• Refine Query
  • Source
  • Publication year
  • to
  • Language
  • 22
  • 5
  • 3
  • 3
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • Tagged with
  • 60
  • 60
  • 31
  • 7
  • 7
  • 7
  • 6
  • 6
  • 5
  • 5
  • 5
  • 5
  • 5
  • 5
  • 4
  • About
  • The Global ETD Search service is a free service for researchers to find electronic theses and dissertations. This service is provided by the Networked Digital Library of Theses and Dissertations.
    Our metadata is collected from universities around the world. If you manage a university/consortium/country archive and want to be added, details can be found on the NDLTD website.
11

Tyrosine Kinase and Protein Kinase A Modulation of α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Function on Layer 1 Cortical Interneurons

Komal, Pragya 18 December 2014 (has links)
Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are a major class of ligand-gated ion channels in the brain, with the α7 subtype of nAChRs playing an important role in attention, working memory and synaptic plasticity. Alterations in expression of α7 nAChRs are observed in neurological disorders including schizophrenia and Alzheimer’s disease. Therefore, understanding the fundamentals of how α7 nAChRs are regulated will increase our comprehension of how α7 nAChRs influence neuronal excitability, cognition and the pathophysiology of various neurological disorders. The purpose of this thesis was to investigate how protein kinases modulate the function and trafficking of α7 nAChRs in CNS neurons. In chapter 2, I describe a novel fast agonist applicator that I developed to reliably elicit α7 nAChR currents in both brain slices and cultured cells. In chapter 3, I examined whether an immune protein in the brain, the T-cell receptor (TCR), can modulate α7 nAChR activity. Activation of TCRs decreased α7 nAChR whole-cell recorded currents from layer 1 prefrontal cortical (PFC) neurons. TCR attenuated α7 nAChR currents through the activation of Fyn and Lck tyrosine kinases, which targeted tyrosine 442 in the M3-M4 cytoplasmic loop of α7. The mechanisms of the attenuated α7 current were contributed by a TCR mediated decrease in surface receptor expression and an attenuation of the α7 single-channel conductance. TCR stimulation also resulted in a decrease in neuronal excitability by negatively modulating α7 activity. In chapter 4, I tested whether PKA can modulate α7 nAChR function in CNS neurons. The pharmacological agents PKA agonist 8-Br-cAMP and PKA inhibitor KT-5720, as well as over-expressing dominant negative PKA and the catalytic subunit of PKA, demonstrated that activation of PKA leads to a reduction of α7 nAChR currents in HEK 293T cells and layer 1 cortical interneurons. Serine 365 of the M3-M4 cytoplasmic domain of α7 was necessary for the PKA modulation of α7. The mechanism of down-regulation in α7 receptor function was due to decreased surface receptor expression but not alterations in single-channel conductance nor gating kinetics. The results of this thesis demonstrate that α7 nAChRs constitute a major substrate for modulation via TCR activated tyrosine kinases and the cyclic AMP/PKA pathway. / Graduate / kpragya2000504@gmail.com
12

Σχεδιασμός, έκφραση και χαρακτηρισμός τμημάτων των α7 και α9 νικοτινικών υποδοχέων, κατάλληλων για δομικές μελέτες

Ζαρκάδας, Ελευθέριος 02 April 2014 (has links)
Οι α7 και α9 υπομονάδες των νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι οι μόνες, ανάμεσα σε μια μεγάλη ποικιλία υπομονάδων του ανθρώπινου nAChR, που σχηματίζουν ομοπενταμερείς υποδοχείς. Για την θεραπεία διαφόρων νευρολογικών διαταραχών αλλά και άλλων ασθενειών, όπου εμπλέκονται οι α7 και α9 nAChRs, απαιτούνται φαρμακευτικές ουσίες που θα στοχεύουν ειδικά σε έναν υπότυπο των nAChRs. Για τον σχεδιασμό τέτοιων φαρμάκων είναι ουσιώδης η διαλεύκανση σε ατομικό επίπεδο της δομής του nAChR. Εντούτοις, η κρυστάλλωση ολόκληρων των διαμεμβρανικών υποδοχέων, αλλά ακόμη και η έκφραση και απομόνωσή τους, σε βαθμό που να επιτρέπει δομικές μελέτες, έχει αποδειχθεί δύσκολος στόχος. Η δυσκολία έγκειται κυρίως στην παρουσία υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών και στην μεγάλη ενδοκυττάρια περιοχή που θεωρείται ευκίνητη και ότι δεν έχει σταθερή διαμόρφωση. Στο πλαίσιο αυτό, στοχεύσαμε στην παραγωγή τμημάτων των α7 και α9 υπομονάδων του nAChR, που να είναι κατάλληλα για αναλυτικές δομικές μελέτες, σχεδιάζοντας κατασκευές για την έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των δύο υπομονάδων ή και κολοβών διαμεμβρανικών μορφών της α7 υπομονάδας. Σε αυτές έχουν απαλειφθεί είτε τμήματα της μεγάλης ενδοκυτταρικής περιοχής, είτε ολόκληρη αυτή η περιοχή και μεγάλα τμήματα της διαμεμβρανικής περιοχής. Στο παρελθόν, είχε εκφραστεί η α7-ΕΚΠ στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης Pichia pastoris και είχε οδηγήσει σε συσσωματώματα μεγάλου μοριακού βάρους, ενώ η έκφραση ενός μεταλλάγματος της α7-ΕΚΠ έδειξε σημαντική βελτίωση της υδροφιλικότητας του μορίου και σχηματισμό ολιγομερών κυρίως πενταμερών μορίων (Zouridakis et al. 2009). Σε αυτήν την εργασία, έχουμε επιτύχει να απομονώσουμε τα σχηματιζόμενα πενταμερή μόρια αυτού του μεταλλάγματος, εκμεταλλευόμενοι την ιδιότητα τους να εκλούονται σε μεγάλο εύρος συγκέντρωσης ιμιδαζολίου, κατά την χρωματογραφία συγγένειας. Ακόμη, η ενζυμική απογλυκοζυλίωση του μεταλλάγματος αυτού, βοήθησε στην περαιτέρω μείωση της ετερογένειας των απομονωμένων πενταμερών μορίων. Αν και ο αρχικός έλεγχος συνθηκών κρυστάλλωσης των γλυκοζυλιωμένων πενταμερών μορίων οδήγησε στον σχηματισμό μικροκρυστάλλων, δεν στάθηκε δυνατή η βελτιστοποίηση της ανάπτυξής τους. Η έκφραση της αγρίου τύπου εξωκυτταρικής περιοχής της α9 υπομονάδας του ανθρώπινου nAChR (α9wt) στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης P. pastoris, οδήγησε στην παραγωγή κυρίως μονομερών μορίων που διαχωρίζονται εύκολα από τα σχηματιζόμενα ολιγομερή. Η μονομερής μορφή της α9wt έδειξε αξιοσημείωτη διαλυτότητα, σταθερότητα και ομοιογένεια καθώς και ικανότητα πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης, έναν ειδικό ανταγωνιστή του μυικού και των ομοπενταμερών νευρικών nAChRs. Προκειμένου να υποβοηθηθεί η συναρμολόγηση των εκφραζόμενων α7 και α9 ΕΚΠ προς τον σχηματισμό πενταμερών μορίων, σχεδιάσαμε μεταλλάξεις που στηρίχθηκαν σε τρισδιάστατα μοντέλα ομολογίας (3D homology modelling) αυτών, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο την κρυσταλλική δομή της ομόλογης, διαλυτής πρωτεΐνης δεσμεύσεως της ακετυλοχολίνης (AChBP) από το μαλάκιο Lymnaea stagnalis. Οι μεταλλαγές αυτές έγιναν είτε σε υδρόφοβα επιφανειακά αμινοξικά κατάλοιπα, με στόχο να αυξήσουμε την υδροφιλικότητα του μορίου, είτε σε κατάλοιπα που εντοπίζονται στις διεπιφάνειες μεταξύ δύο πρωτομερών, ώστε να ενισχύσουμε τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις και να υποβοηθήσουμε την συναρμολόγηση τους προς πενταμερή μόρια. Τα προκύπτοντα μεταλλάγματα έχουν ταύτιση αμινοξικής αλληλουχίας 70-95% με την αντίστοιχη του αγρίου τύπου και σε ορισμένες περιπτώσεις η έκφρασή τους στην P. pastoris οδήγησε στον σχηματισμό αλλά και την απομόνωση πενταμερών μορίων. Η σάρωση των μεταλλαγμάτων απέτυχε στην ανεύρεση κάποιας συνθήκης κρυστάλλωσής τους. Ωστόσο, ο αρχικός έλεγχος συνθηκών κρυστάλλωσης των μονομερών μορίων της α9wt είχε ως αποτέλεσμα τον προσδιορισμό διαφορετικών συνθηκών όπου σχηματίζονται πολλαπλοί κρύσταλλοι, τόσο για την γλυκοζυλιωμένη, όσο και την απογλυκοζυλιωμένη μορφή της. Επιπλέον, η βελτιστοποίηση αυτών των κρυστάλλων στην περίπτωση της γλυκοπρωτεΐνης, οδήγησε στο σχηματισμό μονοκρυστάλλων, που περιθλούν ακτίνες-Χ σε ικανοποιητική ανάλυση, καθιστώντας αυτούς τους κρυστάλλους ως υποσχόμενο υλικό για την επίλυση της δομής της άγριου τύπου α9 ΕΚΠ. Τέλος, η έκφραση στην κυτταρική σειρά εντόμων Sf9 με το σύστημα των βακιλοϊών της ολόκληρης α7 υπομονάδας του nAChR και των «κολοβών» διαμεμβρανικών μορφών της οδήγησε στην ορθή στόχευση των σχηματιζόμενων υποδοχέων στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, ενώ οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες προσεγγίζουν αυτές του φυσικού α7 υποδοχέα. Παρά το γεγονός ότι η έκφραση των κατασκευών αυτών είχε χαμηλή απόδοση και παρά τις δυσκολίες διαλυτοποίησης και απομόνωσής τους, ανάλυση με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, για τουλάχιστον δύο από τα διαμεμβρανικά μεταλλάγματα, δείχνει ότι οι διαλυτοποιημένες πρωτεΐνες έχουν σχηματίσει έναν πληθυσμό ολιγομερών της πρωτεΐνης ο οποίος πιθανότατα αντιστοιχεί σε πενταμερή μόρια. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με την απουσία της εύκαμπτης ενδοκυττάριας περιοχής, καθιστούν αυτά τα α7 μεταλλάγματα, εφόσον ξεπεραστούν οι δυσκολίες της απόδοσης της έκφρασης και της απομόνωσης τους, κατάλληλα για λειτουργικές και δομικές μελέτες. / The neuronal α7 and α9 subunits of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) are the only amongst the known human nAChR subunits to form homopentamers, with five cholinergic ligand-binding sites. Elucidation of their crystal structure is essential in order to design highly specific drugs for treatment of several neurological diseases and disorders related to them and will serve as the prototype for understanding the structure of all other members of the ligandgated ion channel superfamily. Crystallisation of the intact receptors is a difficult task to fulfil, partially due to their hydrophobic transmembrane regions. Therefore, we aim at the expression of crystallisable human α7 and α9 extracellular domains (ECDs) or truncated α7 forms lacking either only their large and probably unordered intracellular domain or large parts of its transmembrane domain. Regarding the α7 ECD, expression of the wild type form in yeast Pichia pastoris led into formation of aggregates (Avramopoulou et al. 2004). Yet, a previously described mutant of this ECD (α7m10, Zouridakis et al. 2009) succeeded in the formation of oligomers, mostly corresponding to pentamers, due to improved solubility and subunit assembly of this mutant. In this study, we managed to isolate apparently pentameric assemblies of the various expressed oligomeric states, by optimizing its first-step purification procedure (metal affinity chromatography), using a narrow stepwise increase of imidazole concentrations. In order to further improve the protein homogeneity, we proceeded to the isolation of its deglycosylated pentameric form. The relatively low polydispersity of both the glycosylated and deglycosylated α7m10 ECDs, allowed for crystallization trials, which have resulted in microcrystallic formations. Further optimization of these microcrystals failed. As to the α9 ECD, expression of the wild type form in yeast Pichia pastoris led to the formation of both monomers and a variety of oligomers. The monomeric α9 ECD showed significant monodispersity, solubility and stability and exhibited binding ability of α- bungarotoxin, a specific nAChR antagonist. In order to facilitate the pentameric assembly and enhance the solubility of these α7 and α9 ECDs, we designed several mutants based on generated 3D homology models, using as template the crystal structure of the homologous soluble molluscan acetylcholine binding protein (AChBP). Several solvent accessible hydrophobic residues were replaced with more hydrophilic ones and some interface-located residues were mutated so as to facilitate the formation of additional inter-subunit interactions. The resulting mutants shared moderate and considerably high sequence identities (70-95%) with the wild type ECDs and in some cases, formation of pentamers was accomplished. Crystallisation screening for mutant ECDs failed in producing any hit. However, the pilot crystallisation trials of monomeric wild-type α9 ECD resulted the formation of plate-like multi crystals for both its glycosylated and deglycosylated forms. Further optimisation of these crystals succeeded in producing single crystals of the glycoprotein, to produce single crystals, which diffracted X-rays to satisfactory resolution, in a home source X-ray generator. Therefore, these crystals seem to be a promising material for solving the wild type α9 ECD structure. The intact and truncated α7 nAChRs under study were expressed in the Sf9/baculovirus system and showed surface receptor expression, while presenting near-native ligand-binding affinities for characteristic nAChR agonists and antagonists. Despite the low expression yield and solubilisation and purification difficulties, gel filtration analysis for at least two truncated mutants revealed the presence of a monodispersed oligomeric population, probably corresponding to pentamers. All these, taken together with the lack of the flexible large intracellular domain, render these α7 mutants, after overcoming the expression yield and purification difficulties, a suitable material for performing both functional and structural studies.
13

Adrenergic and cholinergic mechanisms in the liver microcirculation inthe rat

Liang, Yee-shan, Isabella, 梁以珊 January 1979 (has links)
published_or_final_version / Physiology / Doctoral / Doctor of Philosophy
14

α7 nicotinic acetylcholine receptors at the glutamatergic synapse

Hammond, Victoria January 2014 (has links)
Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) activation is neuroprotective and nicotine is a cognitive enhancer. Loss of nAChRs, deposition of tau neurofibrillary tangles, cleavage of amyloid precursor protein (APP) and inflammation are well documented in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Sequential cleavage of APP by β- and γ-secretase enzymes generates soluble Aβ peptides, with oligomeric forms of Aβ implicated in both the control of synaptic excitability and dysregulation of synaptic transmission and induction of neuronal death in AD. Aβ production is inhibited by calcium-dependent recruitment of α-secretase, as exemplified by activation of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR). All neurodegenerative diseases are associated with inflammation, arising from altered homeostasis of the innate immune system, resulting in heightened activation of immune cells and induction of a pro-inflammatory environment. Stimulation of the α7 subtype of nAChR is anti-inflammatory and also enhances cognition and promotes neuronal survival. This work addressed the hypotheses that stimulation of highly calcium-permeable α7nAChR inhibits Aβ production by promoting α-secretase-mediated processing of APP and also modulates inflammatory cellular behaviour of microglia. Thus, this study assessed the role of α7nAChR at glutamatergic synapses, through probing effects on APP processing and phagocytosis in primary cortical neurons and microglia, respectively. Primary cortical neurons expressed functional α7nAChR and glutamate receptors, and through a number of experimental approaches, including immunoblotting and a cleavage reporter assay, results indicated α7nAChR activation with the α7nAChR-selective agonist PNU-282987 and positive allosteric modulator PNU-120596 had no effect on APP and Tau, in contrast to NMDAR activation that significantly modulated these proteins. Data suggest low expression of α7nAChR, coupled with distinct localisation of presynaptic α7nAChR and postsynaptic APP could explain the lack of effect. In addition, primary microglia were highly responsive to lipopolysaccharide and possessed functional α7nAChR that coupled to ERK phosphorylation. Microglial α7nAChR activation promoted neuroprotective phagocytic behaviour, in agreement with the ‘cholinergic anti-inflammatory pathway’. This study supports the hypothesis that α7nAChR are modulators of anti-inflammatory behaviour, thus α7nAChR-selective ligands are viable candidates for the treatment of AD and promoting cognitive enhancement.
15

Intracellular signals underlying the inductive effects of agrin during neuromuscular junction formation : study on the roles of ras and Shc

Lemaire, Mathieu. January 2000 (has links)
Agrin triggers the subsynaptic aggregation of acetylcholine receptor (AChR) via activation of the receptor tyrosine kinase MuSK (muscle-specific kinase). At present, the intracellular mechanisms utilized by MuSK to initiate such a complex process remain unknown. In the present study, I first tested if H-ras was involved in the process of synaptogenesis induced by agrin. The data presented suggest that ras could have a role in this process because a dominant inhibitory ras mutant (ras-N17) partially blocked the inductive effects of agrin while two activated ras mutants (ras-V12 and ras-V12-D38) induced agrin-independent AChR clusters. These effects were not due to major alterations in the levels of AChR, though more experiments are required to confirm these preliminary findings. / Second, I investigated whether the adaptor protein Shc was a downstream effector of activated MuSK. MuSK and Shc could be co-immunoprecipitated, but this association was not consistently observed nor was it modulated by agrin at all times. Generally, no alteration in Shc phosphotyrosine content was observed in response to agrin, and when an increase was detected, it was modest. Finally, agrin did not modulate the interaction between Shc and Grb2. Based on these results, I conclude that Shc interaction with MuSK is not regulated by agrin.
16

Έκφραση, απομόνωση και χαρακτηρισμός της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης

Γεωργοστάθη, Ασημίνα 20 October 2010 (has links)
Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs), μέλη της υπερ-οικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων ιοντικών καναλιών (LGICs), είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, διακρίνονται σε μυϊκού και νευρικού τύπου υποδοχείς. Οι μυϊκού τύπου nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα των ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις των σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μύες. Αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες που σχηματίζουν ένα κανάλι, με στοιχειομετρία (α1)2βγδ στα έμβρυα ή (α1)2βεδ στους ενήλικες. Κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (α) ένα αμινο-τελικό εξωκυτταρικό τμήμα (ECD) μήκους ~210–220 αμινοξέων (β) τέσσερις μικρές (15–20 αμινοξέα μήκος η καθεμιά) υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (M1–M4) και δύο μικρές υδρόφοβες θηλιές, μεταξύ των M1–M2 και M2–M3 (γ) μια υδρόφιλη κυταρροπλασματική θηλιά που ποικίλει σε μέγεθος (100–150 κατάλοιπα) και αμινοξική σύσταση μεταξύ των υπομονάδων, ανάμεσα στην Μ3 και Μ4 περιοχή, και (δ) ένα μικρό (4–28 αμινοξέα) υδρόφιλο καρβοξυ-τελικό άκρο εξωκυτταρικά. Οι μυϊκού τύπου nAChRs εκτός από την φυσιολογική τους δράση εμπλέκονται και στην αυτοάνοση νόσο μυασθένεια (myasthenia gravis-MG). Τα αυτοαντισώματα των μυασθενικών προσδένονται στην εξωκυτταρική περιοχή του AChR και η πλειοψηφία τους φαίνεται να στοχεύει την α1 υπομονάδα και συγκεκριμένα την κύρια ανοσογόνο περιοχή της-MIR. Επιπλέον, στην εξωκυτταρική περιοχή της α1 υπομονάδας εντοπίζεται και η περιοχή που συμμετέχει στον σχηματισμό της θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και άλλων χολινεργικών προσδετών. Το α1 ECD του ανθρώπινου nAChRs έχει ήδη εκφραστεί, απομονωθεί και χαρακτηριστεί από υπερκείμενο καλλιέργειας του ζυμομύκητα Pichia pastoris ως μονομερές, υδατοδιαλυτό και λειτουργικό πρωτεϊνικό μόριο. Η ικανότητά του να προσδένει αντι-AChR αυτοαντισώματα βρέθηκε μέτρια, και για τον λόγο αυτό στην παρούσα εργασία εκφράστηκε σε ένα ανώτερο εξελικτικά σύστημα από αυτό του Pichia pastoris, με σκοπό την έκφραση μορίων με καλύτερη αναδίπλωση, που να προσομοιάζουν περισσότερο με την φυσική τους διαμόρφωση, καθώς επίσης και την παραγωγή ικανοποιητικής ποσότητας πρωτεΐνης, ώστε να είναι εφικτή η δομική της μελέτη. Ως ετερόλογο σύστημα έκφρασης, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα εντόμων του είδους Trichoplusia ni (High Five), τα οποία ήταν σταθερά μετασχηματισμένα ως προς το ανασυνδιασμένο α1 ECD πολυπεπτίδιο. Αναλυτικότερα, το ECD της α1 υπομονάδας εκφράστηκε στα δύο συστήματα και στην συνέχεια καθαρίστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακής διήθησης. Το High Five α1 ECD εκφράστηκε ως υδατοδιαλυτό μόριο σε ικανοποιητική ποσότητα ενώ η χρωματογραφία μοριακής διήθησης και οι μελέτες δυναμικής σκέδασης του φωτός έδειξαν επιπλέον πως εκφράζεται ως μονομερές. Ορισμένοι χολινεργικοί προσδέτες προσδένονται στο High Five α1 ECD, επιβεβαιώνοντας πως η διαμόρφωσή του προσομοιάζει με του ανθρώπινου nAChR. Με πειράματα ELISA και ραδιοανοσολογικού προσδιορισμού, προέκυψε πως το High Five α1 ECD δεσμεύει μεγαλύτερο ποσοστό αντι-nAChR μονοκλωνικών αντισωμάτων και αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενικών, συγκριτικά με το Pichia pastoris α1 ECD. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, το ανασυνδυασμένο α1 ECD του ανθρώπινου nAChR, εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων High Five, προσομοιάζει περισσότερο με την φυσική διαμόρφωση του nAChR. Επιπλέον, το ετερόλογο σύστημα έκφρασης των High Five κυττάρων είναι αποδοτικά καλύτερο σε σύγκριση με αυτό του ζυμομύκητα Pichia pastoris. Αυτό, καθιστά το High Five α1 ECD καταλληλότερο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, που θα βοηθήσουν στην επίλυση της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα, αλλά και για την ανάπτυξη μιας ειδικής αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), members of the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), are transmembrane glycoproteins (Mr ~290 kDa). According to their topology and their pharmacological properties, nAChRs are divided into muscle-type and neuronal-type nAChRs. The muscle-type AChRs are located in fish electric organs as well as in the neuromuscular junction, where they transmit electrical signals from the nervous system to the vertebrate skeletal muscles. They consist of five homologous subunits forming a channel with stoichiometry (α1)2βγδ in embryos or (α1)2βεδ in adults. A nAChR subunit consists of: (a) a N-terminal extracellular domain (ECD) which is ~210–220 amino acids long; (b) four short (15–20 amino acids long) hydrophobic transmembrane segments (M1–M4) and two small hydrophilic loops, linking segments M1–M2 and M2–M3; (c) a hydrophilic cytoplasmic loop varying in size (100–150 residues) and sequence among different type of subunits, which located between M3 and M4 segment, and (d) a C-terminal short (4–28 amino acids) hydrophilic extracellular segment end. Muscle type nAChRs are also involved in the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). Αutoantibodies in MG bind to the extracellular domain of the AChR and their majority target the α1 subunit and more specific the major immunogenic region (MIR). Moreover, the ECD of the α1 subunit bears the binding sites for acetylcholine and other cholinergic ligands. The human nAChR α1 subunit ECD has been expressed, isolated and characterized in the yeast Pichia pastoris as a monomer, water-soluble and functional molecule, with a medium ability to bind antibodies against AChR. In this project, the human nAChR α1 subunit ECD was expressed in an evolutionary higher protein expression system compared to Pichia pastoris system, in order to express molecules with better conformation, close to that of the native protein and to produce considerable amounts of protein for structural studies. In more details, we have used insect cells from the species Trichoplusia ni (High Five), which were stably transformed with the α1 ECD polypeptide. The α1 ECD of the human muscle nAChR, was expressed in both systems and was isolated and purified by affinity chromatography and fast protein liquid chromatography analysis (FPLC). The recombinant High Five α1 ECD was expressed as a water-soluble molecule in sufficient quantities. FPLC and dynamic light scattering analysis determined it to be monomer. Several cholinergic ligands were found to bind to High Five α1 human ECD confirming the native-like conformation of the protein. High Five α1 ECD was subsequently found to bind better conformation-dependent anti-nAChR mAbs than the Pichia pastoris α1 human ECD, as determined by ELISA and radioimmunoassay analysis. The binding of High Five α1 human ECD to anti-nAChR autoantibodies from MG patients, was also found to be better than the Pastoris pastoris α1 human ECD. These results indicate that the recombinant α1 human ECD, expressed in High Five cells, has a more native-like conformation than Pichia pastoris α1 ECD, being suitable for high resolution structural studies, in order to reveal the structure of the human nAChR and for the development of an antigen specific therapy for MG.
17

THE MECHANISMS AND PHARMACOLOGY OF NEURONAL NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTORS IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

Kalappa, Bopanna Iythichanda 01 May 2012 (has links)
Neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are key players in both cognitive and autonomic processes. In the cognitive domains of the brain, destruction of cholinergic inputs or disruption of nAChR function result in cognitive deficits as observed in Alzheimer's disease, schizophrenia, brain trauma and aging. By contrast, moderate activation of nAChRs supports neuroprotection and improves cognitive functions. In addition, neuronal nAChRs are also expressed in important autonomic centers such as the nucleus of the solitary tract (NTS) and the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV) that support autonomic visceral reflexes and homeostasis. In this study, the underlying mechanisms of nAChR activation and its pharmacology were investigated in the hippocampus and the NTS, critical brain regions supporting cognitive and autonomic functions, respectively. Specific Aim 1 of this study was to determine the capacity of physiological levels of choline to activate α7 nAChRs in hippocampal CA1 pyramidal neurons and interneurons. A weak persistent activation of α7 nAChRs can be neuroprotective. These levels of activation can be achieved by selective or non-selective α7 nAChR agonists or inhibitors of ACh esterase (AChEI). However, nicotinic agonists desensitize α7 nAChRs while AChEI produces side effects limiting their overall clinical and pre-clinical effectiveness. These limitations can be avoided by using a novel class of drugs; type-II positive allosteric modulators of α7 nAChRs (α7-PAMs) such as PNU-120596 (i.e., PNU). At physiological levels, choline alone is ineffective as an α7 agonist because of its low concentration in the cerebrospinal fluid (~10 µM) and low potency for α7 activation (EC50~1.5 mM). However, the results pertaining to Specific Aim 1 demonstrate that in the presence of PNU (1-5 µM) , 10 µM choline produces persistent α7 activation expressed on CA1 pyramidal and interneurons which may be fine-tuned to achieve optimal neuroprotection and cognitive benefits. Specific Aim 2 was to test the novel concept that PNU mediated changes in α7 receptor kinetics can alter the biophysical properties of α7 channel-drug interactions and thereby increase the probability and the apparent affinity of open channel block. The results of this study suggest that the compounds (e.g., Bicuculline) that do not potently interact with α7 ion channels in the absence of PNU begin to interact potently in its presence. These emergent properties of α7 channel-drug interactions in the presence of PNU need to be recognized in drug development as they may lead to unanticipated side effects and serious misinterpretation of data. Specific Aim 3 investigated the pharmacology and mechanisms of action of pre-synaptic non-α7 and α7 nAChRs in the caudal NTS neurons. Although, activation of nAChRs is known to enhance pre-synaptic release of glutamate in subsets of caudal NTS neurons, its mechanism of action has been elusive. However, the results from this study demonstrated that nicotine-mediated enhancement of glutamate release requires Ca2+ influx via nAChRs but does not require any contribution from voltage-gated Ca2+ ion channels (VGCCs) and presynaptic Ca2+ stores. Moreover, both functional α7 and non-α7 nAChRs were found to contribute to the presynaptic effects of nicotine in subsets of NTS neurons. However, co-expression of α7 and non-α7 nAChRs on the same glutamatergic presynaptic terminals was not detected. Collectively, these studies may help in developing new therapeutic strategies to selectively target nAChR-associated pathways that support cognitive and autonomic functions in health and disease.
18

The uptake of drugs in relation to their action on tissues

Rang, H. P. January 1964 (has links)
No description available.
19

Intracellular signals underlying the inductive effects of agrin during neuromuscular junction formation : study on the roles of ras and Shc

Lemaire, Mathieu. January 2000 (has links)
No description available.
20

Functional properties of the noradrenergic and cholinergic nervous systems in rat colonic mucosa /

Wu, Ze-Ai Chang January 1981 (has links)
No description available.

Page generated in 0.0801 seconds