abstract: Intraoperative diagnosis in neurosurgery has traditionally relied on frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded section analysis of biopsied tissue samples. Although this technique is considered to be the “gold standard” for establishing a histopathologic diagnosis, it entails a number of significant limitations such as invasiveness and the time required for processing and interpreting the tissue. Rapid intraoperative diagnosis has become possible with a handheld confocal laser endomicroscopy (CLE) system. Combined with appropriate fluorescent stains or labels, CLE provides an imaging technique for real-time intraoperative visualization of histopathologic features of the suspected tumor and healthy tissues. This thesis scrutinizes CLE technology for its ability to provide real-time intraoperative in vivo and ex vivo visualization of histopathological features of the normal and tumor brain tissues. First, the optimal settings for CLE imaging are studied in an animal model along with a generational comparison of CLE performance. Second, the ability of CLE to discriminate uninjured normal brain, injured normal brain and tumor tissues is demonstrated. Third, CLE was used to investigate cerebral microvasculature and blood flow in normal and pathological conditions. Fourth, the feasibility of CLE for providing optical biopsies of brain tumors was established during the fluorescence-guided neurosurgical procedures. This study established the optimal workflow and confirmed the high specificity of the CLE optical biopsies. Fifth, the feasibility of CLE was established for endoscopic endonasal approaches and interrogation of pituitary tumor tissue. Finally, improved and prolonged near wide-field fluorescent visualization of brain tumor margins was demonstrated with a scanning fiber endoscopy and 5-aminolevulinic acid. These studies suggested a novel paradigm for neurosurgery-pathology workflow when the noninvasive intraoperative optical biopsies are used to interrogate the tissue and augment intraoperative decision making. Such optical biopsies could shorten the time for obtaining preliminary information on the histological composition of the tissue of interest and may lead to improved diagnostics and tumor resection. This work establishes a basis for future in vivo optical biopsy use in neurosurgery and planning of patient-related outcome studies. Future studies would lead to refinement and development of new confocal scanning technologies making noninvasive optical biopsy faster, convenient and more accurate. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Neuroscience 2020

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A cápsula endoscópica é um instrumento revolucionário, que permite a realização de um exame livre de desconfortos para o paciente e possibilitou a técnica de endoscopia chegar a partes do sistema gastrointestinal que antes não era possível, como grande parte do intestino delgado. Este trabalho apresenta um módulo fotônico para realizar Terapia Fotodinâmica (PDT, Photodynamic Therapy) em cápsulas endoscópicas. A PDT é uma forma de tratamento para lesões que envolve a administração prévia de um medicamento fotossensível (PS, Photosensitizer) e posterior ativação com irradiação de luz em um comprimento de onda (λ) específico. Geralmente para a ativação do PS utiliza-se λ na região vermelha do espectro visível, pois a penetração nos tecidos é elevada. Células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS, Adenocarcinoma Gastric of Stomach) foram preparadas com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) que é um Pró-fármaco precursor do agente fotossensível Protoporfirina IX (PpIX) com máximo de absorção nos 635 nm. Para realizar a irradiação com luz vermelha nas células, 16 LEDs do modelo LRQ396-P1Q2-1 da Osram Opto Semiconductors com dimensões muito reduzidas foram selecionados, caracterizados, montados em uma PCB (Printed Circuit Board) e alimentados por um Arduino Mega 2560. Este sistema de iluminação foi eficaz em seu propósito e causou morte celular nas células submetidas ao tratamento com o ALA em uma concentração de 2 milimol por litro e dose de luz em 5 Joules por centímetro quadrado que resulta em uma exposição de 49 minutos. Com o objetivo de se construir um módulo para controle de iluminação em cápsulas endoscópicas, foi desenvolvido em tecnologia CMOS 0.7 μm da ON Semiconductor um dispositivo capaz de controlar a intensidade dos LEDs utilizando PWM (Pulse Width Modulation). Unindo este componente com os LEDs selecionados é perfeitamente possível construir o módulo e inseri-lo CEs para realizar PDT em locais do trato gastrointestinal (GI) não acessíveis pela endoscopia convencional. / The endoscopic capsule is a revolutionary instrument that gives a free examination of discomforts for patient and allows the endoscopic technique to reach parts of the gastrointestinal system that were previously not possible, such as a large part of the small intestine. This work presents a photonic module to perform Photodynamic Therapy (PDT) in endoscopic capsules. PDT is a form of treatment for injuries involving prior administration of a photosensitive drug (PS, Photosensitizer) and subsequent activation with light irradiation at a specific wavelength (λ). Usually for PS activation, λ is used in the red region of the visible spectrum, because the tissue penetration is high. Human gastric adenocarcinoma cells (AGS) were prepared with 5-aminolevulinic Acid (5-ALA) which is a Pro-drug precursor of the photosensitive agent Protoporphyrin IX (PpIX) with maximum absorption at 635 nm. To perform red light irradiation on the cells, 16 LEDs, model LRQ396-P1Q2-1 of the Osram Opto Semiconductors with very small dimensions were selected, characterized, mounted on a PCB (Printed Circuit Board) and powered by an Arduino Mega 2560. This system was effective in its purpose and caused cell death in cells treated with ALA at a concentration of 2 mMol/L and dose of light at 5 J/cm² resulting in a 49 minutes exposure. With the objective of build a module for control of lighting in endoscopic capsules, a device able to controlling the intensity of the LEDs using PWM (Pulse Width Modulation) was developed in CMOS technology 0.7 μm of the ON Semiconductor. Combining this component with the selected LEDs, it is perfectly possible to construct the module and insert in CEs to perform PDT at sites of the gastrointestinal tract (GI) not accessible by conventional endoscopy.

O ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) é empregado como pró-fármaco, precursor de um agente fotossensibilizador na terapia fotodinâmica (TFD). Após a aplicação de 5-ALA topicamente, a incidência de luz visível de comprimento de onda apropriado induz a formação de uma substância altamente fluorescente e fotodinamicamente ativa, a Protoporfirina IX (PpIX).Todavia,devido a sua característica hidrofílica o 5-ALA apresenta reduzida penetração na epiderme e derme, limitando sua aplicação tópica. O presente trabalho apresenta o desenvolvimento de sistemas de veiculação nanoestruturados para o 5-ALA, visando maior penetração na pele e aumento da eficácia fotodinâmica. Além do 5-ALA, foram testados outros fármacos hidrofílicos, incluindo um anti-inflamatório, uma vitamina e um anti-microbiano, para validação do sistema de liberação controlada e ação sítio-específica. Foi realizado um estudo de desenvolvimento de formulação e processo para obtenção dos nanocarreadores placebo e posterior incorporação dos fámacos, além da caracterização completa dos sistemas obtidos, resultando no depósito de uma patente dos novos sistemas: Nanocarreadores Poliméricos Coloidais. Como principais resultados deste trabalho destaca-se a obtenção de sistemas em escala nanométrica, com alta eficiência de encapsulação e perfil de liberação controlado, além dos nanocarreadores proporcionarem o aumento da permeação cutânea e ação sítio específica dos fármacos, seja na célula cancerígena ou mesmo na lesão causada por microorganismos. A relevância deste trabalho baseou-se na necessidade de um tratamento prático, altamente seletivo e moderno, que seja otimizado mediante a administração do pró-farmaco 5-ALA em sistemas de liberação apropriados, pois a barreira epidérmica do tecido canceroso constitui ainda uma limitação para a TFD tópica. / The 5-aminolevulinic acid (ALA) is a pro-drug, precursor of a photossensitizer agent employed in the photodynamic therapy (PDT). The topical application of ALA combined with the visible light irradiation in an appropiate wavelenght, promove the yielding of a highly fluorescent and photodynamically active agent, the protophoriryn IX (PpIX). However, due to its hydrophilic propertie 5-ALA has reduced penetration of the epidermis and dermis, limiting its topical application. This work presents the development of a nanostructured drug delivery system for ALA aiming to increase the skin permeation and the photodynamic efficacy. Beyond 5-ALA, other hydrophilic drugs were tested, including an anti-inflammatory, a vitamin and an anti-microbial drug to validate the controlled release and site-specific action. A study was performed to develop the composition and the process of preparation of the unload-nanocarriers and subsequent incorporation of drugs, besides a complete characterization of the nanocarriers, resulting in a patent application of the new systems: Colloidal Polymeric Nanocarriers. As the main results of this study can be highlighted the achievement of nanometer-scale system with high efficiency of encapsulation and controlled release profile, in addition to providing increased permeation and site-specific action of drugs, whether in the cancer cell or even in the lesion caused by microorganisms. The relevancy of this work is based on the necessity of a practical, sophisticated and selective treatment through the administration of the prodrug ALA using a suitable drug delivery system, because the epidermal barrier of the cancerous tissue is still a main limitation for topical PDT.

A administração tópica do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) tem se destacado na Terapia Fotodinâmica (TFD) do câncer de pele pela eficiência no tratamento de tumores e pelos reduzidos efeitos colaterais fototóxicos. Entretanto, esta eficácia é limitada devido à baixa penetração do 5-ALA na pele. Uma proposta para aumentar a penetração do 5-ALA na pele é a utilização de promotores de absorção cutânea, que visam alterar a barreira cutânea para várias moléculas bioativas. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento farmacotécnico de formulações contendo ácido oléico (AO) como promotor de absorção cutânea, visando o aumento da penetração cutânea do 5-ALA para a TFD do câncer de pele. O fluxo in vitro de 5-ALA das formulações contendo AO (10%) foi significativamente aumentado após 12 horas de experimento, em relação às formulações sem AO, principalmente para os grupos contendo 5% e 10% de 5-ALA. A retenção no estrato córneo (EC) e na[epiderme + derme] sem EC também aumentou significativamente, mostrando um efeito promotor do AO. Foram também realizados experimentos in vivo em camundongos, com o intuito de analisar o efeito da formulação sobre a produção e o acúmulo in vivo de protoporfirina IX (PpIX) na pele. Observou-se que a presença do promotor de absorção aumentou significativamente a quantidade de PpIX extraída da pele comparado às formulações sem este aditivo. Para visualizar a presença de PpIX no tecido, realizou-se microscopia confocal das peles de animais tratados com as formulações. As imagens foram condizentes com os experimentos in vivo, observando-se um aumento da intensidade de fluorescência nas amostras de pele que foram tratadas com as formulações contendo AO. Os resultados in vitro e in vivo mostraram a potencialidade das formulações contendo AO como promotor de absorção cutânea na liberação do 5-ALA na TFD do câncer de pele. / The topical administration of 5-ALA has been distinguished on skin cancer photodynamic therapy (PDT) because of its efficiency in the treatment of tumors and the reduced phototoxic collateral effects. However, this effectiveness is limited by its low penetration in the skin. A proposal to optimize the 5-ALA penetration in the skin is the use of cutaneous penetration enhancers, which seek to alter the cutaneous barrier for many bioactive molecules. The aim of this work was the pharmaceutical development of formulations containing oleic acid (OA) as a cutaneous penetration enhancer, seeking the increase of the cutaneous penetration of 5-ALA for skin cancer PDT. The in vitro flux of 5-ALA from formulations containing OA (10% w/w) was significantly increased after 12 hours of experiment, in comparison with formulations without OA, mainly for the groups containing 5% and 10% of 5-ALA. The stratum corneum (SC) and [epidermis + dermis] without SC retention were also significantly increased, showing an enhancer effect of the fatty acid. In addition, in vivo experiments were accomplished in mice, with the purpose of analyzing the formulation effect on the PpIX production and accumulation in the skin. It was observed that the penetration enhancer\'s presence significantly increased the amount of PpIX extracted from the skin, in contrast with formulations without this addition. To visualize the PpIX presence in the tissue, confocal microscopy of the treated animal skins was made. The images were suitable with the in vivo experiments, with increased intensity of fluorescence in the tissue samples that were treated with formulations containing OA. Both in vitro and in vivo results showed the potentiality of the formulations containing OA as a cutaneous penetration enhancer for 5-ALA delivery on the skin cancer PDT.

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease, which affects 0.5–1.0 % of adults. The aim of this thesis is to study accumulation and localization of endogenous porphyrins by means of spectroscopy and microscopy in experimental rheumatoid arthritis model and postoperative samples of patients after application of 5-aminolevulinic acid or its methyl ester. The spectroscopic measurements of endogenous porphyrins were performed in synoviocytes, chondrons and cartilage explants of patients with RA or osteoarthritis (OA) and in rabbit antigen induced arthritis model. The localization of endogenous porphyrins in synovium and cartilage tissues of rabbit knee joints was determined based on fluorescence spectroscopy, fluorescence intensity and lifetime microscopy, and histology imaging results. Studies showed that selective sensitization of inflamed synovium in the in vitro model may be achieved using ALA and ALA-Me, while in the in vivo model only using ALA-Me. The photosensitizer protoporphyrin IX induced by these precursors is accumulated in the cells of synovium and cartilage tissues. The results presented in this dissertation can be used anticipating to apply the sensitization with endogenous porphyrins for diagnostic and therapeutic purposes in the case of rheumatoid arthritis. / Reumatoidinis artritas (RA) yra autoimuninė liga, kuria pasaulyje serga 0,5-1 % suaugusių žmonių. Disertacijos tikslas – spektroskopiniais ir mikroskopiniais metodais ištirti endogeninių porfirinų susikaupimą ir pasiskirstymą eksperimentinio reumatoidinio artrito modelyje ir pacientų pooperacinėje medžiagoje po 5-aminolevulininės rūgšties (ALA) ar jos metilo esterio (ALA-Me) panaudojimo. Atlikti endogeninių porfirinų fluorescencinės spektroskopijos tyrimai RA ir osteoartritu sergančių (OA) pacientų sinoviocituose, chondronuose ir kremzlės bandiniuose bei triušių antigenu indukuotame artrito modelyje. Endogeninių porfirinų lokalizacija triušių kelio sąnario kremzlės ir sinovijos audiniuose nustatyta remiantis fluorescencinės spektroskopijos, fluorescencijos intensyvumo ir gyvavimo trukmių mikroskopijos bei histologinių vaizdų analizės rezultatais. Tyrimais nustatyta, kad selektyviai sensibilizuoti uždegiminę sinoviją modelyje in vitro galima naudojant ALA bei ALA-Me, o modelyje in vivo tik ALA-Me. Šių pirmtakų indukuotas fotosensibilizatorius protoporfirinas IX yra susikaupęs sinovijos ir kremzlės audinių ląstelėse. Disertaciniame darbe pristatomų tyrimų rezultatai gali būti panaudoti norint ateityje endogeniniais porfirinais pagrįstą sensibilizaciją pritaikyti diagnostikos ir terapijos tikslais reumatoidinio artrito atveju.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-28 / INTRODUÇÃO: Rejuvenescimento fotodinâmico refere-se ao tratamento do fotoenvelhecimento e das queratoses actínicas. OBJETIVO: Avaliar a eficácia da terapia fotodinâmica com ácido aminolevulínico a 20% (ALA) ¾ tópico e luz intensa pulsada no tratamento das queratoses actínicas e do fotoenvelhecimento facial. MÉTODOS: Quarenta e três pacientes com idade média 71,3 anos, fototipos de pele I e IV divididos em: Controle (aplicação LIP/18J); Tratamento-I (ALA incubado por duas horas; ativado por duas passagens de LIP/16J); Tratamento-II (ALA; duas passagens de LIP/18J), foram avaliados por dois observadores, clínica e fotograficamente, no Pré, 48 horas, 8 e 12 semanas após, pela escala de Griffiths. Cinco queratoses actínicas foram marcadas como alvo para contagem no Pós- Tratamento, sendo uma submetida à biopsia antes e depois do tratamento, para avaliação anatomopatológica de atipias e perda de polaridade. RESULTADOS: Testes não-paramétricos mostraram melhora significativa (rugas finas, alterações texturais, pigmentação irregular) nos Grupos-Tratamento-I/II. No Grupo Controle, significância apenas para alterações pigmentares. Queratoses actínicas tiveram redução maior nos Grupos II (68, 4%) e I (51,2%) em relação ao Controle (5%). Houve redução significativa da gravidade das atipias e perda de polaridade nos Grupos-TratamentoI/II em relação ao controle. CONCLUSÃO: A terapia fotodinâmica, com ácido 5aminolevulínico e luz intensa pulsada, mostrou-se efetiva no tratamento do fotoenvelhecimento e das queratoses actínicas faciais. O tratamento das queratoses actínicas foi mais efetivo com uso de maior energia. / BACKGROUND: Photodynamic rejuvenation is the term used to the treatment of actinic keratosis and photodamage with photodynamic therapy. OBJECTIVE: Evaluate the efficacy of photodynamic therapy with aminolevulinic acid and intense pulsed light in the treatment of actinic keratosis and photodamage. METHODS: Fourty three patients mean age 71,3 years, were randomized in three groups: Control (IPL 18J); Treatment I (ALA+ IPL 16J); and Treatment II ( ALA+ IPL 18J) and evaluated clinically an photographically by two observers in Pre, 48hs, 8 weeks and 12 weeks Post-Treatment using Griffth’s Photonumeric Scale. Five actinic keratosis were marked as target in Pre-Treatment and biopsies Pre and Post-Treatment were done in one lesion to evaluate atypias and loss of cellular polarity. RESULTS: Non parametric tests showed marked improvement in mottled pigmentation, texture fine wrinkles in Groups Treatment I and II. In Control Group improvement only in mottled pigmentation. Actinic Keratosis clearance in Groups Treatment I and II were 51,2% and 68,4% respectively, whereas in Group Control it was 5%. In relation to Control Group, Groups Treatment I and II showed significant reduction of atypias and improvement in loss of cellular polarity. CONCLUSIONS: Photodynamic therapy with aminolevulinic acid and intense pulsed light is effective in the treatment of photodamage and actinic keratosis. The resolution of actinic keratosis was better with higher levels of energy. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:05:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

A cápsula endoscópica é um instrumento revolucionário, que permite a realização de um exame livre de desconfortos para o paciente e possibilitou a técnica de endoscopia chegar a partes do sistema gastrointestinal que antes não era possível, como grande parte do intestino delgado. Este trabalho apresenta um módulo fotônico para realizar Terapia Fotodinâmica (PDT, Photodynamic Therapy) em cápsulas endoscópicas. A PDT é uma forma de tratamento para lesões que envolve a administração prévia de um medicamento fotossensível (PS, Photosensitizer) e posterior ativação com irradiação de luz em um comprimento de onda (λ) específico. Geralmente para a ativação do PS utiliza-se λ na região vermelha do espectro visível, pois a penetração nos tecidos é elevada. Células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS, Adenocarcinoma Gastric of Stomach) foram preparadas com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) que é um Pró-fármaco precursor do agente fotossensível Protoporfirina IX (PpIX) com máximo de absorção nos 635 nm. Para realizar a irradiação com luz vermelha nas células, 16 LEDs do modelo LRQ396-P1Q2-1 da Osram Opto Semiconductors com dimensões muito reduzidas foram selecionados, caracterizados, montados em uma PCB (Printed Circuit Board) e alimentados por um Arduino Mega 2560. Este sistema de iluminação foi eficaz em seu propósito e causou morte celular nas células submetidas ao tratamento com o ALA em uma concentração de 2 milimol por litro e dose de luz em 5 Joules por centímetro quadrado que resulta em uma exposição de 49 minutos. Com o objetivo de se construir um módulo para controle de iluminação em cápsulas endoscópicas, foi desenvolvido em tecnologia CMOS 0.7 μm da ON Semiconductor um dispositivo capaz de controlar a intensidade dos LEDs utilizando PWM (Pulse Width Modulation). Unindo este componente com os LEDs selecionados é perfeitamente possível construir o módulo e inseri-lo CEs para realizar PDT em locais do trato gastrointestinal (GI) não acessíveis pela endoscopia convencional. / The endoscopic capsule is a revolutionary instrument that gives a free examination of discomforts for patient and allows the endoscopic technique to reach parts of the gastrointestinal system that were previously not possible, such as a large part of the small intestine. This work presents a photonic module to perform Photodynamic Therapy (PDT) in endoscopic capsules. PDT is a form of treatment for injuries involving prior administration of a photosensitive drug (PS, Photosensitizer) and subsequent activation with light irradiation at a specific wavelength (λ). Usually for PS activation, λ is used in the red region of the visible spectrum, because the tissue penetration is high. Human gastric adenocarcinoma cells (AGS) were prepared with 5-aminolevulinic Acid (5-ALA) which is a Pro-drug precursor of the photosensitive agent Protoporphyrin IX (PpIX) with maximum absorption at 635 nm. To perform red light irradiation on the cells, 16 LEDs, model LRQ396-P1Q2-1 of the Osram Opto Semiconductors with very small dimensions were selected, characterized, mounted on a PCB (Printed Circuit Board) and powered by an Arduino Mega 2560. This system was effective in its purpose and caused cell death in cells treated with ALA at a concentration of 2 mMol/L and dose of light at 5 J/cm² resulting in a 49 minutes exposure. With the objective of build a module for control of lighting in endoscopic capsules, a device able to controlling the intensity of the LEDs using PWM (Pulse Width Modulation) was developed in CMOS technology 0.7 μm of the ON Semiconductor. Combining this component with the selected LEDs, it is perfectly possible to construct the module and insert in CEs to perform PDT at sites of the gastrointestinal tract (GI) not accessible by conventional endoscopy.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:05:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A comparação dos resultados obtidos utilizando-se uma única sessão de terapia fotodinâmica (PDT) com diodos emissores de luz (LEDs) de 630 nm no tratamento de carcinoma espinocelular (CEC) de gatos foi o objetivo principal do presente estudo, onde duas diferentes composições de precursores da protoporfirina IX (PPIX), o metil aminolevulinato (MEALA) e o ácido aminolevulínico (ALA) foram testados. Dezenove animais com um total de 24 lesões de CEC cutâneo confirmadas pelo estudo histopatológico foram distribuídos em dois grupos; o primeiro foi tratado com MEALA e o segundo com ALA. Pelos resultados negativos em testes sorológicos para detecção dos vírus da imunodeficiência felina (FIV) e vírus da leucemia felina (FeLV), não foi possível correlacionar a ocorrência dessas doenças virais com a incidência de CEC cutâneo nos gatos estudados. A temperatura da superfície cutânea, monitorada durante a PDT não apresentou aumento significativo (t < 3oC) nos dois grupos. Todos os animais foram submetidos a exame clínico e sanguíneo (hemograma e função hepato-renal) antes e após o tratamento, não havendo nenhuma alteração que inviabilizasse a inclusão dos mesmos no protocolo experimental e nem alterações atribuídas ao tratamento. A quantificação imunoistoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) foi realizada como um fator prognóstico do tratamento, porém, os resultados obtidos foram inconclusivos para esse fim. No grupo MEALA, de 10 lesões tratadas, 30% apresentaram respostas completas, 30% apresentaram respostas parciais, 20% apresentaram resposta mínima e em 20% dos casos não houve resposta ao tratamento. Já no grupo ALA foram tratadas 14 lesões, com 28,6% de resposta parcial, 50% de resposta mínima e 21,4% sem resposta. A PDT mostrou-se promissora no tratamento de CEC cutâneo de gatos dentro das condições estudadas, com melhores resultados quando realizada com o MEALA. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP