L’os est un tissu dynamique, en remodelage constant grâce à un processus finement régulé impliquant des facteurs locaux et systémiques. Un déséquilibre entre la formation et la résorption osseuses, assurées respectivement par les ostéoblastes et les ostéoclastes, conduit à une altération de la microarchitecture de l’os, une augmentation du risque de fracture, et à l’apparition de pathologies telles que l’ostéonécrose et l’ostéoporose. Ces deux maladies ont pour caractéristiques communes une diminution du nombre de cellules stromales mésenchymateuses (MSC), les progéniteurs des ostéoblastes, et des anomalies fonctionnelles des MSC et des cellules ostéoblastiques (Ob). De surcroit, elles présentent toutes deux une accumulation d’adipocytes au sein de la moelle osseuse. De récentes publications suggèrent que cette accumulation d’adipocytes médullaires pourrait avoir des conséquences délétères sur la physiologie des cellules ostéoformatrices et de leurs progéniteurs, partageant ce même microenvironnement osseux. Une relation inverse entre l’excès d’adiposité médullaire et la masse osseuse est en effet aujourd’hui clairement établie. Par son importante activité sécrétrice de cytokines et d’adipokines ainsi que sa capacité à stocker et libérer des acides gras libres (AGL), l’adipocyte médullaire est capable de modifier la composition du microenvironnement osseux, et ainsi d’influencer le métabolisme et la fonction des cellules avoisinantes, et notamment des cellules osseuses. Afin d’étudier l’influence des AGL sur la survie et la fonction des cellules ostéogéniques, nous avons utilisé un AGL saturé, le palmitate (Palm ;C16 :0) et un AGL monoinsaturé, l’oléate (Ole ;C18 :1), tous deux étant particulièrement abondants dans l’organisme et l’alimentation de l’homme et couramment utilisés dans les études de lipotoxicité. Dans un premier temps, nous avons travaillé sur des MSC isolées de la moelle osseuse de sujets sains (HV-MSC), qui ont éventuellement été différenciées en Ob. Nous avons démontré que l’exposition de ces cellules à des concentrations physiologiques de Palm entraîne une cytotoxicité dose-et temps-dépendante, via l’initiation d’un stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation des voies ERK et NFκB. En outre, l’AGL saturé induit un état pro-inflammatoire en augmentant l’expression du toll-like receptor 4 et la production des interleukines (IL) 6 et 8. Nous avons montré que les Ob présentent une sensibilité accrue au Palm, associée à une exacerbation du stress du RE et de la réponse pro-inflammatoire. L’Ole n’a pas d’effet délétère sur les MSC et les Ob, et de surcroit, il bloque les différentes voies activées par le Palm, neutralisant ainsi totalement la lipotoxicité induite par l’AGL saturé. Nous avons démontré par ailleurs que l’AGL monoinsaturé favorise l’estérification et le stockage du Palm dans des gouttelettes lipidiques, contrant ainsi ses effets délétères. Nous avons ensuite étudié les effets de ces deux AGL, sur des MSC isolées de patients atteints d’ostéonécrose de la tête fémorale (ON-MSC), comparativement aux HV-MSC. Lors de la procédure d’isolation des MSC, nous avons conservé le surnageant obtenu après la première centrifugation (bone marrow supernatant fluid, BMSF) pour une analyse de sa composition lipidique, celle du sérum étant réalisée en parallèle. Nous avons démontré que l’exposition au Palm favorise la différenciation des MSC vers la lignée adipogénique, au détriment du phénotype ostéoblastique. De plus, nous avons observé que les ON-MSC possèdent une capacité de différenciation adipogénique supérieure à celles des HV-MSC.D’autre part, nos résultats ont montré que les ON-MSC sont plus sensibles à la lipotoxicité que les HV-MSC, cette hypersensibilité étant associée à un dérèglement de plusieurs mécanismes cellulaires impliqués dans la survie ou les processus de protection cellulaire :le niveau d’activation basal de la voie ERK est supérieur à celui des HV-MSC et la régulation de l’expression génique des enzymes stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) et carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1), favorisant respectivement la désaturation des AGL saturés et leur β-oxydation mitochondriale, est altérée dans les ON-MSC. Par ailleurs, dans ces cellules, la production des cytokines IL-6 et IL-8 est triplée par rapport à celle des HV-MSC.La caractérisation du profil lipidique du sérum n’a pas mis en évidence de différence significative entre les sujets sains et ostéonécrotiques. Cependant, de profondes modifications du contenu en AGL du BMSF ont été observées, montrant un enrichissement important en acide palmitique, palmitoléique, oléique, vaccénique et linoléique chez les sujets ostéonécrotiques. Ces modifications reflètent un changement du microenvironnement osseux chez ces patients qui pourrait être lié à l’activité sécrétrice des adipocytes médullaires et altérer le fonctionnement des cellules voisines.L’ensemble de nos travaux suggère qu’au sein du microenvironnement osseux, l’accumulation d’adipocytes médullaires pourrait avoir un effet délétère sur les cellules responsables de la formation osseuse, notamment via la libération d’AGL. Ces AGL étant cytotoxiques pour les cellules ostéoformatrices mais bénéfiques pour les cellules responsables de la résorption osseuse, ils pourraient favoriser un déséquilibre du remodelage osseux. En lien avec ces observations, nos résultats obtenus avec les ON-MSC suggèrent également que la lipotoxicité pourrait participer aux mécanismes pathogéniques qui initient et/ou entretiennent l’ostéonécrose. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mégacaryocytes sont des cellules de la moelle osseuse qui par un processus complexe et encore mal caractérisé, mégacaryopoïèse/thrombopoïèse, donnent naissance, in fine, aux plaquettes sanguines. La différenciation mégacaryocytaire nécessite un intense remodelage nucléaire et cytoplasmique, guidé à la fois par des facteurs intrinsèques mais aussi par des facteurs extrinsèques tel que le microenvironnement médullaire. Les plaquettes sanguines sont des acteurs essentiels du maintien de l'intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l'arrêt du saignement lors d'une blessure vasculaire par la formation d'un thrombus via des mécanismes d'adhésion, de sécrétion et d'agrégation, trois étapes majeures de l'hémostase physiologique. Dans un premier temps, mes travaux de thèse visent à déterminer le rôle inconnu de l'isoforme alpha des PI3Ks de classe II (PI3KC2a), de la PI3K de classe III (Vps34) et de leur produit, le phosphatidylinositol 3 monophosphate (PI3P), dans la production et les fonctions plaquettaires. Grâce à un modèle murin présentant une inactivation partielle de la PI3KC2a, j'ai mis en évidence son rôle clé dans la génération d'un pool basal de PI3P dans les plaquettes. L'inactivation de la PI3KC2a affecte la composition du cortex sous-membranaire plaquettaire induisant une morphologie plaquettaire anormale, une accumulation de plaquettes à deux corps appelées " barbell-shaped proplatelets ", un défaut de formation du thrombus ex vivo et un retard d'occlusion de la carotide après lésion in vivo. Ainsi, la PI3KC2a joue un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité du squelette membranaire contrôlant la structure et la dynamique membranaire, processus critique à la production de plaquettes fonctionnelles. D'autre part, la délétion de Vps34 spécifiquement dans la lignée mégacaryocyte/plaquette se traduit par une microthrombopénie modérée associée à une migration anormale des mégacaryocytes liées à un défaut de trafic vésiculaire et une diminution du taux de PI3P. De façon intéressante, Vps34 joue aussi un rôle dans l'activation plaquettaire en régulant la production de PI3P sous stimulation, la croissance du thrombus ex vivo et les capacités thrombotiques in vivo. Le rôle de Vps34 dans la plaquette indépendamment de son rôle dans le mégacaryocyte a été confirmé via l'utilisation de nouveaux inhibiteurs spécifiques de Vps34, SAR405 et INH1, ex vivo. Vps34 est donc critique dans la régulation de la production plaquettaire par les mégacaryocytes ainsi que dans l'activation plaquettaire. Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à l'impact du microenvironnement médullaire sur la mégacaryopoïèse, et plus spécifiquement sur la communication entre adipocytes médullaires et progéniteurs hématopoïétiques lors de leur différenciation en mégacaryocytes. Grace à un système de coculture in vitro, j'ai montré que les adipocytes améliorent la différenciation mégacaryocytaire via un transfert direct de lipides, dans un but non-énergétique. Dans un contexte d'obésité, nous observons, in vivo, associée à une adiposité médullaire augmentée une maturation mégacaryocytaire exacerbée, une production et une demi-vie plaquettaire défectueuses ayant pour conséquence une macrothrombopénie. Ainsi, le microenvironnement médullaire et plus particulièrement l'adipocyte impacte directement sur la mégacaryopoïèse et la production plaquettaire. En conclusion, ces travaux de thèse contribuent à caractériser les mécanismes de production et de fonction plaquettaire régulés par des facteurs intrinsèques tels que le PI3KC2a et Vps34, ainsi que par des facteurs extrinsèques tels que l'adipocyte médullaire. / Megakaryopoiesis is a highly specialised and complex process occurring in the bone marrow, by which megakaryocytes give rise to de novo circulating blood platelets. Megakaryocyte differentiation implies cytoplasmic and nuclear rearrangements regulated by intrinsic as well as extrinsic factors such as bone marrow microenvironment. Platelets play a critical role in preventing blood loss after vascular injury by orchestrating clot formation through mechanisms of adhesion, secretion and aggregation. These mechanisms are the three major steps of physiological haemostasis leading to the maintenance of vascular integrity. Firstly, my thesis work focused on characterizing the role of class II PI3K alpha isoform (PI3KC2a), class III PI3K (Vps34) and their common product the phosphatidylinositol 3 monophosphate (PI3P) in platelet production and function. Using a unique mouse model partially inactivated for PI3KC2a, I highlighted its key role in the production of a basal PI3P housekeeping pool in platelets. PI3KC2a partial inactivation affects platelet membrane skeleton composition leading to an abnormal platelet morphology, an enrichment of platelet with two cell bodies recently called "barbell-shaped proplatelets", an ex vivo defective thrombus formation and an in vivo delayed carotid occlusion following injury. Thus, PI3KC2a plays a major role in membrane structure and dynamics by maintaining membrane skeleton integrity, which is crucial for functional platelet production. On the other hand, Vps34 specific deletion in megakaryocyte/platelet lineage induced mild microthombopenia correlated to an abnormal megakaryocyte migration linked to an affected PI3P production as well as vesicular trafficking in megakaryocytes. In platelets, Vps34 plays a role in their activation by regulating PI3P production under stimulation, ex vivo thrombus growth and in vivo thrombotic capacity. Vps34 role in platelet independently from its role in megakaryocyte was confirmed using two recently developed inhibitors, SAR405 and INH1, which reproduced ex vivo thrombus growth defects. Therefore, Vps34 is critical for platelet production by megakaryocyte as well as platelet activation. Secondly, I studied the impact of bone marrow microenvironment on megakaryopoiesis and more specifically the crosstalk between medullar adipocytes and hematopoietic progenitors differentiating towards the megakaryocyte lineage. Using an in vitro coculture assay, I demonstrated that adipocytes enhanced megakaryocyte differentiation through a direct lipid transfer, in a non-energetic aim. In the context of obesity, increased marrow adipocity is associated to enhanced megakaryocyte differentiation and defective platelet production and lifespan leading to macrothrombopenia. Thus, bone marrow microenvironment through adipocytes impact directly on megakaryopoiesis and platelet production. Altogether my thesis work contributes to better understand platelet production and function, mechanisms regulated by intrinsic factors such as PI3KC2a and Vps34 as well as extrinsic factors like medullar adipocytes.