Frankia est une actinobactérie symbiotique de 8 familles de plantes actinorhiziennes. Elle est connue par sa capacité à fixer l'azote moléculaire. La taxonomie et la phylogénie du genre Frankia reste incomplète et à explorer. Les objectifs de cette thèse sont d'apporter des connaissances supplémentaires sur la position phylogénétique et l'évolution des différents groupes d'infectivité du genre Frankia. Dans un premier temps, une phylogénie moléculaire basée sur les gènes glnII, nifH, gyrB et des ITS 16S-23S de l'ADNr a été réalisée. Le résultat de cette étude souligne la présence de quatre groupes de Frankia : (i) le groupe 1 associe les souches infectives des Betulaceae, Myricaceae et Casuarinaceae ; (ii) le groupe 2 des microsymbiotes obligatoires associés aux Coriariaceae, Datiscaceae, Rosaceae et Ceanothus (Rhamnaceae); (iii) le groupe 3 de souches d'Elaeagnaceae, Rhamnaceae, Myricaceae et Gymnostoma (Casuarinaceae) et (iv) le groupe 4, à position ancestrale, renferme les souches atypiques non fixatrices d'azote et/ou non infectives. Le groupe 3 aurait émergé à partir du groupe 4, alors que les groupes 1 et 2 sont les groupes qui ont émergé plus récemment. Dans cette thèse, nous avons montré que la concaténation des séquences des trois gènes (glnII, nifH et gyrB) semble être un outil puissant pour une meilleure étude évolutive afin de contourner l'influence du phénomène de transfert horizontal des gènes sur la phylogénie du genre Frankia. Par ailleurs, nous avons remarqué que la faible variabilité génétique est associée à la régression de taille des génomes de Frankia et coïncide avec des transitions de mode de vie symbiotique et une répartition géographique restreinte (le cas des Frankia–Casuarina et des Frankia non cultivables du groupe 2). Dans un second temps, nous avons focalisé nos recherches sur le modèle Frankia-Coriaria. Nous avons défini quatre groupes de Frankia endosymbiotes et deux groupes pour les Coriaria en se basant sur les séquences de trois marqueurs, glnA (glutamine synthétase), dnaA (amorceur de réplication des chromosomes) et l'IGS nifD-K (l'espace intergénique entre les gènes nifD et nifK codant pour les sous-unités alpha et beta de la protéine molybdène-fer) pour les Frankia microsymbiotes et deux régions d'ADN, matK (maturase chloroplastique) et ITS1- 2 (ARNr 18S - ITS1 - ARNr 5.8S - ITS2 –ARNr 28S) pour la plante hôte. L'analyse phylogénétique de deux partenaires symbiotiques, Frankia et son hôte respectif, montre l'absence de cospéciation. Ce résultat est cohérent avec celui de dernier chapitre dont nous avons montré, pour la première fois, l'occurrence de Frankia compatibles avec Coriaria dans un sol tunisien, dépourvu de la plante hôte depuis plus de deux siècles. Ce résultat est un bon argument de l'indépendance de Frankia microsymbiote de la plante hôte Coriaria et met en question la non cultivabilité des Frankia du groupe 2 / Frankia is an actinobacterium best known for its ability to fix molecular nitrogen and infect the roots of 8 actinorhizal plant families. The Taxonomy and the phylogeny of the Frankia genus remain incomplete and have to be more explored. The objective of this thesis is to provide additional knowledge on the phylogeny and evolution of different Frankia groupes. Firstly, the molecular phylogeny based on the analysis of glnII, gyrB, nifH genes, and 16S–23S rRNA internally transcribed spacer (ITS) sequences was carried out. The result of this study emphasized the presence of four Frankia clusters: (i) cluster 1 for Frankia associated with Betulaceae, Myricaceae and Casuarinaceae (ii) cluster 2 contains Frankia microsymbionts associated with Coriariaceae, Datiscaceae, Rosaceae and Ceanothus (Rhamnaceae), (iii) cluster 3 for Frankia of Elaeagnaceae, Rhamnaceae, Myricaceae and Gymnostoma (Casuarinaceae) and (iv) cluster 4 including atypical Frankia strains that are non-infective and/or non-nitrogen-fixing was positioned at a deeper branche followed by groupes 3. While clusters 1 and 2 appeared to have diverged more recently. The present study demonstrates the utility of phylogenetic analyses based upon concatenated gyrB, nifH and glnII sequences to resolve previously unresolved or poorly resolved nodes and will help describing species among the genus Frankia. The variation of the average pairwise distance within and between the clusters allows us to suggest a gradual erosion of Frankia diversity concomitantly with a shift from saprophytic non infective/non-effective to facultative and symbiotic lifestyle. Then, we focused on the cluster 2 of non-culturable Frankia in general and special focus on Frankia associated with Coriaria. The absence of cospeciation between the uncultured Frankia microsymbionts and the disjunct actinorhizal Coriaria species has been shown. These results were obtained following analyze of three bacterial genes; glnA (glutamine synthetase), dnaA (chromosome replication initiator) and the nifD-K IGS (intergenic spacer between genes coding respectively for nitrogenase molybdenum-iron alpha and beta subunits) and two DNA region of the host plants; matK (chloroplast-encoded maturase K) and the intergenic transcribed spacers (nuclear-encoded 18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA).This result is consistent with the last chapter in which we showed, for the first time, the occurrence of compatible Frankia with Coriaria in a Tunisian soil, devoid of the host plant for more than two centuries. This represents a first argument for the independence of Frankia nodulating Coriaria to their host plants

La sporulation est un phénomène présent chez de nombreux microorganismes, généralement impliqué dans les mécanismes de dispersion et/ou résistance en conditions environnementales défavorables. La sporulation observée chez certaines souches de Frankia (genre actinobactérien fixateur d'azote) lors de leur interaction symbiotique avec les plantes actinorhiziennes est donc paradoxale dans un contexte où la bactérie bénéficie d'une niche écologique favorable à son développement. Ces souches particulières de Frankia, dites Sp+, représentent un modèle unique de symbiote capable de sporulation au sein même des cellules de son hôte. Le rôle écologique et le sens évolutif de cette sporulation in-planta reste à ce jour peu élucidé. Les deux principaux objectifs de ce travail de thèse visent donc à (i) comprendre l'influence de la sporulation in-planta sur les capacités symbiotiques des souches Sp+, en termes d'infectivité et de compétitivité et (ii) appréhender l'impact de cette sporulation sur le fonctionnement du complexe symbiotique par une méthode de profilage métabolique. Ces travaux ont permis de confirmer les particularités symbiotiques des souches Sp+ (infectivité et compétitivité accrues) et de montrer des différences significatives dans le métabolisme primaire et secondaire du complexe symbiotique associées à la présence de spores de Frankia / Sporulation is a phenomenon present in many microorganisms, usually involved in the mechanisms of dispersion and/or resistance to unfavorable environmental conditions. Sporulation occurs in some Frankia strains (a diazotrophic actinobacteria) during their symbiotic interaction with actinorhizal plants, which is paradoxical in a context where the bacterium has a favorable ecological niche for its development. These particular Frankia strains, called Sp+, represent a unique model of symbiont capable of sporulation within the host cells. The ecological role and the evolutionary meanings of this in-planta sporulation still remain understood. The two main objectives of this thesis aimed to (i) understand the influence of in-planta sporulation on the symbiotic capacity of Sp+ strains in terms of infectivity and competitiveness and (ii) understand the impact of this sporulation on the functioning of the symbiotic complex by a metabolic profiling approach. These studies have confirmed the symbiotic characteristics of Sp+ strains (greater infectivity and competitiveness) and have shown significant differences in the primary and secondary metabolism of the symbiotic complex associated with the presence of Frankia spores

Frankia est une actinobactérie capable d'établir une symbiose racinaire avec les plantes actinorhiziennes dont le genre Alnus. Seulement certaines souches de Frankia sont capables de sporuler in planta, ce qui est illustré par la présence (Sp+) ou l'absence (Sp–) de sporanges dans les cellules végétales de la nodosité. C’est à notre connaissance un cas unique de sporulation endophyte. Cependant la description et l’interprétation écologique de ce trait d’histoire de vie (THV) original étaient incomplètes. Notre contribution à l’étude de la sporulation in planta des Frankia infectives de l’aulne intègre des approches théorique, descriptive et expérimentale, pour préciser (i) l’influence relative de la souche bactérienne, de l’espèce de la plante-hôte et des conditions pédoclimatiques sur ce THV, (ii) le rôle de la variabilité environnementale sur la distribution, la diversité et la sélection du trait, ainsi que (iii) les coûts et bénéfices associés pour les deux partenaires. Nous avons démontré pour la première fois que la sporulation in planta est un THV (i) spécifique de certaines lignées de Frankia, (ii) majeur pour en comprendre l'histoire évolutive et (iii) significativement corrélé à des caractéristiques génétiques des souches. Nous avons également confirmé que l’occurrence du trait varie selon l’environnement. Nous avons enfin établi un modèle de l'évolution du trait abordant sa valeur adaptative. L’ensemble des réflexions menées et des résultats obtenus nous permet de discuter de la sporulation in planta dans le cadre d’un continuum de stratégies symbiotiques, et plus généralement de discuter de l’écologie évolutive des symbioses entre microorganismes et plantes / Frankia sp. is a telluric actinobacteria able to establish a root symbiosis with actinorhizal plant such as Alnus sp. Only some Frankia strains are able to sporulate in-planta, as spores can be present in (Sp+) or absent from (Sp–) the vegetal cells of the root nodule. It is to our knowledge a unique case of endophytic sporulation. However, the description and the ecological interpretation of this original life-history trait (LHT) were scarce. Our contribution to the study of the in-planta sporulation of Alnus-infective Frankia sp. combines theoretical, descriptive and experimental approaches to precise (i) the relative effect of the bacterial strain, the host-plant species and the pedoclimatic conditions on this LHT, (ii) the effect of the of the environmental variability on the distribution, diversity and selection of the trait, and (iii) the associated costs and benefits for the two symbiotic partners. We demonstrated for the first time that the in-planta sporulation is a LHT (i) specific to some Frankia lineages, (ii) major to understand their evolutionary history and (iii) significantly correlated to particular genetic features. We also shown that the occurrence of the trait varies according to the environment We also proposed a model of the evolution of the trait taking its fitness into account. We bring all the previous considerations and results to discuss the inplanta sporulation trait within a continuum of symbiotic strategies and more generally to discuss the evolutionary ecology of plant-microbe symbioses

Les patrons de distribution chez les micro-organismes reposeraient sur leurs capacités à disperser dans le temps et dans l'espace, en lien avec des facteurs abiotiques comme les propriétés du sol, le climat, et des interactions biotiques, notamment avec l'hôte dans le cas des symbiontes, mais aussi sur les traits d'histoire de vie propres aux micro-organismes, telle que la capacité à sporuler. Frankia sp. est une actinobactérie sporulante et fixatrice d'azote à la biogéographie complexe, car vivant à la fois de façon saprophytique dans le sol, en symbiose racinaire (nodosité) avec les plantes actinorhiziennes dont les aulnes (Alnus, Betulaceae). Deux types de souches de Frankia génétiquement différentes ont été décrites dont la distinction phénotypique majeure réside dans la capacité à maintenir (Sp+) ou non (Sp-) leur sporulation in planta. Cette sporulation endophytique est à notre connaissance unique dans un contexte symbiotique et son implication dans la biogéographie de Frankia, reste peu connue. Ces travaux de thèse intègrent à la fois des approches descriptives et expérimentales, sur le terrain et au laboratoire, afin d'accroître la compréhension du rôle écologique de la sporulation in planta de Frankia. Dans un premier temps, nous avons étendu la description de la phylobiogéographie des souches de Frankia Sp+ afin de tester la validité du patron de distribution centré sur les milieux froids des zones de haute altitude et de haute latitude de l'hémisphère nord. Un intérêt tout particulier a été porté sur les aires géographiques où une plus forte diversité de Frankia était attendue, dans la zone d'origine de l'aulne et ses refuges glaciaires. Dans un second temps, nous avons étudié l'influence du partenaire végétal dans la distribution observée des Frankia Sp+ et l'implication du trait Sp+ dans la capacité d'association à l'hôte. Des croisements expérimentaux ont été réalisés au laboratoire afin de découpler les effets de l'espèce-hôte et du climat, et tester les implications du trait Sp+ en termes d'infectivité, compétitivité et spectre d'hôte. Enfin, nous avons étudié les conséquences écosystémiques de l'expansion subalpine du complexe symbiotique Alnus/Frankia, au niveau de la diversité microbienne et du fonctionnement du cycle de l'azote, en fonction du phénotype de sporulation des souches associées. Des analyses pédologiques, en association avec des mesures de nitrification, dénitrification et fixation d'azote, ainsi que des analyses de diversité microbienne (globale et fonctionnelle), ont été réalisées dans différentes aulnaies Sp+, Sp- ou mixte, à différents stades de colonisation de l'aulne. Les résultats obtenus démontrent une prédominance des souches Sp+ associées aux espèces d'aulne des milieux froids sur les 3 continents de la zone Holarctique, avec une diversité nouvelle dans l'aire d'origine et les zones refuges de l'aulne. Les croisements effectués révèlent une infectivité et compétitivité plus forte des Sp+ par rapport aux Sp-. De plus, contrairement aux Sp- à spectre d'hôte très large, les Sp+ présentent un spectre limité entraînant des incompatibilités d'association suggérant une dépendance forte à une espèce-hôte donnée. Les modifications des communautés microbiennes du sol en réponse à l'expansion du complexe symbiotique Alnus/Frankia ont été démontrées, en lien avec la stimulation du cycle de l'azote dans les milieux sub-/alpins. Les premiers résultats sur l'efficience comparée de la fixation d'azote in natura des souches Sp- par rapport aux Sp+ suggèrent que 100% de l'azote de l'aulne est obtenu par le biais de la fixation. Aucun patron n'est mis en évidence entre souches Sp+ et Sp-, suggérant un effet plus complexe de la saisonnalité, de l'âge de l'arbre et de celui de la nodosité. Les résultats obtenus nous permettent de mieux appréhender les facteurs guidant la biogéographie de Frankia et de discuter de l'évolution de ces patrons de distribution en réponse au réchauffement climatique / Microbial biogeography would be based on the ability of microorganisms to disperse across time and space, as a function of abiotic factors such as soil properties, climate, and of biotic interactions, in particular with the host in the case of symbionts, but also on life history traits such as the ability to sporulate. Frankia sp. is a spore-forming and nitrogen-fixing actinobacterium that has a complex biogeography given its abilities for both saprophytic life and root symbiotic interaction with actinorhizal plants such as alders (Alnus, Betulaceae). Two distinct groups of Frankia lineages have been described according to a major phenotypic divergence, based on the presence (Sp+) or the absence (Sp-) of spores in planta.. To the best of our knowledge, this endophytic sporulation is an original trait in a symbiotic context and very little is known about its incidence in Frankia biogeography. This work integrates descriptive and experimental approaches on both field and laboratory areas, in order to improve the understanding of the ecological role of Frankia in planta sporulation. First, we have extended the description of the phylobiogeography of Sp+ Frankia strains to validate the previously proposed distribution pattern focused on cold environements at high altitude or high latitude. A phylogeny has been computed using a large number of nodular strains coming from the 3 continents of the Northern Hemisphere and 10 different Alnus species. Special attention was paid to geographic areas where a higher diversity was expected, in Asia, and in its glacial refuges. Second, we studied the influence of the host-plant on the distribution of Fankia Sp+ and the incidence of Sp+ in the symbiotic interaction. Experimental crosses have been performed to disentangle host and climate effects and to test the incidence of the Sp+ trait in terms of infectivity, competitiveness and host-range. Finally, we studied the ecological consequences of the Alnus/Frankia symbiotic complex, on the microbial diversity and on the nitrogen cycle functionning, with respect to the sporulation of Frankia and to the Alnus expansion on sub-/alpine grasslands. Soils analyses were performed in association with measures of nitrification and denitrification, as well as global and functional microbial diversity analyses, in Sp+, Sp- or mixed alder stands and at different colonization stages. In each part of this work, alder ectomycorhizae were analyzed to compare the distribution pattern between the two symbionts and to highlight potential interactions with the Sp+ trait of Frankia. Our results show the dominance of Sp+ strains in nodules of alder species from cold environments over the 3 continents of the Holarctic zone, with original diversity patterns in alder area of origin and in glacial refuges. Even if these strains are genetically homogenous, host-specific clusters were observed in the phylogeny. Crosses revealed that Sp+ strains were more infective and competitive than Sp- strains. Moreover, unlike Sp- strains that harbor a wide host-range, Sp+ strains have a narrower specificity leading to association’s incompatibilities and suggesting strong host dependence. For the first time, modifications of microbial communities were revealed in response to the Alnus-Frankia symbiotic complex colonization and were linked to a stimulation of the nitrogen cycle in the sub-/alpine grasslands. The first comparative results of nitrogen fixation between Sp+ and Sp- strains in natura suggest a maximal efficiency of fixation, representing almost 100% of the alder nitrogen. However, unlike previous reports in literature, no pattern was observed between Sp+ and Sp- strains, suggesting a complex effect of seasonality, alder age as well as that of nodules. Altogether, the previous results contribute to a better understanding of the Frankia biogeography drivers and allow us to discuss the expected evolution of distribution pattern in response to the global warming

Red alder (Alnus rubra Bong.) is the only tree in British Columbia and the Northwest US to engage in actinorhizal symbiosis to fix atmospheric nitrogen. This study was conducted to explore the plasticity in growth and physiology among 58 17-year-old red alder families in response to variation in climate in two common garden plots, one at Bowser, BC and one at Terrace, BC. Physiological assessments included height and diameter growth, bud flush, water use efficiency as measured by δ13C, cold hardiness as measured by controlled freezing and electrolyte leakage, autumn leaf senescence, and instantaneous and seasonally integrated rates of nitrogen fixation as measured by acetylene reduction and natural abundance δ15N isotope analysis, respectively. Significant differences were identified among families for growth (height and diameter), bud burst stage, leaf senescence, cold hardiness, and bud nitrogen content. No significant differences among families were identified for water use efficiency as measured by δ13C, or for rates of nitrogen fixation as measured by either acetylene reduction or natural abundance δ15N. This study identified possible adaptive differences among red alder genotypes, especially in traits such as bud flush timing, cold hardiness, or nitrogen fixation and their respective contributions to growth. These differences often reflected a tradeoff between growth and the ability to tolerate an extreme environment. Cold hardiness results indicate that red alder families are well adapted to their climate of origin, and may not be able to acclimate sufficiently to a northward assisted migration of genotypes. Nitrogen fixation results demonstrated gaps in our current knowledge of Frankia distribution and impact on the actinorhizal symbiosis in British Columbia. / Graduate