Das Wachstum von M. acetivorans mit Kohlenmonoxid (CO) als Energiesubstrat unterscheidet sich deutlich von dem anderer methanogener Archaeen. M. acetivorans kann während des Wachstums auf CO zwischen Methanogenese und Azetogenese wechseln. Ein wichtiges Enzym, welches den Kohlenstoff-Fluss im Energiestoffwechsel von M. acetivorans reguliert, ist die N5-Methyl-H4SPT:HS-CoM-Methyltransferase Mtr. Durch die Deletion dieses Enzyms konnte ein Stamm, MKOmtr3, erhalten werden, welcher prinzipiell azetogen auf CO wächst, aber geringe Mengen an zusätzlichen Methylgruppen benötigt. Es zeigte sich, dass das bei der Methylgruppen-Reduktion gebildete Heterodisulfid aus HS-CoB und HS-CoM höchstwahrscheinlich für (eine) essentielle anabole Reaktion(en) benötigt wird. In Zellsuspensionen mit MKOmtr3 wurde festgestellt, dass M. acetivorans aus CO kein Methan bildet, d.h. die Mtr-Reaktion nicht umgangen werden kann. Demgegenüber wurde bei Supplementation mit einem Methylgruppen-Donor CO2 gebildet. Mit Hilfe von [13C]-Markierung konnte gezeigt werden, dass das CO2 nicht aus dem Methylgruppen-Donor, sondern aus intrazellulären Speicherstoffen gebildet wird und die Methylgruppen als Elektronenakzeptor fungieren. Somit konnte in dieser Arbeit die von anderer Seite aufgestellte Hypothese, dass es einen cytoplasmatischen Mtr-Bypass gibt, widerlegt werden. Durch Selektion konnten mehrere Suppressoren von MKOmtr3 erhalten werden, welche in der Lage waren mit CO ohne zusätzliche Methylgruppen zu wachsen. Dabei wurde festgestellt, dass diese Stämme nur noch Spuren von Methan bildeten und somit ausschließlich azetogen wuchsen. Dem Suppressor MKOmtrSF fehlte HdrD, das aktive Zentrum der membranständigen Heterodisulfid-Reduktase (HdrED). Das Fehlen der bisher als essentiell bezeichneten HdrED konnte durch Quantifizierung der Enzymaktivität und gezielter Deletion der codierenden Gene bestätigt werden. Trotz der azetogenen Lebensweise von MKOmtrSF und MKOmtrhdr blieb Mcr essentiell, da es weder gelang das Enzym zu inhibieren, ohne die Lebensfähigkeit des Stammes zu verlieren, noch die codierenden Gene zu deletieren. Um einen maximalen Fluss der geringen Mengen an Heterodisulfid, welche von Mcr noch produziert wird, zum Anabolismus zu gewährleisten, wird anscheinend der Haupt-“Verbraucher“, HdrED, ausgeschaltet. In dieser Arbeit wurde somit erstmals gezeigt, dass die Methanogenese nicht zwangsläufig essentiell in methanogenen Archaeen ist, sondern durch eine Variante des reduktiven Azetyl-CoA-Weges ersetzt werden kann.:Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung 7 1.1 Methan 7 1.2 Methanogene und Methanogenese 7 1.2.1 Hydrogenotrophe Methanogenese 9 1.2.2 Methylotrophe Methanogenese 12 1.2.3 Azetiklastische Methanogenese 14 1.2.4 Carboxidotrophe Methanogenese 16 1.3 M. acetivorans als Modellorganismus 20 1.4 Ziele dieser Arbeit 23 2. Material und Methoden 25 2.1 Chemikalien 25 2.2 Anaerobes Arbeiten 25 2.3 Verwendete Mikroorganismen 26 2.4 Mikrobiologische Methoden 27 2.4.1 Kultivierung von E. coli 27 2.4.2 Kultivierung von M. acetivorans 28 2.4.3 Bestimmung der Zellausbeute 31 2.4.4 Herstellung von Zellsuspensionen von M. acetivorans 32 2.4.5 Herstellung elektroporationskompetenter E. coli-Zellen 33 2.4.6 Transformation von E. coli 33 2.4.7 Polyethylenglykol-vermittelte Transformation von M. acetivorans 34 2.4.8 Liposomen-vermittelte Transformation von M. acetivorans 35 2.5 Molekularbiologische Methoden 36 2.5.1 Plasmide 36 2.5.2 Oligonukleotide 38 2.5.3 Isolierung von Plasmiden 43 2.5.4 Isolierung von genomischer DNA 43 2.5.5 Restriktionsverdau 44 2.5.6 Ligation mehrerer DNA-Fragmente 44 2.5.7 Cointegration von pAMG40 in pDN201-Derivate 45 2.5.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 45 2.5.9 Agarose-Gelelektrophorese 46 2.5.10 Sequenzierung von DNA 47 2.6 Analyse von Proteinen 47 2.6.1 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 47 2.6.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 48 2.6.3 Proteomanalyse 49 2.6.4 Bestimmung der Fumarat-Reduktase-Aktivität 51 2.6.5 Bestimmung der Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität 52 2.7 Quantifizierung von Metaboliten 53 2.7.1 Quantifizierung gasförmiger Metabolite 53 2.7.2 Quantifizierung gelöster Metabolite 55 3. Ergebnisse 57 3.1 Wachstum von M. acetivorans M42 57 3.2 Deletion der Molybdän-abhängigen Formylmethanofuran-Dehydrogenasen 61 3.2.1 Deletion von Fmd1 61 3.2.2 Phänotypische Analyse von MKOfmd1 62 3.2.3 Deletion von Fmd2 64 3.3 Deletion der Formyltransferase Ftr 64 3.4 Deletion der Methyltransferase Mtr 67 3.4.1 Wachstum von MKOmtr3 mit Azetat + MeOH 67 3.4.2 Wachstum von MKOmtr3 mit CO + MeOH 70 3.5 Analyse von möglichen Mtr-Bypässen 74 3.5.1 Metabolitenbildung in Zellsuspensionen aus CO, MeOH und Trimethylamin 74 3.5.2 Deletion von Mtr in DmtsDFH 77 3.5.3 Markierung mit [13C]-MeOH 79 3.6 Überwindung der Methylgruppen-Abhängigkeit von MKOmtr3 82 3.6.1 Ersatz von MeOH bei Wachstum auf CO 82 3.6.2 Genom-Analyse von ausgewählten Suppressoren 85 3.6.3 Proteom-Analyse von ausgewählten Suppressoren 91 3.6.4 Physiologie von MKOmtrSF 96 3.6.5 Komplementation von MKOmtrSF mit MA2238 100 3.6.6 Fumarat-Reduktase-Aktivität in M. acetivorans? 101 3.6.7 Abhängigkeit der Azetogenese vom Elektronentransport über die Zellmembran 101 3.7 Deletion der Heterodisulfid-Reduktase HdrED1 in MKOmtrSF 103 3.7.1 Anpassung der PEG-Transformationsmethode für MKOmtrSF 103 3.7.2 Konstruktion des Stammes MKOmtrhdr und dessen Wachstum 104 3.7.3 Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität in M. acetivorans 105 3.8 Untersuchung der Essentialität von Mcr in MKOmtrSF 107 3.8.1 Inhibierung mit Bromethansulfonat und 3-Nitrooxy-Propanol 107 3.8.2 Deletion der Methyl-S-CoM Reduktase Mcr 109 4. Diskussion 113 4.1 Die Formiatbildung von M. acetivorans beim Wachstum auf CO 113 4.2 Methanogenese oder Azetogenese – die Rolle von Mtr als „Schalter“ 116 4.3 In M. acetivorans gibt es keinen cytoplasmatischen Mtr-Bypass 117 4.4 Die Abhängigkeit von MKOmtr3 von Methylgruppen und wie diese umgangen werden konnte 118 4.4.1 Der Verlust von MA2238 118 4.4.2 Der Verlust von MA2285 in MKOmtrSF 119 4.5 Katabole Methyl-Reduktion von MKOmtr3 120 4.6 Eine anabole Rolle von CoB-S-S-CoM in M. acetivorans? 120 4.7 Woher kommt CH3-S-CoM in MKOmtrSF? 122 4.8 Benötigt M. acetivorans für die Azetogenese Elektronentransport über die Membran? 123 4.9 Nichtmethanogenes Wachstum von M. acetivorans 127 4.10 Warum findet sich bisher kein ausschließlich mit Azetogenese wachsendes Archaeon? 128 4.11 Anwendungsmöglichkeiten für ein azetogenes Archaeon 132 Kurzfassung 137 Literaturverzeichnis 138 Anhang 154 Lebenslauf & Publikationen 163 Danksagung 164 Erklärung 165