Orientador: Lauro Tatsuo Kubota / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T12:04:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palermo_LarissaTrombetta_M.pdf: 624816 bytes, checksum: 9227a24ded626786ef64b5defeb77d15 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O presente trabalho trata da aplicação da fluorescência molecular e de métodos de calibração multivariados, na modalidade PLS-1, para a determinação simultânea de uma mistura dos ácidos cafêico (CA) e clorogênico (CGA), tanto em amostras sintéticas quanto em amostras reais, provenientes de extratos vegetais aquosos da planta Ilex paraguariensis, aproveitando-se o fato de que ambos os compostos apresentam fluorescência intrínseca. O método desenvolvido não requer reagente, sendo apenas necessário o uso de água aquecida para a etapa de extração. Para tanto, planejamentos fatoriais 2 foram aplicados no sentido de se determinar as condições ótimas para a obtenção da maior sensibilidade, analisando para isso os efeitos principais e a presença de fatores de interação. Esse estudo foi feito para cada um dos ácidos separadamente. Foram feitos dois tipos de planejamentos: um relacionado às variáveis instrumentais e outro sobre as variáveis relacionadas à condição da amostra. Porém, a escolha dos níveis e dos fatores a serem utilizados foi feita a partir de experimentos preliminares, observando-se o efeito de nove variáveis sobre o comportamento de emissão de fluorescência, para cada um dos ácidos. As melhores condições de análise permitiram a obtenção de uma resposta linear para CA na faixa de 0,08-11,1 mmol L, a 284 nm de excitação, com limite de detecção (LD) equivalente a 0,02 mmol L e limite de quantificação (LQ) de 0,07 mmol L (r=0,9972, n=7). Para o CGA a faixa linear foi de 0,3-8,5 mmol L, a 330 nm de excitação, com LD=0,07 mmol L e LQ=0,2 mmol L (r=0,9959, n=8). A etapa seguinte consistiu na construção do modelo de calibração para a mistura, utilizando-se diferentes proporções de CA e CGA (1:7,5; 1:9,5; 1:11,5; 1:13,5; 1:17,5). Os espectros das amostras foram obtidos a 284 nm, e a faixa espectral de 380-500 nm foi decomposta utilizando-se PLS-1. Os dados foram centrados na média, utilizando-se validação cruzada, sem transformação derivativa. O número ótimo de componentes principais encontrados foi de 3 (CA) e 5 (CGA), sendo que 48 amostras foram usadas no conjunto de calibração, e 12 amostras no de validação externa. As concentrações previstas e reais apresentaram-se satisfatoriamente correlacionadas (r=0,990007 e 0,997176 para os modelos do CA e CGA), e para ambos os modelos o desempenho da previsão foi avaliado em termos do coeficiente de variabilidade (CV). A quantificação dos ácidos na amostra comercial foi feita utilizando-se os modelos finais obtidos por PLS-1, sendo validada através da adição de padrão, com boas recuperações obtidas (94±5 % e 104±3 %, para CA e CGA, respectivamente) / Abstract: The present work concerns the application of molecular fluorescence and multivariate calibration method, in the PLS-1 modality, for the simultaneous determination of caffeic (CA) and chlorogenic (CGA) acids in synthetic samples and in real samples of aqueous vegetable extracts of Ilex paraguariensis, using the intrinsic fluorescence of both compounds. The developed method just need the use of warm water for the extraction stage and no chemical is required. A factorial design 2 was applied to get the optimized conditions looking for the largest sensitivity, evaluating the main effects and the presence of interaction factors. This study was performed for each one of the analyte separately. They were performed two types of design: one related to the instrumental variables and other on the variables related to the sample condition. However, the choice of the levels and the factors was based on the preliminary experiments, being observed the effect of nine variables on the behavior of fluorescence emission. The optimized conditions allowed to obtain a linear response for CA in the range of 0.08-11.1 mmol L, using a wavelength of 284 nm for excitation, with a detection limit (LD) equivalent to 0.02 mmol L and quantification limit (LQ) of 0.07 mmol L (r=0.9972, n=7). For CGA the linear response range was 0.3-8.5 mmol L, excitation at a wavelength of 330 nm, with a LD=0.07 mmol L and LQ=0.2 mmol L (r=0.9959, n=8). The construction of the calibration model for the rnixture was consisted in different proportions of CA and CGA (1:7.5; 1:9.5; 1:11.5; 1:13.5; 1:17.5). The spectra of the samples were obtained exciting at 284 nm, and recording the spectral range of 380-500 nm. The data were decomposed using PLS-1. The data set was mean centered, being used the cross validation, without derivative transformation. The optimum number of factors was found as 3 (CA) and 5 (CGA), and 48 samples were used in the calibration set, and 12 samples in one validation group. A satisfactory agreement between predicted and experimental concentrations was obtained (r=0.990007 and 0.997176 for the models of CA and CGA), and for both models the prediction performance was evaluated in terms of the variability coefficient (CV). The acids quantification in the commercial sample was carried out using the final models obtained by PLS-1, being validated through the standard addition, with good recoveries (94±5 % and 104±3 %, for CA and CGA, respectively) / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Orientador: Adriana Zerlotti Mercadante / Texto em português e Inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:11:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_Eliseu_D.pdf: 6784010 bytes, checksum: 5c87585adb4a85d2dd85217c8fee7430 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Neste trabalho foi avaliada a capacidade antioxidante de carotenoides em sistema homogêneo e em lipossomas, de carotenoides microencapsulados e de extratos de maná-cubiu (Solanum sessiflorum) frente às espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) de importância biológica. Devido à insolubilidade de carotenoides em solução tampão, utilizada como meio de reação no conhecido método oxygen radical absorbance capacity (ORAC), foi desenvolvido também um novo método para determinar a capacidade de carotenoides de desativarem o radical peroxila (ROO). Em geral, as microcápsulas de goma arábica e de maltodextrina (20 DE) contendo compostos antioxidantes (trolox, -tocoferol, ß-caroteno, apo-8¿-carotenal e apo-12¿-carotenal) foram capazes de desativar as ROS e RNS, sendo a eficiência de desativação influenciada pelo material de parede, pela espécie reativa (ROO, peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (HO), ácido hipocloroso (HOCl) e ânion peroxinitrito (ONOO-) e pela estrutura do composto antioxidante. Interessantemente, as microcápsulas vazias também foram capazes de desativar as ROS e RNS, sendo as de goma arábica mais eficazes que as de maltodextrina. A incorporação de apo-8¿-carotenal promoveu o maior aumento na capacidade das microcápsulas de desativarem ROS e RNS, variando de 50% a 132% e de 39% a 85% para goma arábica e maltodextrina, respectivamente. Este fato sugere que o apo-8¿-carotenal apresenta o melhor balanço entre a sua localização no interior das microcápsulas e a reatividade frente às espécies reativas. A localização também foi um fator importante na eficiência dos carotenoides desativarem ROS e RNS em lipossomas. Neste sistema, os carotenoides com grupos hidroxila foram geralmente mais potentes na desativação do ROO, HO e HOCl que carotenos, com destaque para a astaxantina, enquanto o ß-caroteno foi mais eficiente na desativação do ONOO-. Para o estudo dos carotenoides em sistema homogêneo foi desenvolvido e validado com sucesso um novo método para avaliação da capacidade de carotenoides de desativarem o ROO, o qual é baseado na perda de fluorescência da sonda ácido 4,4-difluoro-5-(4-fenil-1,3-butadienil)-4-bora-3a,4a-diazo-s-indaceno-3-undecanoico (C11-BODIPY581/591) devido à oxidação pelo ROO, que é gerado pela termodecomposição do azobisisobutironitrila (AIBN). A aplicação deste novo método permitiu o estudo da relação entre a estrutura química de diferentes carotenoides e a capacidade de desativar o ROO. Foi demonstrado que neste sistema os carotenoides são potentes desativadores desta espécie reativa, sendo a eficiência influenciada principalmente pela abertura do anel -ionona e pela extensão do cromóforo. O licopeno foi o mais potente desativador de ROO (8,67 0,74), porém não tão eficiente quanto os carotenoides do maná-cubiu (9,80 0,80). Os compostos bioativos de maná-cubiu foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada aos detectores de arranjo de diodos e espectrômetro de massas (HPLC-DAD-MS/MS). Esta fruta apresentou -caroteno (7,15 g/g) e luteína (2,41 g/g) como carotenoides majoritários. Por fim, o extrato fenólico de maná-cubiu, contendo o ácido 5-cafeoilquínico (1298 g/g) como composto fenólico principal, apresentou grande eficiência em desativar o H2O2 (IC50 = 305 17 g/mL) e o HOCl (IC50 = 13 0,8 g/mL). Os resultados do presente estudo mostram que os carotenoides foram capazes de desativar todas as ROS e RNS de relevância biológica avaliadas neste trabalho, sendo a eficiência de desativação influenciada pela concentração e estrutura química do carotenoide, pelo nível de organização do sistema (homogêneo ou multifásico) e pelo tipo de espécie reativa / Abstract: In the present study, the antioxidant capacity of carotenoids in homogeneous system and in liposomes, of microencapsulated carotenoids and of extracts from mana-cubiu (Solanum sessiflorum) were evaluated against reactive oxygen (ROS) and reactive nitrogen (RNS) species of biological relevance. Due to the insolubility of carotenoids in aqueous buffers, which is used as reaction medium in the well known oxygen radical absorbance capacity method (ORAC), a novel method was also developed to determine the peroxyl radicals (ROO) scavenging capacity of carotenoids. In general, the gum arabic and maltodextrin (20 DE) microcapsules containing antioxidant compounds (trolox, -tocopherol, ß-carotene, apo-8¿-carotenal and apo-12¿-carotenal) were capable to scavenge ROS and RNS. The scavenging efficiency of the microcapsules was influenced by the wall material, the reactive species (ROO, hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (HO), hypochlorous acid (HOCl) and peroxynitrite anion (ONOO-) and the structure of the antioxidant compound. Interestingly, the empty microcapsules were also able to scavenge the ROS and RNS, being the gum arabic microcapsules more efficient than the maltodextrin ones. The incorporation of apo-8¿-carotenal resulted in the largest increase in the microcapsules scavenging capacity, varying from 50% to 132% and from 39% to 85% in the gum Arabic and maltodextrin microcapsules, respectively. These findings suggest that the apo-8¿-carotenal presented the best balance between its location in the microcapsules interior and the reactivity against the reactive species. The location was also an important factor influencing the efficiency of carotenoids to scavenge ROS and RNS in liposomes. In this system, the carotenoids with hydroxyl groups were usually more potent ROO, HO and HOCl scavengers than the carotenes, especially astaxanthin, whilst ß-carotene was the most efficient ONOO- scavenger. To study the carotenoids in homogeneous system, a new ROO scavenging assay, based on the loss of fluorescence of the probe 4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-undecanoic acid (C11-BODIPY581/591) due to its oxidation induced by ROO generated by the thermo decomposition of azobisisobutyronitrile (AIBN), was successfully developed and validated. This new method allowed the establishment of the relationship between the structure of different carotenoids and their ROO scavenging capacity. In this system, carotenoids showed to be potent scavengers of this reactive species, and their scavenging capacity was influenced mainly by the opening of the -ionone ring and by the chromophore extension. Lycopene was the most potent ROO scavenger (8.67 0.74); however, it was not so efficient as the carotenoids from mana-cubiu (9.80 0.80). The bioactive compounds of mana-cubiu were determined by high performance liquid chromatography coupled to diode array and mass spectrometry detectors (HPLC-DAD-MS/MS). The major carotenoids of this fruit were -carotene (7.15 g/g) and lutein (2.41 g/g). Finally, the main phenolic compound found in the phenolic extract from mana-cubiu was 5-caffeoylquinic acid (1298 g/g), which showed to be a good H2O2 (IC50 = 305 17 g/mL) and HOCl (IC50 = 13 0.8 g/mL) scavenger. The results of this thesis showed that the carotenoids are able to scavenge all the evaluated ROS and RNS of biological relevance and that their efficiency depends on the carotenoid structure and concentration, level of organization of the reaction medium (homogeneous or multiphase) and type of reactive species / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Paulo Mazzafera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:18:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_GeraldoAclecio_D.pdf: 1320706 bytes, checksum: 5f501b7dd60a44ae72341950498d75f7 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Polifenoloxidase - PFO (EC 1.14.18.1 ou EC 1.10.3.2) é uma enzima de ampla distribuição entre as plantas e catalisa a hidroxilação de monofenóis a o-difenóis e a oxidação destes para o-diquinonas. Sua função em plantas tem sido relacionada a mecanismos de defesa contra patógenos e pragas. Em cafeeiro, o ácido 5-cafeoilquínico, também conhecido como ácido clorogênico (CGA) é o principal substrato da PFO e ambos, enzima e substrato, estão presentes em quantidades expressivas nos frutos e nas folhas desta planta. O CGA também está relacionado com mecanismos de defesas das plantas e como tal é considerando importante substrato em reações de oxidação, principalmente aquelas mediadas pela PFO. No presente estudo, com objetivo de conhecer características da PFO de folhas do cafeeiro, de averiguar sua ação em mecanismos de defesa nessa planta e de entender fatores ligados à síntese e ao acúmulo de seu principal substrato foram feitas a purificação e caracterização dessa enzima, estudos da expressão de sua atividade, bem como estudos de expressão de enzimas da via de síntese do CGA em cafeeiro. Com o uso de técnicas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de troca iônica, interação hidrofóbica e exclusão molecular foi possível obter a PFO com alto grau de pureza. A enzima apresentou massa molecular de 40,5 Kda e preferência pelo ácido 5-cafeoilquínico como substrato. Seqüências de peptídeos obtidas após digestão da proteína e análise por espectrometria de massas mostraram-se homólogas a seqüências de PFO de várias outras plantas. O nível constitutivo de atividade da PFO observado para quinze genótipos de café variou de 3,8 a 88,0 unidades de atividade/mg de proteína, entretanto não teve relação direta com resistência a pragas e doenças nessa planta. A resistência ao bicho mineiro foi significativamente relacionada ao nível de compostos fenólicos, entretanto, ácido 5-cafeoilquínico, o principal substrato da PFO em café, não teve relação com essa resistência, sugerindo a importância de outros compostos fenólicos como substratos da PFO. Dano mecânico, tratamento com ácido metiljasmônico, inoculação com esporos do fungo Hemileia vastatrix e a infestação com ovos do inseto Perileucoptera coffeella levaram a respostas variadas nos níveis de atividade de PFO nos genótipos avaliados. Baseando-se nesses resultados, conclui-se que a ação da PFO na resistência do cafeeiro a pragas e doenças pode estar relacionada ao potencial oxidativo do tecido e não simplesmente uma maior atividade; que o tipo e quantidade de substrato encontrado no tecido podem ser importantes na resistência do cafeeiro e que entre os genótipos pode existir a especialização de mecanismos de resistência envolvendo a ação da PFO. Estudos de expressão por RT-PCR de fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hiroxilase (C4H), coumarato 3-hidroxilase (C3H), hidroxicinamoil-CoA ligase (4CL) e hidroxicinamoil-CoA:D-quinato hidroxicinamoil transferase (CQT), enzimas da via de síntese do CGA, tiveram sua expressão reduzida à medida que o tecido envelhece. No endosperma foi observado um decréscimo acentuado de expressão no final da maturação dos frutos. Plântulas estioladas obtidas pela germinação de sementes no escuro e transferidas para luz mostraram aumentos significativos no conteúdo de CGA após 24 horas. Esses aumentos foram transientes e coincidiram com a expressão da PAL, C4H, C3H, 4CL e CQT. Os resultados indicam existência de controle da síntese de CGA e a existência de mecanismos de controle da expressão em comum para as cinco enzimas estudadas / Abstract: Polyphenoloxidase - PPO (EC 1.14.18.1 ou EC 1.10.3.2) is an enzyme with broad distribution among plants and catalyzes the hydroxylation of monophenols to o-diphenols and the oxidation of these to o-diquinones. Its function on plants has been related to defense mechanisms against pathogens and plagues. 5-Caffeoylquinic acid, also known as chlorogenic acid (CGA), is the main PPO substrate in coffee tissues and both, enzyme and substrate are present on substantial quantities in fruits and leaves. CGA is also referred to having connection with plants defense mechanisms and it is also an important substrate on oxidation reactions, mainly those mediated by PPO. Therefore, in order to increase our knowledge on the coffee PPO characteristics, to verify its role in defense mechanisms and also to understand the factors connected to the synthesis of CGA, coffee leaf PPO was purified and characterized regarding kinetic parameters and its activity in leaves of several coffee species exposed or not to pest (leaf miner) and disease (leaf rust). Also studies on the expression of the enzymes of CGA synthesis were carried out. By using ammonium sulfate precipitation followed by chromatographic steps on ionic exchange, hydrophobic interaction and molecular exclusion resins it was possible to purify PPO to homogeneity. The enzyme presented a molecular mass of 40,5 Kda and used 5-cafeoylquinic acid as the preferred substrate. Peptide sequences obtained after digestion of the purified PPO and analysis through mass spectrometry were homologous to PPO sequences of several other plants. The constitutive level of PPO activity observed for 15 coffee genotypes varied from 3,8 to 88,0 units of activity/mg of protein, but did not have a direct relationship with resistance to plagues in this plant. Resistance to leaf miner was significantly related to the level of phenolic compounds. However, 5-caffeoylquínic acid, the main substrate of PPO on coffee, was not related with resistance, suggesting the importance of other phenolic compounds as PPO substrates. Mechanical damage, treatment with methyljasmonic acid, inoculation with spores from Hemileia vastatrix and the infestation with the insect Perileucoptera coffeella led to varied results of the PPO activity in the evaluated genotypes. Based on these results, we conclude that the PPO role in the coffee resistance to plagues and diseases might be related to the oxidative potential of the tissue and not only on the PPO activity; that the kind and quantity of PPO substrate found in the tissue might be important for the resistance of the coffee tree and that there may be specific mechanisms of resistance involving PPO action among the genotypes. RT-PCR studies of the expression of phenylalanine ammonia-lyase (PAL), cinnamate 4-hyroxylase (C4H), coumarate 3-hydroxylase (C3H), hydroxycinnamoyl-CoA ligase (4CL) and hydroxycinnamoyl-CoA:D-quinate hydroxycinnamoyl transferase (CQT), which code for enzymes of the CGA biosynthetic pathway, showed that the expression of these enzymes decrease with tissue aging. In the endosperm, an evident decrease on the expression was observed in the end of the fruit ripening. Etiolated seedlings obtained by germination of coffee seeds in the dark and transferred into light showed significant increasing on the CGA content after 24 hours. The increase was transient and followed the expression pattern of PAL, C4H, C3H, 4CL and CQT. The results indicate that CGA biosynthesis is coordinately regulated by the expression of the five enzymes / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal