Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:31:21Z : No. of bitstreams: 1 tapparo_af_me_sjrp.pdf: 812527 bytes, checksum: aac6f17be2c6552511dcaa2c2bd79c32 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Atualmente, as culturas celulares são consideradas uma das ferramentas mais importantes na virologia. Os meios de cultura utilizados na manutenção destes sistemas não oferecem capacidade às células de adsorver e se multiplicar em matrizes plásticas sem a adição suplementar de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, o uso do SFB não é aconselhável devido às variações encontradas entre os lotes, o alto grau de proteína animal e a possibilidade da presença de agentes infecciosos. Além dos aspectos sanitários, existe o aspecto ético em relação à obtenção deste produto biológico. Com o aumento dos ensaios in vitro a quantidade estimada de produção de soro fetal bovino no mundo é de aproximadamente 500.000 litros/ano, isto significa, mais de 1.000.000 de fetos bovinos sacrificados para obtenção de SFB. O objetivo deste estudo foi cultivar as células CER (chicken embryo related) em diferentes meios de cultura: M-VSFM, 293- SFMII, VP-SFM, VP-SFM AGT, Glasgow, Leibovitz 15, adicionados de 2mg/ml ou 5mg/ml de IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) e verificar a possibilidade das estirpes virais Lukert e Farangher de se adaptarem neste sistema. Nesta cultura a expressão da fibronectina e da laminina (LB1 e LB2) foram dectadas por imunofluorescência e imunoperoxidase indireta, respectivamente. As monocamadas de células CER foram infectadas pela estirpe Lukert e Farangher, sendo a m.o.i (multiplicidade de infecção) utilizada de 1.0. Após três passagens, o RNA viral foi extraído para determinar as substituições genéticas. A região hipervariável do gene VP2 foi amplificada por RT/PCR. Para confirmar as mutações, os produtos da PCR foram seqüênciados e comparados com as seqüências de VDIB publicadas no GenBank. Os resultados demonstraram que o meio VP-SFM e 5µg/mL de IGF-1 aplicado às culturas foi o melhor para a adaptação direta do cultivo das monocamadas... / Currently, the cell culture are considered one of the tools most important in the virology. The culture medium used in the maintenance those systems do not offer capacity to the cells of attachment and if spread in plastic surfaces without the supplementary addition of foetal bovine serum (FBS). However, the use FBS is not advisable due to batch-tobatch variation in composition, the high animal protein content, and the possibility of the presence of infectious agents. Beyond the sanitary aspects, exists the ethical aspect in relation to the attainment of this biological product. With the increase of in vitro assays the amount of FBS produced in the world is estimated at approximately 500.000 litres/year, this carry in 1.000.000 bovine fetuses sacrified for FSB attainment. The aim of this study was to adapt the CER cells (chicken embryo related) on different medium: M-VSFM, 293-SFMII, VP-SFM, VP-SFM AGT, Glasgow, Leibovitz 15, supplemented by 2mg/ml or 5mg/ml IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) and to verify the possibility the Lukert and Farangher viral strain adapted in this system. The expression of the fibronectin and laminin (LB1 and LB2) were detected by immunofluorescence and indirect immunoperoxidase, respectively. The CER cells monolayer had been infected by Lukert and Farangher strain, being the m.o.i (infection multiplicity) used of 1.0. After three passages, viral RNA was isolated to determine the genetic changes. The hypervariable regions of the VP2 gene was amplified by RT/PCR. To confirm the genetic changes, PCR products were sequenced and compared to the sequences of the GenBank published VDIB strain.The results had demonstrated that the medium VP-SFM and 5µg/mL IGF-1 applied to the cultures was optimum for the direct adaptation of the culture of the monolayers without addition of FBS. In relation the detection of the extracellular protein, the fibronectin was induced... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-03-26T12:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1674702 bytes, checksum: ab48c56e0fe4a5a3fc7dfa63a5d9e325 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Begomoviruses (family Geminiviridae) have one or two genomic components, infect dicotyledonous plants and are naturally transmitted by the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Begomoviruses cause diseases of major economic importance in many crops, especially in tropical and subtropical regions. In Brazil, a viral complex composed of at least eight species, including Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato yellow spot virus (ToYSV), is responsible for losses in tomato. The complete DNA-B sequences of ToRMV and ToSRV show an identity of 98.2% and the high identity of their common region sequences (96.2%) indicates that the two viruses may share the same DNA-B. For the successful establishment of a viral infection, several interactions are required between begomovirus and host proteins. In this work, experiments were conducted with the following objectives: (1) to analyze the importance of recombination and pseudorecombination in the generation of variability and adaptation to the host of ToRMV and ToSRV; (2) to examine the involvement of two components of the anaphase-promoting complex (APC7 and APC10) in begomovirus replication; (3) to detect and characterize host proteins which interact with the ToYSV movement protein, MP. For the first objective, Nicotiana benthamiana plants were inoculated with all possible combinations of ToRMV and ToSRV DNA-A and DNA-B. Additionally, recombination and nucleotide/amino acid sequence comparisons between ToRMV and ToSRV were performed. The results indicate that ToRMV has both a recombinant and pseudorecombinant origin, and that ToRMV exerts a negative interference over ToSRV. For the second objective, Arabidopsis thaliana plants overexpressing APC7, APC10 and different APC7 mutants were inoculated with Cabbage leaf curl virus (CaLCuV), and viral DNA accumulation was estimated in plants at 14 and 28 days post-inoculation (dpi). The results indicate that APC7 and APC10 negatively affect CaLCuV DNA accumulation, and that both the N-terminal and C-terminal portions of the APC7 protein are involved in this effect. For the third objective, leaves of N. benthamiana were agroinfiltrated with the "bait" construct NTAPi-MP, and 48 hours after agroinfiltration the leaves were collected for extraction and purification of protein heterocomplexes. However, this transient expression assay in leaves of N. benthamiana failed to detect interactions between ToYSV MP and host proteins. / Os begomovírus (família Geminiviridae) possuem um ou dois componentes genômicos, infectam plantas dicotiledôneas e são transmitidos naturalmente pela mosca- branca Bemisia tabaci (Homoptera:Aleyrodidae). Os begomovírus causam doenças de grande importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, um complexo viral composto por pelo menos oito espécies, incluindo o Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Tomato yellow spot virus (ToYSV), é responsável por grandes perdas na cultura do tomateiro. A sequência completa dos DNAs-B do ToSRV e ToRMV apresenta identidade de 98%, e a elevada identidade de sequência da região comum (96,2%) indica que os dois vírus podem compartilhar o mesmo DNA-B. Para o estabelecimento de uma infecção viral é necessária uma série de interações entre proteínas dos begomovírus e do hospedeiro. Neste trabalho, foram conduzidos experimentos com os objetivos de: (1) analisar a importância da recombinação e da pseudo-recombinação na geração de variabilidade e na adaptação ao hospedeiro dos begomovírus ToRMV e ToSRV; (2) analisar o envolvimento de APC7 e APC10, dois componentes do complexo promotor da anáfase, na replicação de begomovírus; (3) detectar e caracterizar proteína(s) do hospedeiro que interagem com a MP do begomovírus ToYSV. Para o primeiro objetivo, plantas de N. benthamiana foram inoculadas com todas as combinações possíveis entre o DNA-A e o DNA-B do ToRMV e do ToSRV. Análises de recombinação e das sequências de nucleotídeos e aminoácidos entre ToRMV e ToSRV também foram realizadas. Os resultados indicaram que o ToRMV apresenta uma origem recombinante e pseudo-recombinante, e que o ToRMV exerce uma interferência negativa sobre o ToSRV. Para o segundo objetivo, plantas de Arabidopsis thaliana superexpressando APC7 ou APC10 e diferentes mutantes para APC7 foram inoculadas com o begomovírus Cabbage leaf curl virus (CaLCuV) e o acúmulo de DNA viral foi estimado em plantas infectadas, aos 14 e 28 dias pós-inoculação (dpi). Os resultados indicaram que APC7 e APC10 afetam o acúmulo do CaLCuV, e que tanto a região N-terminal quanto a C-terminal de APC7 estão envolvidas neste efeito. Para o terceiro objetivo, folhas de N. benthamiana foram agroinfiltradas com a construção "isca" NTAPi-MP, e 48 horas após a agroinfiltração estas folhas foram coletadas para extração e purificação do heterocomplexo protéico. Entretanto, esse ensaio de expressão transiente em folhas de N. benthamiana não permitiu detectar interações entre a proteína MP do ToYSV e proteína(s) do hospedeiro.