Actinoplanes sp. ATCC 33002 produziert ein fünffach chloriertes Phenylpyrrolderivat, das Pentachlorpseudilin[1], für dessen Biosynthese die Beteiligung FADH2-abhängiger Halogenasen vermutet wurde. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, in Actinoplanes sp. nach Genen FADH2-abhängiger Halogenasen zu suchen und diese heterolog zu überexprimieren. Durch Hybridisierungsexperimente mit prnC[2] (Halogenasegen aus Pseudo¬monas fluorescens) als Sonde konnten in Actinoplanes sp. ATCC 33002 zwei potentielle Gene FADH2-abhängiger Halogenasen (halA und halB) detektiert werden. Beide Gene weisen hohe Homologien zu Genen bereits bekannter FADH2-abhängiger Halogenasen auf. Die für HalA und HalB abgeleiteten Aminosäuresequenzen weisen die größten Ähnlichkeiten zur Chlortetra¬cyclin¬halogenase (Cts4)[3] aus Streptomyces aureofaciens und zur Halogenase PrnC[2] aus Pseudomonas fluorescens BL915 auf, welche im Bereich von 55 % bis 61 % liegen. HalA und HalB enthalten die in bekannten FADH2-abhängigen Halogenasen konservierten Sequenzmotive: die FADH2-Bindestelle und das Tryptophanmotiv[4]. Während die Überexpression von halA und halB in Escherichia coli zu Inclusionbodies führte, konnte halB in zwei Pseudomonadenstämmen in löslicher Form überexprimiert werden. In P. aureofaciens pCIBhalB wurde halB und in P. fluorescens pCIBhalBhis halBhis überexprimiert. In Enzymaktivitätstests mit verschiedenen Phenylpyrrolderivaten als potentiellen Substraten wurde im HalB enthaltenden Rohextrakt des Expressionsstammes P. aureofaciens pCIBhalB in vitro chlorierende Aktivität nachgewiesen. HalB gehört somit zur Gruppe der FADH2-abhängigen Halogenasen. [1] Cavalleri, B., Volpe, G., Tuan, G., Berti, M., Parenti, F., Curr. Microbiol. 1 (1978) 319 [2] Hammer, P. E., Hill, D. S., Lam, S. T., van Pée, K.-H., Ligon, J. M., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 2147 [3] Dairi, T., Nakano, T., Aisaka, K., Katsumata, R., Hasegawa, M., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995) 1099 [4] van Pée, K.-H., Zehner, S., Enzymology and molecular genetics of biological halogenation. In: G. W. Gribble (Ed.), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 3, part P. Natural production of organohalogen compounds. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, (2003) 171

Actinoplanes sp. ATCC 33002 produziert ein fünffach chloriertes Phenylpyrrolderivat, das Pentachlorpseudilin[1], für dessen Biosynthese die Beteiligung FADH2-abhängiger Halogenasen vermutet wurde. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, in Actinoplanes sp. nach Genen FADH2-abhängiger Halogenasen zu suchen und diese heterolog zu überexprimieren. Durch Hybridisierungsexperimente mit prnC[2] (Halogenasegen aus Pseudo¬monas fluorescens) als Sonde konnten in Actinoplanes sp. ATCC 33002 zwei potentielle Gene FADH2-abhängiger Halogenasen (halA und halB) detektiert werden. Beide Gene weisen hohe Homologien zu Genen bereits bekannter FADH2-abhängiger Halogenasen auf. Die für HalA und HalB abgeleiteten Aminosäuresequenzen weisen die größten Ähnlichkeiten zur Chlortetra¬cyclin¬halogenase (Cts4)[3] aus Streptomyces aureofaciens und zur Halogenase PrnC[2] aus Pseudomonas fluorescens BL915 auf, welche im Bereich von 55 % bis 61 % liegen. HalA und HalB enthalten die in bekannten FADH2-abhängigen Halogenasen konservierten Sequenzmotive: die FADH2-Bindestelle und das Tryptophanmotiv[4]. Während die Überexpression von halA und halB in Escherichia coli zu Inclusionbodies führte, konnte halB in zwei Pseudomonadenstämmen in löslicher Form überexprimiert werden. In P. aureofaciens pCIBhalB wurde halB und in P. fluorescens pCIBhalBhis halBhis überexprimiert. In Enzymaktivitätstests mit verschiedenen Phenylpyrrolderivaten als potentiellen Substraten wurde im HalB enthaltenden Rohextrakt des Expressionsstammes P. aureofaciens pCIBhalB in vitro chlorierende Aktivität nachgewiesen. HalB gehört somit zur Gruppe der FADH2-abhängigen Halogenasen. [1] Cavalleri, B., Volpe, G., Tuan, G., Berti, M., Parenti, F., Curr. Microbiol. 1 (1978) 319 [2] Hammer, P. E., Hill, D. S., Lam, S. T., van Pée, K.-H., Ligon, J. M., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 2147 [3] Dairi, T., Nakano, T., Aisaka, K., Katsumata, R., Hasegawa, M., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995) 1099 [4] van Pée, K.-H., Zehner, S., Enzymology and molecular genetics of biological halogenation. In: G. W. Gribble (Ed.), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 3, part P. Natural production of organohalogen compounds. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, (2003) 171

In order to improve the production of acarbose, the fermentation medium of acarbose-producing strain Actinoplanes sp. KCTC 9161 – L14 mutant was optimized in this internship. Fractional factorial design was employ to investigate the influences of glucose, maltose and corn power on acarbose production (by a-glucosidase inhibitory ability). Two significant factors: glucose and maltose have significant and positive effects on acarbose amount. In addition, a model was obtained from the regression results of fractional factorial experiment. Other success, we demonstrated that chromatography by active charcoal column can used to purify acarbose from fermentation broth. Acarbose amount in purification solution was 191.5 g/L and an acarbose - purification process was inducted. / Nhằm mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp hoạt chất acarbose từ chủng đột biến Actinoplanes sp. KCTC 9161-L14, môi trường lên men của chủng dùng để sản xuất acarbose đã được tối ưu hóa. Một phần mềm thiết kế đã được thiết lập để khảo sát ảnh hưởng của glucose, maltose và bột ngô đến khả năng sản xuất acarbose (thông qua hoạt tính ức chế a-glucosidase). Kết quả đã cho thấy, hai yếu tố glucose và maltose có ý nghĩa quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp acarbose. Một phương trình đã được hình thành từ kết quả tối ưu. Bên cạnh đó, chúng tôi đã chứng minh được cột sắc ký sử dụng than hoạt tính có thể tinh sạch acarbose từ dịch lên men. Hàm lượng acarbose trong dung dịch tinh sạch đạt 191,5 g/l và một quy trình tinh sạch acarbose được đề xuất.

In order to improve the production of acarbose, the fermentation medium of acarbose-producing strain Actinoplanes sp. KCTC 9161 – L14 mutant was optimized in this internship. Fractional factorial design was employ to investigate the influences of glucose, maltose and corn power on acarbose production (by a-glucosidase inhibitory ability). Two significant factors: glucose and maltose have significant and positive effects on acarbose amount. In addition, a model was obtained from the regression results of fractional factorial experiment. Other success, we demonstrated that chromatography by active charcoal column can used to purify acarbose from fermentation broth. Acarbose amount in purification solution was 191.5 g/L and an acarbose - purification process was inducted. / Nhằm mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp hoạt chất acarbose từ chủng đột biến Actinoplanes sp. KCTC 9161-L14, môi trường lên men của chủng dùng để sản xuất acarbose đã được tối ưu hóa. Một phần mềm thiết kế đã được thiết lập để khảo sát ảnh hưởng của glucose, maltose và bột ngô đến khả năng sản xuất acarbose (thông qua hoạt tính ức chế a-glucosidase). Kết quả đã cho thấy, hai yếu tố glucose và maltose có ý nghĩa quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp acarbose. Một phương trình đã được hình thành từ kết quả tối ưu. Bên cạnh đó, chúng tôi đã chứng minh được cột sắc ký sử dụng than hoạt tính có thể tinh sạch acarbose từ dịch lên men. Hàm lượng acarbose trong dung dịch tinh sạch đạt 191,5 g/l và một quy trình tinh sạch acarbose được đề xuất.