Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Introducción: La odontogénesis es un proceso complejo, secuencial y altamente regulado en el que se forman estructuras calcificadas. Alteraciones en este proceso podrían dar lugar a diferentes tipos de enfermedades como alteraciones en el número de dientes y en la formación de esmalte, dentina y cemento. Otras lesiones que se pueden generar a partir de los tejidos remanentes de la odontogénesis son los tumores odontogénicos que derivan de tejido epitelial, ectomesenquimático y/o mesequimático presentando algunos de ellos matrices calcificadas. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia y distribución de amelogenina, citoqueratina AE1/AE3 (pan citoqueratina) y citoqueratina 14 en tumores odontogénicos, dientes con amelogénesis imperfecta hipocalcificada y gérmenes dentarios. Materiales y métodos: Con técnicas inmunohistoquímica se examinó la presencia y distribución de amelogenina, citoqueratina AE1/AE3 y citoqueratina 14 en: 11 odontomas, 11 tumores odontogénicos adenomatoides (TOA), tres tumores odontogénicos quístico calcificante (TOQC), 2 tumores odontogénicos epitelial calcificante (TOEC), 2 dientes con amelogénesis imperfecta hipocalcificada (AIHC) y 3 gérmenes dentarios en desarrollo. Los tumores odontogénicos fueron obtenidos del Instituto de Referencia de Patología Oral (IREPO) de la Facultad de Odontología de la Universidad de Chile entre los años 1988 y 2008. Resultados: Se detectó amelogenina en la matriz de esmalte de odontomas, de dientes con AIHC y de gérmenes dentarios. Esto también fue observado en matrices calcificadas rodeadas por epitelio en TOA y TOQC y en células fantasmas presentes en odontomas y TOQC. Las citoqueratinas fueron detectadas en las células epiteliales de gérmenes dentarios y tumores odontogénicos estudiados. No se observó la presencia de citoqueratinas en dientes con AIHC. Conclusiones: Las proteínas amelogenina, citoqueratina AE1/AE3 y citoqueratina 14 son identificables a través de técnicas inmunohistoquímicas en algunos tumores odontogénicos que forman matrices tipo esmalte originadas por epitelio odontogénico y en gérmenes dentarios en desarrollo

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-24 / Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina permitem investigações retrospectivas valiosas para estudos moleculares, especialmente em estudos genéticos, nos casos em que o DNA não se encontra disponível em amostras congeladas e/ou frescas. Entretanto, de acordo com alguns autores, é difícil obter um DNA de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação resulta na fragmentação dos ácidos nucleicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o DNA extraído de tecidos parafinados, após 1 e 5 anos de armazenamento, através de 3 métodos de extração. Para isso, foram utilizados o gene da β-actina (136pb), a fim de detectar a viabilidade e fragmentação do DNA extraído, e da amelogenina (X: 212pb e Y: 218pb) para diferenciação do sexo do indivíduo e viabilidade na utilização de primers com comprimento maior. O estudo envolveu 12 casos de autópsia recentes, onde amostras normais de fígado (n=10), baço (n=10) e cérebro (n=10) foram coletadas em duplicata, de modo que um grupo seguiu para o processo de fixação e inclusão em parafina, e outro grupo seguiu para o congelamento. Além disso, foram utilizados os mesmos tipos de tecidos, normais (n=10 cada), oriundos de 13 casos de autópsia armazenados por 1 ano e 15 casos armazenados por 5 anos. Após a remoção da parafina, as amostras foram submetidas às extrações com kit comercial (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out e fenol-clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado no aparelho Nanodrop® e ajustado para PCR (10ng/μl). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. As amostras de baço e fígado apresentaram maior rendimento em relação à extração de DNA quando comparado ao cérebro, em todos os tempos. Todas as amostras arquivadas apresentaram boas condições de extração de DNA, porém deve-se levar em consideração o processo de fixação e inclusão dos tecidos, que podem comprometer a qualidade do DNA. A extração pelo fenol rendeu maior quantidade de DNA e grau de pureza em relação aos outros métodos estudados, porém o kit comercial mostrou melhores resultados quanto à amplificação do DNA obtido. Houve amplificação do gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas, porém recomenda-se a utilização de primers menores para uma completa análise do fragmento a ser estudado. / Formalin fixed and paraffin embedded tissues provide valuable retrospective investigations for molecular studies, especially for genetic studies, when the DNA is not available in fresh and/or frozen samples. However, according to some authors, is difficult to obtain a DNA of good quality, since the fixation process results in nucleic acids fragmentation. The aim of this study was to evaluate the DNA extracted from paraffin embedded tissues, after 1 and 5 years of storage, by 3 methods of extraction. For this, the gene of β-actin (136pb) were used, to detect the viability and DNA fragmentation, and the gene of amelogenin (X: 212pb e Y: 218pb) for sexual differentiation and viability in primers with greater length. The study involved 12 recent autopsy cases, where samples of liver (n=10), spleen (n=10) and brain (n=10) were collected in duplicate, which one group followed to the process of fixation and inclusion and the other group followed to freezing. Moreover, the same kind of tissues, normal (n=10 each), from 13 autopsy cases archived for 1 year and 15 cases archived for 5 years were used. After paraffin remove, the samples were submitted to DNA extraction with commercial kit (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out and phenol-chlorophorm. The DNA extracted was quantified in Nanodrop® and adjusted for PCR (10ng/μl). The PCR products were visualized in agarose gel 1%. The samples of spleen and liver showed more yield in DNA extraction than the brain samples, in all the times. All the samples archived showed good extraction conditions, however should take in consideration the fixation and embedded process, which could compromise the DNA quality. The extraction by phenol-chloroform yielded more DNA quantity and purity than the other methods. However, the commercial kit extraction showed better results in DNA amplification. The primer of the gene of amelogenin was amplified in all utilized samples, however recommends the utilization of smaller primers for a complete analyze of the fragment studied. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EspiritoSanto_AlexandreRibeirodo_D.pdf: 9422040 bytes, checksum: 9034465ff462c933a4d9d5ab9721b610 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O esmalte envolve a porção coronária dos dentes e constitui a estrutura mais mineralizada do corpo vertebrado. Seu desenvolvimento tem início com secreção, processamento proteolítico e auto-agregação de uma complexa mistura de proteínas. O estabelecimento de uma matriz orgânica ordenada parece ser fundamental para a formação adequada da fase mineral do esmalte. Microscopia de luz polarizada mostra que a matriz orgânica do esmalte secretório (MOES) apresenta-se fortemente birrefringente em cortes não corados de 5 µm de espessura. Esta propriedade reflete alto grau de organização em nível molecular com possível relevância funcional. Alterações no brilho de birrefringência da MOES podem indicar desordens moleculares e estar associadas a alterações na formação da fase mineral. Atraso no processo de fixação da MOES pode levar a uma rápida perda de sua birrefringência, comprometendo o seu estudo por meio de microscopia de luz polarizada. No presente trabalho, analisaram-se os efeitos do nocauteamento dos genes Amelx e Mmp20 (experimento 1), dos bisfosfonatos (experimento 2) e de inibidores de serina proteinases e metaloproteinases (experimento 3) sobre a birrefringência da MOES. O experimento 1 mostrou quecamundongos fêmeas Amelx+/- apresentam redução significativa no brilho debirrefringência quando comparados aos animais Amelx+/+ do mesmo gênero (p=0,0029). A MOES dos camundongos fêmeas Amelx-/- não exibiu birrefringência. Os camundongos Mmp20-/- mostraram uma expressiva diminuição nos valores de retardo ótico em comparação aos camundongos Mmp20+/+ e Mmp20+/- (p=0,0000). Os animais Mmp20+/+ e Mmp20+/- apresentaram birrefringência semelhante (p=1,0000). O experimento 2 mostrou que ratos tratados com alendronato de sódio não apresentam alterações morfológicas na MOES, mas exibem diminuiçãoexpressiva no brilho de birrefringência quando comparados a ratos controles (p<0,01). Interessantemente, os ratos tratados com etidronato dissódico apresentaram alterações morfológicas severas na MOES, mas mostraram brilho de birrefringência na matriz secretada semelhante ao dos ratos controles (p>0,05). O experimento 3 mostrou que a fenantrolina (inibidora de metaloproteinases, como a Mmp20) e o fenilmetilsulfonil fluoreto (inibidor de serina proteinases, como a Klk- 4) preservam a birrefringência da MOES ex vivo. Os resultados aqui apresentados sugerem que: 1) a birrefringência da MOES depende da organização supramolecular das amelogeninas e é influenciada pela atividade proteolítica da Mmp20; 2) o alendronato de sódio pode induzir alterações quantitativas na organização supramolecular da MOES; 3) o etidronato dissódico não altera a ordem molecular da matriz orgânica do esmalte secretada e pode induzir defeitos no esmalte maduro através de interferência direta sobre a atividade secretora dos ameloblastos; 4) a rápida perda de birrefringência da MOES em amostras não imediatamente fixadas é resultante da atividade de proteinases do esmalte. Palavras-chave: Esmalte dentário, Birrefringência, Bisfosfonatos, Fenantrolina, Fenilmetilsulfonil fluoreto / Abstract: Enamel covers dental crown and is the most mineralized structure in the vertebrate body. Its development begins with the secretion, processing and selfassembly of a complex mixture of proteins. The establishment of an ordered organic matrix seems to be a crucial step for the proper formation of enamel mineral phase. Polarizing microscopy shows that the secretory-stage enamel organic matrix (SEOM) is strongly birefringent in non-stained 5 µm-thick sections. This property indicates high level of molecular organization, which may be physiologically important. Changes in SEOM birefringence brightness may reflect molecular disorders and may be associated with alterations in the forming enamel mineral phase. Delay in fixation of SEOM may lead to rapid loss of birefringence, impairing analysis of that tissue with polarized light microscopy. In the present work, we analyzed the effects of Amelx and Mmp20 knocking out (experiment 1), bisphosphonates (experiment 2) and metallo and serine proteinases¿ inhibitors (experiment 3) on SEOM birefringence. Experiment 1 showed that Amelx+/- female mice exhibit a significant reduction in the birefringence brightness when compared to Amelx+/+ female animals. (p=0.0029). The SEOM from Amelx-/- female mice did not show birefringence. Mmp20-/- mice presented an expressive reduction in the optical retardation values in comparison to Mmp20+/+ and Mmp20+/- animals (p=0.0000). Mmp20+/+ and Mmp20+/- mice presented similar birefringence (p=1.0000). Experiment 2 showed that rats treated with sodium alendronate do not present morphological alterations in the SEOM, but exhibit significant decrease in the birefringence brightness when compared to control rats (p<0.01). Interestingly, bisodic etidronate rats showed severe morphological alterations in the SEOM, but exhibited SEOM birefringence brightness similar to that observed in control rats (p>0.05). Experiment 3 evidenced that 1,10-phenanthroline (metalloproteinase inhibitor) and phenylmethylsulphonyl fluoride (serine proteinase inhibitor) preserve SEOM birefringence brightness ex vivo. The results presented here support the following conclusions: 1) SEOM birefringence results from amelogenin supramolecular organization and is influenced by proteolytic activity of Mmp20; 2) sodium alendronate can induce quantitative changes in the supramolecular organization of the SEOM; 3) bisodic etidronate does not disturb molecular order of the secreted enamel organic matrix and may induce changes in mature enamel by affecting directly secretory activity of ameloblasts; 4) rapid loss of birefringence in no immediately fixed SEOM is caused by the activity of enamel proteinases. Key Words: Dental enamel, Birefringence, Bisphosphonates, Phenanthroline, Phenylmethylsulphonyl Fluoride / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutor em Biologia Buco-Dental