Le chien présente de nombreuses maladies génétiques dont les rétinopathies auxquelles je me suis intéressée. Historiquement, l’homme a appliqué aux chiens une sélection artificielle extrêmement forte, créant ainsi près de 400 races répondant à des besoins spécifiques. En uniformisant ainsi de nombreux traits phénotypiques et comportementaux, l’homme a sélectionné les allèles recherchés mais a également concentré involontairement des allèles délétères responsables de maladies génétiques. Ces maladies étant pour beaucoup cliniquement et génétiquement similaires aux maladies humaines, le chien constitue alors un modèle de choix pour en rechercher les bases génétiques et développer de nouvelles thérapies pour un bénéfice mutuel pour l’homme et le chien. J’ai travaillé sur l’Atrophie Progressive de la Rétine (APR) dans deux races avec le concours du Dr Gilles Chaudieu et des clubs de race : le border collie et le berger picard. Concernant l’APR du border collie, les analyses réalisées avant mon arrivée avaient identifié un locus de 20Mb sur le chromosome X. J’ai tout d’abord mis à jour les données épidémiologiques et cliniques d’environ 500 chiens et poursuivi la collecte de prélèvements. Une analyse de liaison génétique pangénomique sur 130 chiens m’a permis de confirmer le mode de transmission et le locus. J’ai ensuite conduis plusieurs analyses génétiques (« homozygosity mapping », analyses des génotypes, séquençage de gènes candidats) sans pour autant réduire le locus ni identifier de mutation causale. Dans ce contexte et grâce à l’avènement des nouvelles technologies de séquençage, j’ai choisi de séquencer le génome complet de trois chiens atteints et deux porteurs apparentés. Ce travail m’a permis d’identifier 117variants dont 9 dans le locus d’intérêt, mais aucun dans des régions codantes. Je me suis donc focalisée sur les variants de régions régulatrices pour 13 gènes candidats. De plus, j’ai identifié cinq variants structuraux, encore en cours d’étude. Concernant l’APR du berger picard, nous avons relancé le projet par la collecte de prélèvements et la réalisation d’un pedigree de 154 chiens. Ce travail a amené à une collaboration tripartite internationale par le séquençage de deux chiens atteints et deux indemnes d’APR, dont les analyses sont en cours. Cette thèse m’a permis d’aborder la génétique d’une maladie génétique rare chez l’homme grâce à un modèle spontané original ; et même si ce travail n’a pas abouti à l’identification de mutations à ce jour, ces APR restent de bons modèles génétique et thérapeutique pour les rétinites pigmentaires humaines. / Dogs are affected by numerous genetic diseases including retinopathies, the subject of my thesis. Historically, humans have exerted a very strong artificial selection to dogs, thus creating some 400 breeds to perform specific tasks or to harbour specific traits. By such an homogenisation of phenotypic and behavioural traits, humans have selected desired alleles but also concentrated undesired deleterious alleles responsible of genetic diseases. These diseases are clinically and genetically similar to human genetic diseases, making dogs a model of choice to search for the genetic bases of such genetic diseases and to develop new therapies for a mutual benefit for dogs and humans. I worked on Progressive Retinal Atrophies (PRA) in two breeds, thanks to the contribution of the veterinary ophthalmologist Dr. Gilles Chaudieu and the breed clubs of border collies and berger picard. Concerning the border collie PRA, genetic analyses performed before my thesis allowed the identification of a locus of 20Mb on the X chromosome. I first completed and supplemented the epidemiological and clinical data for about 500 dogs and continued the sample and data collection. A first genetic linkage analysis on 130 dogs allowed to confirm the transmission mode and the locus. I then performed several genetic analyses (« homozigosity mapping », genotypes analyses, candidate gene sequencing) without significantly reducing the locus,neither finding the causal mutation, unfortunately. In this context and thanks to the development of new sequencing technologies, I chose to sequence the entire genome of three PRA affected border collies and two unaffected related dogs. This work allowed the identification of 117variants, 9 in the locus but none in coding regions. I thus focused my research on genetic variants from potential regulatory regions for 13 candidate genes. In addition, I identified five structural variants. The analysis of these variants is still ongoing. Concerning the berger picard PRA, we have re-initiated the project by collecting samples and designing a large pedigree of 154 dogs. This workled to an international collaboration by the sequencing of the entire genomes of 2 affected and 2 unaffected bergers picards for which the statistical analyses are ongoing. This thesis allowed me to work on the genetics of rare diseases in humans with a spontaneous and original animal model and even if thiswork has not yet reached the identification of the mutations, these two PRAs in these two breeds remain good genetic and therapeutic models for human RP RetinitisPigmentosa.

A presença de DNA fetal livre de células no plasma materno possibilitou o surgimento de novas tecnologias para o diagnóstico pré natal não invasivo. Existem técnicas de genotipagem fetal já estabelecidas em investigações de sequências exclusivas fetais, mas a sua aplicação para a identificação humana em testes de paternidade ainda é pouco conhecida. A metodologia de genotipagem fetal não invasiva foi padronizada com o uso de três lócus InDels e iniciadores inserção-específicos. Entretanto, para que se alcance o poder satisfatório, é necessário investigar elevado número de lócus informativos. Para suprir a ausência de informações suficientes sobre lócus deste tipo, são descritas, no presente trabalho, as condições laboratoriais para PCR e as frequências alélicas de um conjunto de lócus InDels, ainda inéditos, em uma amostra representativa da população urbana brasileira, visando aumentar a robustez e a confiabilidade da genotipagem fetal não invasiva na investigação de paternidade. Foram selecionados 20 lócus, um em cada cromossomo. Em um dos lócus polimórficos foi encontrado um alelo novo, não registrado no banco de dados do NCBI. O poder de discriminação e o poder de exclusão dos 16 lócus polimórficos combinados (0,999 e 0,937, respectivamente) tiveram valores dentro do esperado para um conjunto com essa quantidade de lócus bialélicos. Alguns lócus apresentaram elevado número de indivíduos que não responderam à amplificação, indicando a necessidade de reajustes na padronização dos procedimentos laboratoriais e a possibilidade de variabilidade das sequências complementares aos iniciadores empregados, o que exigirá o sequenciamento completo das regiões. Para a maioria dos lócus, entretanto, os parâmetros forenses atingiram valores esperados e sugerem que podem ser úteis na composição de painel robusto e eficiente para ser usado na genotipagem fetal não invasiva. / The presence of cell-free fetal DNA in maternal plasma allows for new non-invasive prenatal diagnosis technologies to develop. Even though there are already well-established fetal genotyping techniques in fetal-exclusive sequence investigations, their application to human identification in paternity tests is not yet well-known. Non-invasive fetal genotyping methodology was previously standardized using three InDel loci and insertion-specific primers. However, in order to attain satisfactory power, it is necessary to investigate large number of informative loci. To compensate for the absence of sufficient information about this type of locus, this work describes the PCR conditions and determinates allelic frequencies for a set of unpublished InDel loci, in a representative group of Brazilian population, raising the robustness and reliability of non-invasive fetal genotyping in paternity investigation. We selected 20 loci, one in each chromosome. Not previously registered on NCBI database allele was found in one of the polymorphic loci. Discrimination and exclusion power of the 16 polymorphic loci combined (0.999 and 0.937, respectively) had expected values for an ensemble with such an amount of biallelic loci. Some loci showed many non-amplified individuals, vincing the need of corrections in the standardizing process and the possible variability of the complementary sequences to the primers used. However, for most loci, the forensic parameters reached the expected values and suggest that they may be useful in the more robust panel for utilization in non-invasive fetal genotyping.

A presença de DNA fetal livre de células no plasma materno possibilitou o surgimento de novas tecnologias para o diagnóstico pré natal não invasivo. Existem técnicas de genotipagem fetal já estabelecidas em investigações de sequências exclusivas fetais, mas a sua aplicação para a identificação humana em testes de paternidade ainda é pouco conhecida. A metodologia de genotipagem fetal não invasiva foi padronizada com o uso de três lócus InDels e iniciadores inserção-específicos. Entretanto, para que se alcance o poder satisfatório, é necessário investigar elevado número de lócus informativos. Para suprir a ausência de informações suficientes sobre lócus deste tipo, são descritas, no presente trabalho, as condições laboratoriais para PCR e as frequências alélicas de um conjunto de lócus InDels, ainda inéditos, em uma amostra representativa da população urbana brasileira, visando aumentar a robustez e a confiabilidade da genotipagem fetal não invasiva na investigação de paternidade. Foram selecionados 20 lócus, um em cada cromossomo. Em um dos lócus polimórficos foi encontrado um alelo novo, não registrado no banco de dados do NCBI. O poder de discriminação e o poder de exclusão dos 16 lócus polimórficos combinados (0,999 e 0,937, respectivamente) tiveram valores dentro do esperado para um conjunto com essa quantidade de lócus bialélicos. Alguns lócus apresentaram elevado número de indivíduos que não responderam à amplificação, indicando a necessidade de reajustes na padronização dos procedimentos laboratoriais e a possibilidade de variabilidade das sequências complementares aos iniciadores empregados, o que exigirá o sequenciamento completo das regiões. Para a maioria dos lócus, entretanto, os parâmetros forenses atingiram valores esperados e sugerem que podem ser úteis na composição de painel robusto e eficiente para ser usado na genotipagem fetal não invasiva. / The presence of cell-free fetal DNA in maternal plasma allows for new non-invasive prenatal diagnosis technologies to develop. Even though there are already well-established fetal genotyping techniques in fetal-exclusive sequence investigations, their application to human identification in paternity tests is not yet well-known. Non-invasive fetal genotyping methodology was previously standardized using three InDel loci and insertion-specific primers. However, in order to attain satisfactory power, it is necessary to investigate large number of informative loci. To compensate for the absence of sufficient information about this type of locus, this work describes the PCR conditions and determinates allelic frequencies for a set of unpublished InDel loci, in a representative group of Brazilian population, raising the robustness and reliability of non-invasive fetal genotyping in paternity investigation. We selected 20 loci, one in each chromosome. Not previously registered on NCBI database allele was found in one of the polymorphic loci. Discrimination and exclusion power of the 16 polymorphic loci combined (0.999 and 0.937, respectively) had expected values for an ensemble with such an amount of biallelic loci. Some loci showed many non-amplified individuals, vincing the need of corrections in the standardizing process and the possible variability of the complementary sequences to the primers used. However, for most loci, the forensic parameters reached the expected values and suggest that they may be useful in the more robust panel for utilization in non-invasive fetal genotyping.

Made available in DSpace on 2016-08-19T18:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FABIO FRANCA SILVA.pdf: 387985 bytes, checksum: b614ae131f06a658fbdac4196b4d623c (MD5) Previous issue date: 2009-04-06 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / Recurrent spontaneous abortion (RSA) is defined as two or more consecutive spontaneous pregnancy losses before the 20th week of gestation, a situation that occurs in 1 to 2% of women in reproductive age. Genetic, anatomical, endocrine, infectious and immunologic factors through mechanisms that relate to the Major Histocompatibility Complex (MHC) and the presence of certain HLA (Human Leukocyte Antigens) are associated to RSA. HLA gene is located on the short arm of chromosome 6 between the 6p21.31 and 6p21.33 regions. This gene is inherited in haplotypes and expressed in codominance, having influence on modulation and induction of mother tolerance during the pregnancy. The aim of this study was to compare the allelic frequencies of HLA-A*, HLA-B* and HLA-DRB1* loci in women with and without RSA. It was a case-control study in 200 women (100 for each group) between 18 and 35 years of age. All samples were typified by the PCR-SSOP method (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotide Probes). The most frequent alleles observed in the group of women with and without RSA were: HLAA* 02 (56%) and (49%), HLA-DRB1*13 (31%) and (39%) respectively - there was no statistical significative difference when compared among the groups for this alleles; HLA-A*24 (12%) e (25%), (OR: 0.41; 95% CI: 0.18-0.92; p=0.028); HLA-A*34 (8%) e (1%), (OR: 8.61; 95% CI: 1.06-187.04; p=0.034); HLA-B*35 (16%) e (41%) (OR: 0.27; 95% CI: 0.13 0.56; p=0.0002). The most frequent haplotypes observed in the group of women with and without RSA were: A*02DRB1*16 (12%) e (2%) (OR: 6.68; 95% CI: 1.36 44.52; p=0.012) respectively. In this research, DRB1* locus in women with RSA was in linkage disequilibrium (p=0.01.). The high frequency of HLA-A*02 and HLA-DRB1*13 alleles in this study was due to the wide distribution of this allele in the population of Maranhão. HLA-A*24 e HLA-B*35 alleles were considered as a protection factor and HLA-A*34 allele was considered as a risk factor to RSA. The A*02DRB1*16 haplotype was the most frequent and considered as a risk factor to RSA. In order to confirm the observed results in this research, a study involving a higher sample size is necessary as well as genetic epidemiology researches to shed light on the role of HLA antigens and/or its connection to other genes as a risk factor. / Abortamento Espontâneo Recorrente (AER) caracteriza-se por duas ou mais perdas conceptuais espontâneas e consecutivas antes da 20ª semana de gestação, acometendo entre 1% e 2% das mulheres em idade reprodutiva. Fatores genéticos, anatômicos, endócrinos, infecciosos e imunológicos, por meio de mecanismos que relacionam o Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) e a frequência de determinados antígenos HLA (Antígeno Leucocitário Humano), estão associados ao AER. O gene HLA localiza-se no braço curto do cromossomo 6 entre as regiões 6p21.31 e 6p21.33, é herdado em bloco e expresso em co-dominância. O mesmo exerce uma grande influência na modulação e indução da tolerância materna durante a gestação. Esta pesquisa teve como objetivo verificar as frequências alélicas dos loci HLA-A*, -B* e - DRB1* em mulheres com e sem AER. Realizou-se um estudo caso-controle em 200 mulheres (100 para cada grupo), entre 18 e 35 anos de idade. Todas as amostras foram tipificadas pelo método PCR-SSOP (Reação em cadeia da Polimerase Sondas de Oligonucleotídios de Sequências Especificas). Os alelos mais frequentes tanto em mulheres com e sem AER foram, respectivamente: HLA-A*02 (56%) e (49%), HLADRB1* 13 (31%) e (39%)-embora sem resultado estatisticamente significante; HLAA* 24 (12%) e (25%), (OR: 0,41; 95% IC: 0,18-0,92; p=0,028); HLA-A*34 (8%) e (1%), (OR: 8,61; 95% IC: 1,06-187,04; p=0,034); HLA-B*35 (16%) e (41%) (OR: 0,27; 95% IC: 0,13 0,56; p=0,0002). Os haplótipos mais frequentes em mulheres com e sem AER foram, respectivamente: A*02DRB1*16 (12%) e (2%) (OR 6,68; 95% IC: 1,36 44,52; p=0,012). No presente estudo, apenas o locus DRB1* apresentou desequilíbrio de ligação significante (p=0,01) em mulheres com AER. A elevada frequência dos alelos HLA-A*02 e HLA-DRB1*13 é justificada pela ampla distribuição desses alelos na população maranhense. Os alelos HLA-A*24 e HLA-B*35 apresentaram-se como um fator de proteção e o alelo HLA-A*34 um fator de risco para AER. Para as associações haplotípicas, o haplótipo A*02DRB1*16 foi mais frequente em mulheres com AER, sendo um fator de risco para este grupo. Para a ratificação dos resultados deste trabalho, faz-se necessário aumentar o número amostral, bem como estudos de epidemiologia genética para o melhor entendimento do papel dos antígenos HLA e/ou sua ligação a outros genes como fator de risco para o AER.