Antibióticos antimicrobianos são moléculas capazes de inibir o crescimento de microrganismos, na maioria, produtos naturais derivados de fungos ou bactérias que bloqueiam processos cruciais para a sobrevivência de microrganismos. A gentamicina é um aminoglicosídeo 4,6 bisubstituído que exerce papel importante no tratamento de infecções graves causadas por bactérias gram-negativas; apresenta uma complexa e pouco entendida rota de biossíntese. Dessa via, a desidrogenase GenD2 e a aminotransferase GenS2 atuam sobre a posição C3 da gentamicina A2 produzindo gentamicina X2, e a GenB2 atua na posição C6 epimerizando a molécula de gentamicina C2a. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade e por exclusão de tamanho, no tampão composto por 50 mM de Tris HCl, 100 mM de NaCl pH 7,7. Com a intenção de compreender a rota de biossíntese da gentamicina, o objetivo deste trabalho foi estudar estruturalmente as enzimas GenD2, GenS2 e GenB2 em complexo com seus cofatores e ligantes. Cristais da enzima GenD2 difrataram, porém não foi possível determinar sua estrutura, análises biofísicas através de calorimetria de titulação isotérmica e por gel filtração analítica, puderam confirmar seu cofator, o NAD+, e um estado oligomérico compatível à um tetrâmero em solução. A enzima GenB2 em complexo com o cofator PMP e gentamicina X2 difratou a uma resolução de 1,7 Å e foi resolvida por substituição molecular, na qual foi identificada uma molécula na unidade assimétrica pertencente ao grupo espacial C 2 2 21. Essa enzima é um homodímero, seu sítio de ligação está na interface entre os protômeros com contribuições de resíduos de ambas as moléculas. A região onde se encontra o anel pirimidínico do PMP é carregada positivamente, favorecendo a interação com o cofator. A cavidade onde se encontra posicionada a gentamicina X2, é bastante ampla e eletronegativa, por seu substrato ser um aminoglicosídeo. A lisina 227 é o resíduo que realiza a clássica base de Schiff, presente em enzimas PLP/PMP dependentes, entre o anel pirimidínico do PMP e a tirosina 124. Os avanços promissores sobre a GenD2 e a compreensão estrutural da GenB2 auxiliam no entendimento da via de biossíntese de gentamicina bem como contribuem para o crescente entendimento sobre o enovelamento de enzimas PLP dependentes. / Antimicrobial antibiotics are molecules capable of inhibiting the growth of microorganisms, most of them are natural products derived from fungi or bacteria that block some crucial processes to the survival of microorganisms. Gentamicin is a 4,6 disubstituted aminoglycoside that plays an important role in the treatment of severe infections caused by gram-negative bacteria. This aminoglycoside presents a complex and poorly understood biosynthesis route. From this route, GenD2 dehydrogenase and GenS2 aminotransferase have been identified to act at C3 position of gentamicin A2 producing gentamicin X2, and the enzyme GenB2 acts at the C6 position, epimerizing the gentamicin C2a molecule. These enzymes were purified by immobilized metal ion affinity and size exclusion chromatography in a buffer composed of 50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl pH 7,7. In order to understand the route of gentamicin biosynthesis, this work aims to study the enzymes GenD2, GenS2 and GenB2 in complex with their cofactors and ligands. Some crystals of GenD2 diffracted, however it was not possible to determine its structure. Biophysical analysis by isothermal titration calorimetry and analytical gel filtration; confirmed NAD+ as its cofactor, and an oligomeric state compatible with a tetramer in solution. GenB2 crystals in complex with PMP cofactor and gentamicin X2 diffracted at a resolution of 1.7 Å and its structure was resolved by molecular replacement, which presented one molecule in the asymmetric unit belonging to the space group C 2 2 21. This enzyme is a homodimer, the binding site is located at the interface between protomers and residues from both molecules contribute toward the formation of the active site. The region where the PMP pyrimidine ring is located is positively charged, favoring the interaction with the cofactor. The active site cavity, where gentamicin X2 is positioned, is a large groove and predominantly electronegative, compatible with the substrate of the enzyme, which is an aminoglycoside. Lysine 227 is the key residue that performs the classical Schiff base, commonly present in PLP/PMP dependent enzymes, between the PMP pyrimidine ring and tyrosine 124. Promising advances on GenD2 and the structural understanding of GenB2 aids in the understanding of the gentamicin biosynthetic pathway as well as contribute towards the knowledge about the folding of PLP dependent enzymes.