Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1989. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [83]-90).

Litter-decay fungi have recently been shown to secrete heme-thiolate peroxygenases that oxidize various organic chemicals, but little is known about the physiological role or the mechanism of these enzymes. The aromatic peroxygenase of Agrocybe aegerita (AaeAPO) was purified and catalytically characterized. An overall reaction mechanism was proposed. The results show that AaeAPO catalyzed diverse H2O2-dependent monooxygenations (two-electron oxidations) including (a) the cleavage of aliphatic and aromatic ethers, (b) the regio- and enantioselective hydroxylation of aromatic compounds, (c) the stepwise oxygenation of benzylic compounds, (d) the N-dealkylation of secondary amines and (e) the dehalogenation of halogenated aliphatic compounds as well as typical peroxidase reactions (suggested to involve one-electron oxidation) such as (f) oxidation and polymerization of phenols and (g) halogenations. The enzyme failed to oxidize polymers such as polyethylene glycol (PEG). Mechanistic studies with several model substrates provided information about the reaction cycle of AaeAPO: (1) stoichiometry of tetrahydrofuran cleavage showed that the reaction was a two-electron oxidation that generated one aldehyde group and one alcohol group, yielding the ring-opened product 4-hydroxybutanal, (2) steady-state kinetics results with methyl 3,4-dimethoxybenzyl ether, which was oxidized to 3,4-dimethoxybenzaldehyde, gave parallel double reciprocal plots suggestive of a ping-pong mechanism, (3) the cleavage of methyl 4-nitrobenzyl ether, the hydroxylation of aromatics such as diclofenac and nitrophenol and the oxygenation of benzylic compounds, resulted in incorporation of 18O into the reaction product in the presence of H218O2, and (4) the demethylation of 1-methoxy-4-trideuteromethoxybenzene showed an distinct observed intramolecular deuterium isotope effect. These results support a mechanism similar to that envisaged for the peroxygenase activity of P450s in which the enzyme heme is oxidized by H2O2 to give an iron species that carries one of the peroxide oxygen. This intermediate then abstracts a hydrogen from the substrate, which is followed by rebound of an •OH equivalent to produce the monooxygenated reaction product (hydrogen abstraction and oxygen rebound mechanism). AaeAPO may accordingly have a role in the biodegradation of natural and anthropogenic low molecular weight compounds in soils and plant litter. Moreover, the results raise the possibility that fungal peroxygenases may be useful for versatile, cost-effective, and scalable syntheses of drug metabolites and herbicide precursors. / Die Peroxygenase des Südlichen Ackerling (Agrocybe aegerita, AaeAPO) wurde gereinigt, ihr Katalysepotential ermittelt und ein allgemeiner Reaktionsmechanismus postuliert. Die AaeAPO katalysiert sowohl H2O2-abhängige Monooxygenierungen (Zwei-Elektron Oxidationen) wie (a) die Spaltung aliphatischer und aromatischer Ether, (b) die regio- und enantioselektive Hydroxylierung von Aromaten, (c) die schrittweise Monooxygenierung von Toluolderivaten, (d) die N-Dealkylierung sekundärer Amine und (e) die Dehalogenierung chlorierter Aliphaten als auch typische Reaktionen bekannter Peroxidasen (vermutlich Ein-Elektron-Oxidation) unter anderem (f) die Oxidation/ Polymerisierung von Phenolen und (g) die Halogenierung von Aromaten. Polymere Verbindungen wie Polyethylenglycol (PEG) werden nicht oxidiert. Mechanistische Untersuchungen zur Etherspaltung am Beispiel der AaeAPO haben Einblick in den generellen Reaktionsmechanismus dieses neuen Enzymtyps ermöglicht: (1) die Stöchiometrie der Spaltung von Tetrahydrofuran entspricht der einer zwei-Elektron-Oxidation, (2) die Spaltung von Methyl-3,4-Dimethoxybenzylether zu 4-Dimethoxybenzaldehyd und Methanol ergaben parallele Verläufe für die ermittelten Ausgleichsgeraden in der doppelt reziproken Darstellung, was einem „Ping-Pong“-Reaktionsmechanismus entspricht (3) die Monooxygenierungen haben stets den Einbau eines aus dem Peroxid (H2O2) stammenden Sauerstoffatoms in das Produkt zur Folge, (4) die O-Dealkylierung von 1-Methoxy-4-Trideuterummethoxybenzol zeigt einen ausgeprägten Deuterium Isotopen Effekt, was auf die primäre Abspaltung eines Wasserstoffatoms vom Substratmolekül hindeutet. Demnach verläuft die Peroxygenase-katalysierte Monooxygenierung über Wasserstoffabstraktion und eine unmittelbar anschließende Sauerstoffrückbindung (hydrogen abstraction - oxygen rebound mechanism). Diese Reaktionsabfolge ähnelt dem sogenannten peroxide "shunt" pathway, der von einer Reihe Cytochrom-P450-abhängiger Monooxygenasen her bekannt ist. Die physiologische Funktion der AaeAPO besteht möglicherweise in der extrazellulären Transformation und Detoxifikation niedermolekularer Pflanzeninhaltsstoffe, mikrobieller Metabolite und anthropogener Xenobiotika. Aufgrund der Stabilität und Unabhängigkeit der AaeAPO von teuren Kofaktoren ergeben sich vielversprechende biotechnologische Möglichkeiten zum Einsatz isolierter Biokatalysatoren in selektiven (bio)chemischen Synthesen monooxygenierter Metabolite.

Litter-decay fungi have recently been shown to secrete heme-thiolate peroxygenases that oxidize various organic chemicals, but little is known about the physiological role or the mechanism of these enzymes. The aromatic peroxygenase of Agrocybe aegerita (AaeAPO) was purified and catalytically characterized. An overall reaction mechanism was proposed. The results show that AaeAPO catalyzed diverse H2O2-dependent monooxygenations (two-electron oxidations) including (a) the cleavage of aliphatic and aromatic ethers, (b) the regio- and enantioselective hydroxylation of aromatic compounds, (c) the stepwise oxygenation of benzylic compounds, (d) the N-dealkylation of secondary amines and (e) the dehalogenation of halogenated aliphatic compounds as well as typical peroxidase reactions (suggested to involve one-electron oxidation) such as (f) oxidation and polymerization of phenols and (g) halogenations. The enzyme failed to oxidize polymers such as polyethylene glycol (PEG). Mechanistic studies with several model substrates provided information about the reaction cycle of AaeAPO: (1) stoichiometry of tetrahydrofuran cleavage showed that the reaction was a two-electron oxidation that generated one aldehyde group and one alcohol group, yielding the ring-opened product 4-hydroxybutanal, (2) steady-state kinetics results with methyl 3,4-dimethoxybenzyl ether, which was oxidized to 3,4-dimethoxybenzaldehyde, gave parallel double reciprocal plots suggestive of a ping-pong mechanism, (3) the cleavage of methyl 4-nitrobenzyl ether, the hydroxylation of aromatics such as diclofenac and nitrophenol and the oxygenation of benzylic compounds, resulted in incorporation of 18O into the reaction product in the presence of H218O2, and (4) the demethylation of 1-methoxy-4-trideuteromethoxybenzene showed an distinct observed intramolecular deuterium isotope effect. These results support a mechanism similar to that envisaged for the peroxygenase activity of P450s in which the enzyme heme is oxidized by H2O2 to give an iron species that carries one of the peroxide oxygen. This intermediate then abstracts a hydrogen from the substrate, which is followed by rebound of an •OH equivalent to produce the monooxygenated reaction product (hydrogen abstraction and oxygen rebound mechanism). AaeAPO may accordingly have a role in the biodegradation of natural and anthropogenic low molecular weight compounds in soils and plant litter. Moreover, the results raise the possibility that fungal peroxygenases may be useful for versatile, cost-effective, and scalable syntheses of drug metabolites and herbicide precursors. / Die Peroxygenase des Südlichen Ackerling (Agrocybe aegerita, AaeAPO) wurde gereinigt, ihr Katalysepotential ermittelt und ein allgemeiner Reaktionsmechanismus postuliert. Die AaeAPO katalysiert sowohl H2O2-abhängige Monooxygenierungen (Zwei-Elektron Oxidationen) wie (a) die Spaltung aliphatischer und aromatischer Ether, (b) die regio- und enantioselektive Hydroxylierung von Aromaten, (c) die schrittweise Monooxygenierung von Toluolderivaten, (d) die N-Dealkylierung sekundärer Amine und (e) die Dehalogenierung chlorierter Aliphaten als auch typische Reaktionen bekannter Peroxidasen (vermutlich Ein-Elektron-Oxidation) unter anderem (f) die Oxidation/ Polymerisierung von Phenolen und (g) die Halogenierung von Aromaten. Polymere Verbindungen wie Polyethylenglycol (PEG) werden nicht oxidiert. Mechanistische Untersuchungen zur Etherspaltung am Beispiel der AaeAPO haben Einblick in den generellen Reaktionsmechanismus dieses neuen Enzymtyps ermöglicht: (1) die Stöchiometrie der Spaltung von Tetrahydrofuran entspricht der einer zwei-Elektron-Oxidation, (2) die Spaltung von Methyl-3,4-Dimethoxybenzylether zu 4-Dimethoxybenzaldehyd und Methanol ergaben parallele Verläufe für die ermittelten Ausgleichsgeraden in der doppelt reziproken Darstellung, was einem „Ping-Pong“-Reaktionsmechanismus entspricht (3) die Monooxygenierungen haben stets den Einbau eines aus dem Peroxid (H2O2) stammenden Sauerstoffatoms in das Produkt zur Folge, (4) die O-Dealkylierung von 1-Methoxy-4-Trideuterummethoxybenzol zeigt einen ausgeprägten Deuterium Isotopen Effekt, was auf die primäre Abspaltung eines Wasserstoffatoms vom Substratmolekül hindeutet. Demnach verläuft die Peroxygenase-katalysierte Monooxygenierung über Wasserstoffabstraktion und eine unmittelbar anschließende Sauerstoffrückbindung (hydrogen abstraction - oxygen rebound mechanism). Diese Reaktionsabfolge ähnelt dem sogenannten peroxide "shunt" pathway, der von einer Reihe Cytochrom-P450-abhängiger Monooxygenasen her bekannt ist. Die physiologische Funktion der AaeAPO besteht möglicherweise in der extrazellulären Transformation und Detoxifikation niedermolekularer Pflanzeninhaltsstoffe, mikrobieller Metabolite und anthropogener Xenobiotika. Aufgrund der Stabilität und Unabhängigkeit der AaeAPO von teuren Kofaktoren ergeben sich vielversprechende biotechnologische Möglichkeiten zum Einsatz isolierter Biokatalysatoren in selektiven (bio)chemischen Synthesen monooxygenierter Metabolite.

Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe. / For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats.

Die enzymatischen Transformationen mit der pilzlichen Peroxygenase aus Agrocybe aegerita haben gezeigt, dass das Enzym insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide verfügt. Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert. Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO bei Flavonoiden läuft über eine Epoxidstufe ab, wobei der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen dem Wasserstoffperoxid entstammt (Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion). Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen gehemmt. Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der Extraktzugabe beobachtet werden. Der positive bzw. negative Einfluss auf die Enzymproduktion ist bei Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf das Lösungsmittel Ethanol zurückzuführen.

Enzymatic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) and its oxidized derivatives was studied using three fungal enzymes: wild-type aryl alcohol oxidase (AAO) from three fungal species, wild-type peroxygenase from Agrocybe aegerita (AaeUPO), and recombinant galactose oxidase (GAO). The effect of pH on different reaction steps was evaluated and apparent kinetic data (Michaelis-Menten constants, turnover numbers, specific constants) were calculated for different enzyme-substrate ratios and enzyme combinations. Finally, the target product, 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA), was prepared in a multi-enzyme cascade reaction combining three fungal oxidoreductases at micro-scale. Furthermore, an oxidase-like reaction is proposed for heme-containing peroxidases, such as UPO, horseradish peroxidase, or catalase, causing the conversion of 5-formyl-2-furancarboxylic acid into FDCA in the absence of exogenous hydrogen peroxide.

Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe.:Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 5 2. Theoretische Grundlagen 7 2.1. Hämperoxidasen 7 2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7 2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10 2.1.3. Systematik 16 2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36 2.3. DyP-type-Peroxidasen 38 3. Anliegen der Arbeit 41 4. Material und Methoden 43 4.1. Organismen 43 4.2. Chemikalien 53 4.3. Methoden 55 4.3.1. Kultivierung 55 4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56 4.3.3. PCR 57 4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62 4.3.5. Protein-Sequenzierung 62 4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63 4.3.7. Genomsequenzierungen 73 4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76 4.3.9. Phylogenetische Analysen 77 4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79 4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80 4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83 4.3.13. SDS-PAGE 83 4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83 4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85 4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium 89 5. Ergebnisse 91 5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91 5.1.1. Sequenzen 91 5.1.2. Phylogenetische Analyse 110 5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113 5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116 5.2. DyP-type-Peroxidasen 126 5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126 5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130 5.2.3. Phylogenetische Analyse 135 5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137 5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142 6. Diskussion 143 6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143 6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144 6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 147 6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150 6.2.3. Biologische Funktion 152 6.2.4. Phylogenetik 154 6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159 6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165 6.3. DyP-type-Peroxidasen 166 6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166 6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168 6.3.3. Biologische Funktion 168 6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169 6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170 6.3.6. Heterologe Expression 171 7. Ausblick 173 8. Thesen 177 Literaturverzeichnis 179 A. Peptidsequenzen 225 B. Genspezifische Oligonukleotide 231 C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241 D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255 E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261 F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267 G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271 H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275 I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283 J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285 K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289 L. Publikationen 293 Danksagung 371 Rechtliche Erklärungen 373 / For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats.:Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 5 2. Theoretische Grundlagen 7 2.1. Hämperoxidasen 7 2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7 2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10 2.1.3. Systematik 16 2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36 2.3. DyP-type-Peroxidasen 38 3. Anliegen der Arbeit 41 4. Material und Methoden 43 4.1. Organismen 43 4.2. Chemikalien 53 4.3. Methoden 55 4.3.1. Kultivierung 55 4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56 4.3.3. PCR 57 4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62 4.3.5. Protein-Sequenzierung 62 4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63 4.3.7. Genomsequenzierungen 73 4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76 4.3.9. Phylogenetische Analysen 77 4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79 4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80 4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83 4.3.13. SDS-PAGE 83 4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83 4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85 4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium 89 5. Ergebnisse 91 5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91 5.1.1. Sequenzen 91 5.1.2. Phylogenetische Analyse 110 5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113 5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116 5.2. DyP-type-Peroxidasen 126 5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126 5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130 5.2.3. Phylogenetische Analyse 135 5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137 5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142 6. Diskussion 143 6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143 6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144 6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 147 6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150 6.2.3. Biologische Funktion 152 6.2.4. Phylogenetik 154 6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159 6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165 6.3. DyP-type-Peroxidasen 166 6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166 6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168 6.3.3. Biologische Funktion 168 6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169 6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170 6.3.6. Heterologe Expression 171 7. Ausblick 173 8. Thesen 177 Literaturverzeichnis 179 A. Peptidsequenzen 225 B. Genspezifische Oligonukleotide 231 C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241 D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255 E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261 F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267 G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271 H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275 I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283 J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285 K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289 L. Publikationen 293 Danksagung 371 Rechtliche Erklärungen 373

Die enzymatischen Transformationen mit der pilzlichen Peroxygenase aus Agrocybe aegerita haben gezeigt, dass das Enzym insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide verfügt. Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert. Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO bei Flavonoiden läuft über eine Epoxidstufe ab, wobei der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen dem Wasserstoffperoxid entstammt (Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion). Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen gehemmt. Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der Extraktzugabe beobachtet werden. Der positive bzw. negative Einfluss auf die Enzymproduktion ist bei Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf das Lösungsmittel Ethanol zurückzuführen.

Enzymatic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) and its oxidized derivatives was studied using three fungal enzymes: wild-type aryl alcohol oxidase (AAO) from three fungal species, wild-type peroxygenase from Agrocybe aegerita (AaeUPO), and recombinant galactose oxidase (GAO). The effect of pH on different reaction steps was evaluated and apparent kinetic data (Michaelis-Menten constants, turnover numbers, specific constants) were calculated for different enzyme-substrate ratios and enzyme combinations. Finally, the target product, 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA), was prepared in a multi-enzyme cascade reaction combining three fungal oxidoreductases at micro-scale. Furthermore, an oxidase-like reaction is proposed for heme-containing peroxidases, such as UPO, horseradish peroxidase, or catalase, causing the conversion of 5-formyl-2-furancarboxylic acid into FDCA in the absence of exogenous hydrogen peroxide.

Currently looking for alternative approaches to crop production which would be in accord with sustainable development. The present thesis was aimed on testing of organic cultivation of tomato (Solanum lycopersicum L.) and leek (Allium porrum L.) by using amendment with organic maize biomass (Zea mays L.), mycorrhizal fungi and saprotrophic fungi. The effects of different combinations of microbial inoculations on nitrogen uptake, plant growth and yield were investigated in greenhouse conditions. Supplied 15 N-labelled organic matter was separated from the root system by a nylon mesh which permitted only fungal hyphae to pass through but not plant roots. In the first year experiments the treatments differed in the presence or absence of three factors: organic matter, saprotrophic fungus Agrocybe sp. and mycorrhizal fungus Glomus mosseae (Nicolaj & Gerd.) Gerd. & Trappe. Plant inoculation with Agrocybe sp. alone or together with G. mosseae increased plant growth of tomato in the presence of organic matter. Tomato yield were not increased significantly. Shoot dry weight of leek increased when plants were treated with mycorrhizal fungus G. mosseae and organic matter. Microbial inoculation did not influence nitrogen (15 N) uptake from the organic source. In following experiments, all treatments contained...