UTR) ihrer zu kontrollierenden Gene liegen. Sie nutzen unbeladene tRNAs als Effektormoleküle. Die Funktionsweise der meisten TBRS beruht auf dem vorzeitigen Abbruch der Transkription der naszierenden mRNA, der durch die Ausbildung einer Haarnadelstruktur (Terminator) im Transkript herbeigeführt wird, wenn das Effektormolekül (i.e. unbeladene tRNA) fehlt. Sobald passende unbeladene tRNA verfügbar ist und bindet, wird eine alternative Struktur, der Antiterminator, kurzzeitig stabilisiert, der die Transkription und damit ein "Durchlesen" in die stromabwärtsliegenden Gene ermöglicht. Terminator und Antiterminator sind zwei sich gegenseitig ausschließende Strukturen, wobei der Terminator die thermodynamisch deutlich stabilere Struktur des TBRS ist, die sich dementsprechend auch in den vollständigen Transkripten erneut ausbildet. Bisherige Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass in Staphylokokken der MET-TBRS die Kontrolle der Methioninsynthese in strikter Abhängigkeit von Methionin gewährleistet. Unbeladene Methionyl-tRNA, die nur unter Methioninmangelbedingungen in ausreichenden Konzentrationen vorliegt, aktiviert das System. Im Unterschied zu anderen bakteriellen TBRS weist der Staphylokokken-MET-TBRS (met-leader) hinsichtlich seiner Länge und vorhergesagten Struktur einige Besonderheiten auf, deren Bedeutung für die Funktion bislang unklar sind.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Struktur der met-leader-RNA experimentell zu bestimmen und die Stabilität met-Operon-spezifischer Transkripte im Kontext der Methioninbiosynthesekontrolle zu untersuchen. Ebenso sollte die bisher unbekannte Funktion des mdh-Genes im Operon aufgeklärt werden.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Sekundärstruktur der met-leader-RNA mit Hilfe des so genannten In-line Probings bestimmt. Die Sekundärstruktur weist neben fast allen hochkonservierten Strukturmerkmalen eines T-Box-Riboswitches auch drei zusätzliche Haarnadelstrukturen auf, die bisher in keinem anderen T-Box-Riboswitch gefunden wurden. Besonders auffällig ist die überdurchschnittliche Länge des met-leader-Terminators, der dadurch zur potentiellen Zielstruktur für die Doppelstrang-spezifische Endoribonuklease RNase III wird. Mittels geeigneter Mutanten konnte die RNase III-abhängige Prozessierung der met-leader-RNA experimentell bewiesen werden. Ebenso wurde die exakte Schnittstelle im Terminator bestimmt. Die ungewöhnliche Prozessierung des Terminators durch die RNase III spaltet die met-leader-RNA von der met-mRNA ab, was den raschen weiteren Abbau der met-leader-RNA und sehr wahrscheinlich auch den der met-mRNA einleitet. So wird die met-mRNA durch die Exoribonuklease RNase J vom 5'-Ende her abgebaut, wobei die Stabilität bezogen auf die Gesamtheit des Moleküls stark variiert: Das 5'-Ende mit den Genen metI und metC wird äußerst schnell degradiert, während das 3'-Ende mit metE und mdh deutlich stabiler ist. Die variierende mRNA-Stabilität spiegelt sich auch in Unterschieden hinsichtlich der verfügbaren zellulären Proteinmengen wider. Die Daten legen daher nahe, dass programmierte mRNA-Degradation eine weitere Ebene im komplexen Kontrollnetzwerk darstellt, durch die in Staphylokokken die Methioninbiosynthese sehr exakt den jeweiligen Bedürfnissen angepasst wird.
Des Weiteren wurde der MET-TBRS im Hinblick auf eine zukünftige Nutzung als Angriffspunkt für neue antibakterielle Wirkstoffe untersucht. Dazu wurden die Auswirkungen einer dysregulierten Methioninbiosynthese auf das bakterielle Wachstum und Überleben mit Hilfe von met-leader-Mutanten analysiert, die entweder zu einer permanenten Aktivierung („ON“) oder Deaktivierung („OFF“) der met-Operon-Transkription, unabhängig vom Methioninstatus in der Zelle, führten. Es zeigte sich, dass Methioninmangel einen starken Selektionsdruck darstellt, da die „OFF“-Mutanten in der Lage waren, durch den Erwerb von adaptiven Mutationen innerhalb der met-leader-Sequenz, das met-Operon erneut zu aktivieren und wieder zu wachsen.
Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung des Mdh-Proteins, das im letzten Gen des met-Operons kodiert ist und dessen Funktion derzeit gänzlich unbekannt ist. Zunächst konnte die Kotranskription und -expression von mdh mit dem met-Operon gezeigt werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Kisker (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg) wurden anhand von Kristallstrukturanalysen die Aminosäuren identifiziert, die entscheidend für die katalytische Aktivität des Mdh-Enzyms sind, wobei Zink als ein Kofaktor fungiert. Ebenso zeigte sich, dass Mdh als Dimer vorliegt. Allerdings ist die Identifizierung des Mdh-Substrates im Rahmen dieser Arbeit (noch) nicht gelungen. Mittels eines bakteriellen Zwei-Hybridsystems wurde jedoch nachgewiesen, dass Mdh mit den anderen Enzymen des met-Operons interagiert. Dies und die hohe Konservierung von mdh/Mdh auf Nukleotid- und Aminosäureebene in verschiedenen Staphylokokkenarten legt eine wichtige Funktion von Mdh im Methioninstoffwechsel nahe, die lohnenswerter Gegendstand weiterer Untersuchungen sein sollte.
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Der Abbau von Fluorbenzol und seinen Homologen durch Burkholderia fungorum FLU 100Strunk, Niko, January 2007 (has links)
Stuttgart, Universiẗat, Diss., 2008.
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Structural and Functional Characterization of the Enzymes Involved in the Menaquinone Biosynthesis and Benzoate Degradation / Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Enzymen, die an der Menaquinon-Biosynthese und der Biodegradation von Benzoat beteiligt sindMishra, Shambhavi January 2013 (has links) (PDF)
The present work illustrates the structural and biochemical characterization of two diverse proteins, BadI and MenD from Rhodopseudomonas palustris and Staphylococcus aureus, respectively.
BadI or 2-ketocyclohexanecarboxyl-CoA is one of the key enzymes involved in the anaerobic degradation of aromatic compounds. The degradation of aromatic compounds is a vital process for the maintenance of the biogeochemical carbon cycle and bioremediation of xenobiotic compounds, which if present at higher concentrations can cause potential hazards to humans. Due to the relatively inert nature of aromatic compounds, enzymes catalyzing their degradation are of special interest for industrial applications. BadI is one of the key enzymes involved in the anaerobic degradation of aromatic compounds into an aliphatic moiety.
The major focus of this study was to provide mechanistic insights into the reaction catalyzed by BadI. BadI belongs to the crotonase superfamily and shares high sequence homology with the family members of MenB or dihydroxynaphthoate synthase. BadI is known to catalyze the cleavage of the cyclic ring of 2-ketocyclohexane carboxyl-CoA by hydrolyzing the C-C bond leading to the formation of the aliphatic compound pimelyl CoA. On the other hand MenB catalyzes the condensation reaction of o-succinylbenzoyl-CoA to dihydroxylnaphthoyl-CoA. A comprehensive amino acid sequence analysis between BadI and MenB showed that the active site residues of MenB from Mycobacterium tuberculosis (mtMenB) are conserved in BadI from Rhodopseudomonas palustris. MenB is involved in the menaquinone biosynthesis pathway and is a potential drug target against Mycobacterium tuberculosis as it has no known human homologs. Due to the high homology between MenB and BadI and the inability to obtain MenB-inhibitor complex structures we extended our interest to BadI to explore a potential substitute model for mtMenB as a drug target.
In addition, BadI possesses some unique mechanistic characteristics. As mentioned before, it hydrolyzes the substrate via a retro Dieckmann’s reaction contrasting its closest homolog MenB that catalyzes a ring closing reaction through a Dieckmann’s reaction. Nevertheless the active site residues in both enzymes seem to be highly conserved. We therefore decided to pursue the structural characterization of BadI to shed light on the similarities and differences between BadI and MenB and thereby provide some insights how they accomplish the contrasting reactions described above.
We determined the first structures of BadI, in its apo and a substrate mimic bound form. The crystal structures revealed that the overall fold of BadI is similar to other crotonase superfamily members. However, there is no indication of domain swapping in BadI as observed for MenB. The absence of domain swapping is quite remarkable because the domain swapped C-terminal helical domain in MenB provides a tyrosine that is imperative for catalysis and is also conserved in the BadI sequence. Comparison of the active sites revealed that the C-terminus of BadI folds onto its core in such a way that the conserved tyrosine is located in the same position as in MenB and can form interactions with the ligand molecule. The structure of BadI also confirms the role of a serine and an aspartate in ligand interaction, thus validating that the conserved active site triad participates in the enzymatic reaction. The structures also reveal a noteworthy movement of the active site aspartate that adopts two major conformations. Structural studies further illuminated close proximity of the active site serine to a water and chlorine molecule and to the carbon atom at which the carbonyl group of the true substrate would reside. Biochemical characterization of BadI using enzyme kinetics validated that the suggested active site residues are involved in substrate interaction. However, the role of these residues is very distinct, with the serine assuming a major role. Thus, the present work ascertain the participation of putative active site residues and demonstrates that the active site residues of BadI adopt very distinctive roles compared to their closest homolog MenB.
The MenD protein also referred to as SEPHCHC (2-succinyl-5-enolpyruvyl-6- hydroxy-3-cyclohexene-1-carboxylic acid) synthase is one of the enzymes involved in menaquinone biosynthesis in Staphylococcous aureus. Though S. aureus is usually considered as a commensal it can act as a remarkable pathogen when it crosses the epithelium, causing a wide spectrum of disorders ranging from skin infection to life threatening diseases. Small colony variants (SCVs), a slow growing, small sized subpopulation of the bacteria has been associated with persistent, recurrent and antibiotic resistant infections. These variants show autotrophy for thiamine, menaquinone or hemin. Menaquinone is an essential component in the electron transport pathway in gram-positive organisms. Therefore, enzymes partaking in this pathway are attractive drug targets against pathogens such as Mycobacterium tuberculosis and Bacillus subtilis. MenD, an enzyme catalyzing the first irreversible step in the menaquinone biosynthetic pathway has been implicated in the SCV phenotype of S. aureus. In the present work we explored biochemical and structural properties of this important enzyme.
Our structural analysis revealed that despite its low sequence identity of 28%, the overall fold of staphylococcal MenD (saMenD) is similar to Escherichia coli MenD (ecMenD) albeit with some significant disparities. Major structural differences can be observed near the active site region of the protein and are profound in the C-terminal helix and a loop near the active site. The loop contains critical residues for cofactor binding and is well ordered only in the ecMenD-ThDP structure, while in the apo and substrate bound structures of ecMenD the loop is primarily disordered. In our saMenD structure the loop is for the first time completely ordered in the apo form and displays a novel conformation of the cofactor-binding loop. The loop adopts an unusual open conformation and the conserved residues, which are responsible for cofactor binding are located too far away to form a productive complex with the cofactor in this conformation. Additionally, biochemical studies in conjugation with the structural data aided in the identification of the substrate-binding pocket and delineated residues contributing to its binding and catalysis. Thus the present work successfully divulged the unique biochemical and structural characteristics of saMenD. / Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der strukturellen und biochemischen Charakterisierung der beiden unterschiedlichen bakteriellen Enzyme BadI von Rhodopseudomonas palustris und MenD von Staphylococcus aureus.
Die 2-Ketocyclohexancarboxyl-CoA-Hydrolase BadI ist eines der Schlüsselenzyme des anaeroben Abbaus aromatischer Verbindungen. Der Abbau aromatischer Verbindungen ist essentiell für die Aufrechterhaltung des biogeochemischen Kohlenstoffkreislaufs und der biologischen Beseitigung von Xenobiotika, welche in höheren Konzentrationen eine Gefahr für den menschlichen Organismus darstellen können. Wegen des inerten Charakters aromatischer Verbindungen sind Enzyme, welche deren Abbau katalysieren, von besonderem Interesse für industrielle Anwendungen. BadI ist eines der Schlüsselenzyme für den anaeroben Abbau aromatischer Verbindungen zu aliphatischen Gruppen.
Das Hauptaugenmerk dieses Projekts lag auf der Aufklärung des Reaktionsmechanismus, welcher von BadI katalysiert wird. BadI gehört zur Überfamilie der Crotonasen und zeigt hohe Sequenzhomologie mit der zugehörigen Dihydroxynaphthoat-Synthase MenB. Durch die Hydrolyse einer C-C Bindung katalysiert BadI den Schnitt des zyklischen Rings von 2-Ketocyclohexancarboxyl-CoA, welcher zur Bildung der aliphatischen Verbindung Pimelyl-CoA führt. MenB, andererseits, katalysiert die Kondensationsreaktion von O-Succinylbenzyl-CoA zu Dihydronaphthoyl-CoA. Ein umfassender Aminosäuresequenzvergleich zwischen BadI und MenB zeigt, dass die Reste des aktiven Zentrums von MenB aus Mycobacterium tuberculosis (mtMenB) in BadI von R. palustris konserviert sind. MenB ist Teil des Menaquinon Biosynthesewegs und ein potentielles Wirkstoffziel gegen M. tuberculosis, da kein humanes Homolog existiert. Wegen der ausgeprägten Homologie zwischen MenB und BadI und der Tatsache, dass bisher keine MenB-Inhibitor Komplex Strukturen gelöst werden konnten, erweiterten wir unser Interesse auf BadI, da es als Model für mtMenB als Wirkstoffziel dienen könnte.
Darüber hinaus besitzt BadI einige einzigartige mechanistische Charakteristika. Wie zuvor erwähnt, hydrolysiert es das Substrate durch eine reverse Dieckmanns Reaktion in Gegensatz zu seinem ähnlichsten Homolog MenB, das einen Ringschluss durch eine Dieckmanns Reaktion katalysiert. Dennoch scheinen die Reste des aktiven Zentrums streng konserviert zu sein. Daher entschieden wir die strukturelle Charakterisierung von BadI anzugehen um Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen BadI und MenB aufzuzeigen und einen Einblick zu erhalten, wie sie die gegenläufigen Reaktionen durchführen.
Wir lösten die ersten Strukturen von BadI in seiner Apo-Form und einer Substrat-Mimik gebundenen Form. Die Kristallstrukturen von BadI zeigten die gleiche Gesamtfaltung wie andere Mitglieder der Crotonase Familie. Allerdings gibt es in BadI kein Anzeichen für Domain-Swapping, wie es in MenB beobachtet wurde. Das Fehlen des Domain-Swappings ist bemerkenswert, da die vertauschte C-terminale helikale Domäne in MenB ein Tyrosin enthält, welches essentiell für die Katalyse ist und auch in BadI konserviert vorliegt. Der Vergleich des aktiven Zentrums zeigt, dass der C-Terminus von BadI so auf seinen Kern/Hauptteil faltet, dass das konservierte Tyrosin an der gleichen Stelle positioniert ist wie in MenB und mit dem Liganden interagieren kann. Die Struktur von BadI bestätigt auch die Rolle eines Serin- und eines Aspartatrests für die Ligandenbindung und bekräftigt damit, dass das konservierte aktive Zentrum an der enzymatischen Reaktion teilnimmt. Die Strukturen zeigen auch eine bemerkenswerte Verschiebung des aktiven Aspartats, welches zwei Hauptkonformationen einnimmt. Strukturelle Analysen zeigten auch die Nähe des Serinrests zu einem Wasser- und Chlormolekül, sowie einem Kohlenstoffrest, an dessen Stelle der Carbonylrest des eigentlichen Substrats läge. Die biochemische Charakterisierung von BadI in enzymkinetischen Untersuchungen bestätigte dass die vorgeschlagenen Reste des aktiven Zentrums an der Substratbindung beteiligt sind. Jedoch ist die Rolle der verschiedenen Reste sehr verschieden, wobei dem Serin eine herausragende Rolle zugedacht wird. Die hier dargestellte Arbeit bestätigt die Mitwirkung des mutmaßlichen aktiven Zentrums und zeigt, dass die Reste des Aktiven Zentrums von BadI eine unterschiedliche Rolle, im Vergleich zu ihrem ähnlichsten Homolog MenB, spielen.
MenD, eine SEPHCHC (2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexene-1-carbonsäure) Synthase, ist an der Menaquinonbiosynthese von S. aureus beteiligt. Obwohl S. aureus gewöhnlich als Kommensale betrachtet wird, kann es als bemerkenswertes Pathogen auftreten, wenn es die Epithelwand durchbricht und eine Vielzahl an Erkrankungen, von einfachen Hautinfektionen bis zu lebensbedrohlichen Zustanden, verursachen. Sogenannte „Small colony variants“ (SCVs), eine langsam wachsende, kleinzellige Subpopulation der Bakterien wurde mit persistenten, rezidivierenden und antibiotika-resistenten Infektionen assoziiert. Diese Varianten weisen einen Mangel von Thiamin, Menaquinon und Hämin auf. Menaquinon ist ein essentieller Bestandteil der Elektronentransport-Kette in grampositiven Organismen. Daher sind Enzyme dieses Stoffwechselwegs attraktive Wirkstoffziele gegen Krankheitserreger wie M. tuberculosis oder Bacillus subtilis. MenD, das Enzym, welches den ersten irreversiblen Schritt des Menaquinon-Biosynthesewegs katalysiert, wurde mit dem SCV Phänotyp von S. aureus in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit werden die biochemischen und strukturellen Eigenschaften dieses wichtigen Enzyms untersucht.
Unsere strukturelle Untersuchung zeigte, dass trotz einer niedrigen Sequenzidentität von 28%, die Gesamtfaltung von S. aureus MenD (saMenD) mit derjenigen von Escherichia coli MenD (ecMenD), trotz einiger signifikanter Abweichungen, übereinstimmt. Größere strukturelle Unterschiede können nahe des aktives Zentrums des Proteins beobachtet werden, vor allem in der C-terminalen Helix und einer Schleife nahe dem aktiven Zentrum. Die Schleife enthält kritische Reste für die Kofaktorbindung und liegt nur in der ecMenD-ThDP Komplexstruktur definiert vor, während die in der Apo-Form und der Substrat-gebundenen Struktur von ecMenD ungeordnet ist. In unserer saMenD Struktur zeigt sich die Schleife erstmals komplett geordnet in der Apo-Form und stellt eine neue Konformation der Kofaktor-Bindeschleife dar. Die Schleife nimmt eine ungewöhnlich offene Konformation an und die konservierten Reste, welche für die Kofaktorbindung verantwortlich sind, sind zu weit entfernt, um in dieser Position einen produktiven Komplex mit dem Kofaktor zu bilden. Zudem haben biochemische Studien in Verbindung mit den strukturellen Daten zur Identifizierung der Substratbindetasche und der an der Bindung und Katalyse beteiligten Aminosäuren beigetragen. In der vorliegenden Arbeit wurden die biochemischen und strukturellen Charakteristika von saMenD erfolgreich aufgeklärt.
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Biodegradable solvent cast films and solution electrospun meshes for the prevention of postsurgical adhesions / Bioabbaubare aus der Lösung gegossene Filme und elektrogesponnenen Vliese zur Prävention von GewebeadhäsionenKeßler, Martina January 2015 (has links) (PDF)
Intraperitoneal adhesions are fibrous bands that connect tissues in the peritoneal cavity that are usually separated. These adhesions form as a consequence of trauma, inflammation or surgical interventions and often result in severe consequences such as chronic pain, small bowel obstructions or female infertility.
The aim of this thesis was to develop a synthetic barrier device for adhesion prevention made of modified poly(lactide) [PLA]. Solid PLA films (SurgiWrap®) are already successfully in clinical use due to the good biocompatibility and the biodegradability of the material resulting in non-toxic degradation products since lactic acid is naturally part of the metabolic circles of the human body. Considering the brittleness and stiffness of the films, the long degradation time of several months as well as the need for suturing, there is potential for optimization. Through a copolymerization with the hydrophilic poly(ethylene glycol) [PEG], a reduction of the degradation time was intendend. Moreover, the copolymerization should also lead to an improvement of the mechanical properties of the films since PEG acts as plasticizer for PLA. Linear PLA-PEG-PLA triblock copolymers as well as star-shaped PEG-PLA copolymers were synthesized via standard ring opening polymerization to tailor the barrier properties. Besides solid films, solution electrospun meshes from PLA and the synthesized PEG-PLA copolymers were investigated for a potential application as well. Since suturing of a barrier additionally induces adhesion formation, alginate coated membranes were prepared in order to achieve self-adhesiveness. With the intention to reduce infections and consequently inflammation, electrospun meshes and solvent cast films were loaded with the antibacterial drug triclosan and drug release as well as antibacterial efficacy was investigated.
Mechanical tests confirmed that through the variation of the PEG content and branching the mechanical properties can be tailored and are in good accordance with the glass transition temperatures [Tg] of the polymers. Consequently, potentially adequate mechanical properties for surgical handling as well as for the performance within the patient’s body were successfully achieved. Degradation studies revealed that the degradation time was significantly shorter for PEG-PLA membranes than for PLA films and with an appropriate PEG content could be adjusted to the intended time frame. Cell adhesion and viability tests confirmed the non-toxicity of the clinically used PLA films as well as of PEG-PLA films and meshes. With a bioadhesion test the benefit of an alginate coated side towards the pure PLA film concerning self-adhesiveness was successfully demonstrated. Moreover, optical evaluations and a T-peel test of different alginate coated PLA films showed that the cohesion between the chemically different layers was distinctly enhanced by the use of an appropriate PEG-PLA mesh as intermediate cohesion promoting layer. In in vitro release studies with triclosan loaded films a higher release was determined for PEG-PLA than for PLA films. In agar diffusion tests a higher and longer inhibition of staphylococcus aureus growth was observed confirming the release results. Moreover, drug loaded meshes (especially drug loaded after electrospinning) showed enhanced and elongated bacterial inhibition in comparison to films. / Intraperitoneale Adhäsionen sind fibröse Bänder, die Gewebe in der Peritonealhöhle miteinander verbinden, die normalerweise voneinander getrennt sind. Diese Adhäsionen entstehen als Folge von Trauma, Entzündung oder chirurgischen Eingriffen und bringen oft schwerwiegende Folgen mit sich wie chronische Schmerzen, Dünndarmobstruktionen oder Unfruchtbarkeit bei Frauen.
Ziel dieser Arbeit war es, synthetische Barrieren aus modifiziertem Poly(laktid) [PLA] für die Adhäsionsprävention zu entwickeln. PLA-Filme (SurgiWrap®) werden bereits erfolgreich klinisch eingesetzt aufgrund der guten Biokompatibilität und der Bioabbaubarkeit des Materials mit seinen ungiftigen Abbauprodukten, da Milchsäure natürlicher Bestandteil der metabolischen Zyklen im menschlichen Körper ist. Betrachtet man jedoch die Sprödigkeit und Steifigkeit der Filme, die lange Abbauzeit von mehreren Monaten sowie die Notwendigkeit des Annähens, erkennt man noch Verbesserungspotential. Durch eine Copolymerisation mit hydrophilem Poly(ethylen glykol) [PEG] wurde eine Reduktion der Abbauzeit angestrebt. Zusätzlich sollte die Copolymerisation zu einer Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der Filme führen, da PEG als Weichmacher von PLA dient. Lineare PLA-PEG-PLA-Triblock-Copolymere sowie sternförmige PEG-PLA-Copolymere wurden über eine Standard-Ringöffnungspolymerisation synthetisiert um die Barriereeigenschaften maßzuschneidern. Neben massiven Filmen wurden aus der Lösung elektrogesponnene Vliese aus PLA und den synthetisierten PEG-PLA-Copolymeren für eine potentielle Anwendung untersucht. Da das Annähen einer Barriere zusätzlich Adhäsionsbildung hervorruft, wurden mit Alginat beschichtete Membranen hergestellt um eine Selbsthaftung zu erreichen. Mit der Intention, Infektionen und damit Entzündungen zu reduzieren, wurden elektrogesponnene Vliese und aus der Lösung gegossene Filme mit dem antibakteriellen Arzneistoff Triclosan beladen und die Freisetzung sowie die antibakterielle Wirksamkeit untersucht.
Mechanische Tests bestätigten, dass mit der Variation von PEG-Gehalt und Verzweigung die mechanischen Eigenschaften zugeschnitten werden können und gut mit den Glasübergangstemperaturen der Polymere in Einklang stehen. Folglich konnten potentiell passende mechanische Eigenschaften für die chirurgische Handhabung sowie für das Verhalten im Körper des Patienten erfolgreich erreicht werden. Abbaustudien zeigten, dass die Abbauzeit von PEG-PLA-Membranen signifikant kürzer war als von PLA-Filmen und mit geeignetem PEG-Gehalt erfolgreich auf den erzielten Zeitraum hin angepasst werden konnte. Zelladhäsion und Zellviabilitätstests bestätigten die Ungiftigkeit der klinisch eingesetzten PLA-Filme sowie der PEG-PLA-Filme und –Vliese. Mit einem Bioadhäsionstest konnte der Nutzen einer Alginatbeschichtung gegenüber einem reinen PLA-Film bezüglich einer Selbsthaftung erfolgreich gezeigt werden. Außerdem ergaben visuelle Begutachtungen und ein T-Peeltest von verschiedenen mit Alginat beschichteten PLA-Filmen, dass die Kohäsion zwischen den chemisch unterschiedlichen Schichten durch den Einsatz eines geeigneten PEG-PLA-Vlieses als kohäsionsfördernde Zwischenschicht deutlich verstärkt wurde. In in vitro Freisetzungsstudien mit Triclosan-beladenen Filmen wurde eine höhere Freisetzung für PEG-PLA- als für PLA-Filme bestimmt. In Agardiffusionstests wurde eine höhere und längere Wachstumshemmung von Staphylococcus aureus beobachtet, was die Freisetzungsergebnisse bestätigt. Weiterhin zeigten Arzneistoff-beladene Vliese (insbesondere mit Arzneistoffbeladung nach dem Elektrospinning) eine verstärkte und verlängerte bakterielle Inhibition im Vergleich zu Filmen.
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Isolation, characterization and interactions of soil microorganisms involved in the enhanced biodegradation of non-fumigant organophosphate nematicidesCabrera Motta, José Alfonso January 2009 (has links)
Zugl.: Bonn, Univ., Diss., 2009
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Untersuchung zur mikrobiologischen Stabilisierung von EmulsionenBadolato Bönisch, Gabriela January 2009 (has links)
Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 2009 / Hergestellt on demand. - Zusätzliches Online-Angebot unter http://uvka.ubka.uni-karlsruhe.de/shop/isbn/978-3-86644-407-2
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