Thèse de doctorat : Médecine. Biologie cellulaire et moléculaire : Université de Nantes : 2006. / Bibliogr.

Les concentrations sous-inhibitrices (sub-CMI) de antibiotiques jouent un rôle important dans la sélection et le développement des résistances. Contrairement à Escherichia coli, Vibrio cholerae induit la réponse SOS en présence de sub-CMI d'aminosides. SOS est également impliquée dans la plasticité du génome et dans l'acquisition de la résistance aux antibiotiques. Afin de sélectionner des mutants de V. cholerae qui n'induisent pas SOS en présence de sub-CMI d'aminosides, nous avons développé un crible génétique pour l'isolement de mutants dans lesquels l'induction de la réponse SOS est perdue. L'un de ces mutants est inactivé pour le gène radD, qui code pour une hélicase ADN/ARN putative. RadD est impliquée dans la résolution de cassures d'ADN double brin (DSB) provoquées par des sub-CMI de tobramycine. Nous avons montré que les R-loops sont à l'origine des DSB formés en absence de radD en tobramycine. Nous suggérons que les lésions de l'ADN formées lors du traitement par aminoglycosides soient réparées par la formation d'intermédiaires ssDNA induisant SOS. L’ARNPol bloquée sur ces lésions peut faciliter la formation de R-loops qui, si elles ne sont pas réparées, peuvent entraîner la formation de DSB et l'instabilité du génome. RadD pourrait jouer un rôle dans la résolution des R-loops. Ces résultats ont mis en évidence le fait que les sub-CMI de tobramycine conduisent à DSB, dues en partie aux R-loops. La tobramycine est un aminoside qui cible le ribosome. La formation de DSB par un tel antibiotique peut être surprenante car la formation de lésions de l'ADN par un antibiotique qui cible la traduction n'est pas attendue. Afin de comprendre les voies impliquées dans la réponse à de sub-CMI de tobramycine, nous avons adopté une approche Tn-seq à haut débit pour déterminer quels gènes sont importants pour maintenir l'intégrité de la cellule en présence d'antibiotiques à faibles doses. / Sub-inhibitory concentrations (sub-MIC) of antibiotics play an important role in selection and development of resistances. Unlike Escherichia coli, Vibrio cholerae induces its SOS response in presence of sub-MIC aminoglycosides. SOS is also involved in genome plasticity and in the acquisition of resistance to antibiotics. In order to select for V. cholerae mutants that do not induce low aminoglycoside-mediated SOS induction, we developed a genetic screen for the isolation of mutants in which induction of the SOS response by sub-MICs of aminoglycosides is lost. One of these mutants is inactivated for the radD gene, which encodes a putative DNA/RNA helicase. RadD is involved in the resolution of double strand DNA breaks caused by treatment with sub-MIC of tobramycine. We demonstrate that R-loops are at the origin of DSBs formed in the absence of radD in tobramycine.We propose that DNA lesions formed upon aminoglycoside treatment are repaired through the formation of ssDNA intermediates, inducing SOS. RNAP could stalls on these lesions and forms R-loops, that, if not repaired, can lead to the formation of DSB and genome instability. RadD could play a role in the resolution of R-loops. These results highlighted the fact that sub-MIC of tobramycine leads to DNA double strand breaks, at least partly through R-loop formation. Tobramycin is an aminoglycoside that targets the ribosome. The formation of DSBs by such an antibiotic can be surprising as DNA damage formation by an antibiotic that targets translation is not expected. In order to understand the pathways involved in the response to low doses of tobramycin we adopted a high throughput Tn-seq approach to determine which genes are important in maintaining the integrity of the cell in the presence of antibiotics at low doses.

Achromobacter xylosoxidans est un bacille à Gram négatif non fermentaire pathogène opportuniste. Il est de plus en plus fréquemment isolé chez les patients atteints de mucoviscidose, colonisant leur arbre bronchique et pouvant être responsable d’une dégradation de la fonction respiratoire. Il s’agit d’une espèce bactérienne naturellement résistante à de nombreux antibiotiques : aux céphalosporines (hors ceftazidime), à l’aztréonam et aux aminosides. Les résistances acquises sont fréquentes, en particulier dans les souches isolées d’expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Ces résistances acquises concernent des molécules antibiotiques très utilisées pour le traitement des exacerbations respiratoires de la maladie, ce qui conduit parfois à de véritables impasses thérapeutiques. Au début de notre travail, seuls quelques mécanismes de résistance acquise aux β-lactamines avaient été décrits, mais aucun mécanisme impliqué dans la multi-résistance naturelle d’A. xylosoxidans.La résistance aux antibiotiques par efflux actif de type Resistance-Nodulation-cell Division (RND) est très répandue chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires. Nous avons identifié dans le génome d’A. xylosoxidans trois opérons pouvant coder pour des systèmes d’efflux RND. Par une technique d’inactivation génique nous avons montré que les trois systèmes d’efflux (AxyABM, AxyXY-OprZ et AxyCDJ) pouvaient exporter des antibiotiques. Deux d’entre eux participent à l’antibio-résistance naturelle d’A. xylosoxidans : AxyABM (résistance à l’aztréonam et à plusieurs céphalosporines) et AxyXY-OprZ (résistance aux aminosides) / Achromobacter xylosoxidans is a nonfermentative Gram-negative bacillus considered to be an opportunistic agent. It is an emerging pathogen in cystic fibrosis (CF), increasingly recovered from the respiratory tract of CF patients. It can cause inflammation and therefore might be involved in the decline of the lung function.This species is innately resistant to many antibiotics, including cephalosporins (except ceftazidime), aztreonam, and aminoglycosides. Moreover the isolates recovered from CF patient sputum are often resistant to major antimicrobial components usually prescribed to treat pulmonary infections. There was very little known about acquired resistance and nothing about innate resistance mechanisms when we started this work.Antibiotic resistance mediated by Resistance-Nodulation-cell Division (RND)-type efflux pumps is widespread among nonfermentative Gram-negative bacilli. We have characterized three putative RND operons in A. xylosoxidans genome. By using a gene inactivation technique we have demonstrated that these operons encode efflux systems (AxyABM, AxyXY-OprZ and AxyCDJ) able to export antibiotics. Two of them are strongly involved in A. xylosoxidans innate antibiotic resistance: AxyABM (resistance to aztreonam and various cephalosporins) and AxyXY-OprZ (aminoglycoside resistance).

L’émergence des déterminants de résistances plasmidiques aux quinolones (PMQR), auxquels appartient le gène qnrD, participent de manière significative à la sélection des résistances de haut-niveau aux permet les réparations de l’ADN lors des stress soumis aux bactéries, et d’autre part, que les aminosides, une autre classe d’antibiotiques que les fluoroquinolones, induisaient la réponse SOS chez Escherichia coli. En effet, nous avons montré que les petits plasmides-qnrD chez E. coli, induisent la formation de monoxyde de nitrogène et l’inhibition de la voie de détoxification Hmp-dépendante. Ces processus génèrent des lésions à l’ADN qui s’ajoutent à celles occasionnées par les aminosides concourant à activer la réponse SOS chez E. coli. L’ensemble de nos résultats montrent que l’émergence de la résistance aux fluoroquinolones peut être occasionnée par l’exposition d’E. coli à une autre classe d’antibiotiques, ici les aminosides. / The emerging plasmid-mediated quinolones resistance (PMQR) determinants significantly participate in the selection of high-level of resistance to the major antibiotics fluoroquinolones, leading to numerous clinical failures. In this study, we reported for the first time that PMQR expression could be triggered by the fluoroquinolones but also by another major class of antibiotics, the aminoglycosides. We were able to show that this unique cross selection of antibiotic resistance was the consequence of the PMQR determinant qnrD being SOS-regulated in a RecA-LexA dependent manner. We demonstrated that sub inhibitory concentration of aminoglycoside induced nitric oxide formation associated with the repression of the Hmp-mediated detoxification pathway, resulting in the induction of the SOS response and thus up-regulation of the PMQR. Overall, our findings revealed an unexpected antibiotic resistance cross-selection with low aminoglycosides concentrations promoting emergence of fluoroquinolones resistance.

Les aminosides sont majoritairement utilisés pour le traitement d’infections causées par des bactéries Gram-négatif. En raison de leur index thérapeutique étroit, les aminosides doivent être administrés avec des doses adéquates afin d’optimiser la guérison clinique tout en minimisant les risques de toxicité. De plus, le suivi thérapeutique posologique est d’autant plus important pour les populations spéciales. En effet, ces dernières, telles que les patients aux soins intensifs, peuvent présenter des conditions physiopathologiques pouvant influencer la pharmacocinétique des aminosides. Ce projet, séparé en trois volets, a permis la description des habitudes de posologies et de suivi thérapeutique des aminosides auprès des patients aux soins intensifs du Québec à l’aide d’un questionnaire. De plus, ce projet inclut également une revue des modèles pharmacocinétiques par approche populationnelle (PopPK) des aminosides pour des patients aux soins intensifs. Finalement, ce projet consiste en l’évaluation de la performance prédictive des modèles de gentamicine avec une base de données-patients provenant de deux établissements de santé du Québec. Le volet 1, sous forme d’un questionnaire, a obtenu un taux de réponse de 64.7%, représentant 42% des lits aux soins intensifs de la province. Les régimes posologiques administrés de façon uniquotidienne, sont plus utilisés que l’administration multiquotidienne avec des doses allant de 5 à 7 mg/kg pour la gentamicine et la tobramycine. L’amikacine est très peu utilisé dans les établissements du Québec. Les cibles thérapeutiques respectaient généralement les cibles recommandées dans la littérature. Le volet 2 a permis la description de six, onze et cinq modèles PopPK d’amikacine, de gentamicine et de tobramycine respectivement. Les modèles à deux compartiments décriraient mieux la pharmacocinétique de l’amikacine et de la tobramcyine, tandis que les modèles à un compartiment décriraient mieux la pharmacocinétique de la gentamicine. Les covariables les plus souvent considérées comme significatives étaient la clairance rénale et le poids corporel. Dans le volet 3, malgré qu’une performance prédictive adéquate a été déterminée auprès des 4 modèles évaluées avec la base de données-patients du Québec, de la variabilité demeure présente concernant la prédiction des concentrations et l’application de ces modèles dans un contexte doit ainsi se faire avec prudence. À partir du meilleur modèle, des régimes posologiques a priori ont pu être simulés. / Aminoglycosides are mostly used for treatment of severe Gram-negative infections. Due to their narrow therapeutic index, aminoglycosides should be administered following adequate dosing regimens in order to optimize clinical efficacy while minimizing the risks of toxicity. Moreover, therapeutic drug monitoring is even more important for frail populations such as the critically ill patients. In fact, the latter often present pathophysiological changes that may influence aminoglycosides’ pharmacokinetics. This project was divided in three parts. Firstly, a survey was developed to describe the usual dosing and monitoring practices of aminoglycosides in critically ill patients in the province of Quebec. This project also includes a literature review of aminoglycosides population pharmacokinetic (PopPK) models in critically ill patients. Finally, this project also consists of evaluating the predictive performance of gentamicin PopPK models with a validation dataset composed of patients from two Quebec institutions. The survey had a response rate of 64.7%, therefore representing 42% of all intensive care unit beds in the province. Once-daily-dose regimens are more used than multiple-daily-dose regimens. Most common gentamicin and tobramycin administered dose regimens ranged from 5 to 7 mg/kg. Amikacin is rarely used in Quebec’s institutions. Therapeutic targets were generally in-line with findings from the literature. The literature review described six, eleven and five amikacin, gentamicin and tobramycin PopPK models, respectively. Amikacin and tobramycin pharmacokinetics were mostly described by bi-compartment models whereas gentamicin pharmacokinetics were mostly described by single-compartment model. Most common covariates used were renal clearance and bodyweight. In the third part of this project, although an adequate predictive performance was determined in all four evaluated models, variability in the predicted concentrations by the model still remains. Therefore, usage of these models in clinical settings should be done cautiously. Based on the best performing model, a priori dosing regimens were simulated.

Achromobacter xylosoxidans est un bacille à Gram négatif non fermentaire pathogène opportuniste. Il est de plus en plus fréquemment isolé chez les patients atteints de mucoviscidose, colonisant leur arbre bronchique et pouvant être responsable d'une dégradation de la fonction respiratoire. Il s'agit d'une espèce bactérienne naturellement résistante à de nombreux antibiotiques : aux céphalosporines (hors ceftazidime), à l'aztréonam et aux aminosides. Les résistances acquises sont fréquentes, en particulier dans les souches isolées d'expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Ces résistances acquises concernent des molécules antibiotiques très utilisées pour le traitement des exacerbations respiratoires de la maladie, ce qui conduit parfois à de véritables impasses thérapeutiques. Au début de notre travail, seuls quelques mécanismes de résistance acquise aux β-lactamines avaient été décrits, mais aucun mécanisme impliqué dans la multi-résistance naturelle d'A. xylosoxidans.La résistance aux antibiotiques par efflux actif de type Resistance-Nodulation-cell Division (RND) est très répandue chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires. Nous avons identifié dans le génome d'A. xylosoxidans trois opérons pouvant coder pour des systèmes d'efflux RND. Par une technique d'inactivation génique nous avons montré que les trois systèmes d'efflux (AxyABM, AxyXY-OprZ et AxyCDJ) pouvaient exporter des antibiotiques. Deux d'entre eux participent à l'antibio-résistance naturelle d'A. xylosoxidans : AxyABM (résistance à l'aztréonam et à plusieurs céphalosporines) et AxyXY-OprZ (résistance aux aminosides)

Les antibiotiques sont des molécules incontournables dans le traitement des infections bactériennes. L’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez la pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, ont amené l’Organisation Mondiale de la Santé à déclarer indispensable le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre cette bactérie. Bien que certaines alternatives aient été envisagées, la préservation de l’activité d’antibiotiques majeurs tels que les aminosides et la colistine est primordiale. La caractérisation des mécanismes de résistance à ces médicaments est nécessaire pour la mise au point de nouvelles molécules et mieux prendre en charge les patients. Dans ce contexte, nous montrons que des mutations dans le gène fusA1 (codant le facteur d’élongation EF-G1A) et dans l’opéron pmrAB (système à deux composants PmrAB) entrainent une augmentation de la résistance aux aminosides chez des mutants isolés au laboratoire et des souches issues de patients, atteints ou non, de mucoviscidose. Certaines substitutions d’acide aminé dans EF-G1A accroissent les niveaux de résistance de 2 à 16 fois aux quatre sous-classes d’aminosides. Par ailleurs, des changements d’acide aminé dans le système à deux composants PmrAB activent l’expression des gènes PA4773-PA4774-PA4775, et la production de norspermidine et de spermidine. La synthèse de ces polyamines va de pair avec une baisse de 4 à 16 fois de la sensibilité aux aminosides à noyan 2-désoxystreptamine bisubstitué en 4,6 (gentamicine, amikacine et tobramycine). De plus, il apparaît que la résistance des mutants pmrB à la colistine est en partie dépendante de la pompe d’efflux MexXY(OprM), un système impliqué dans la résistance naturelle, adaptative ou acquise aux aminosides. Enfin, nous montrons que les mutants pmrB surproduisent des alcaloïdes contenant un motif azétidine, par une voie de synthèse non-ribosomale et dépendante du quorum sensing. Ces alcaloïdes diminuent la virulence de P. aeruginosa dans le modèle Galleria mellonella. / Antibiotics are invaluable drugs to combat bacterial infections. Emergence and spread of antibiotic resistance in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa have led the World Health Organization to consider as a crucial priority the development of new therapeutic approaches to fight this bacterium. In addition to other alternatives, preservation of activity of major antibiotics such as aminoglycosides and colistin is primordial. Consequently, characterization of the resistance mechanisms to these drugs is a prerequisite to design novel molecules, and improve patient care. In this context, we show that mutations in gene fusA1 (encoding elongation factor EF-G1A) and in operon pmrAB (two-component system PmrAB) lead to an increased resistance to aminoglycosides in in vitro-selected mutants and strains isolated from cystic fibrosis (CF) and non-CF patients. Certain amino acid substitutions in EF-G1A confer a 2- to 16-fold increased resistance to the four aminoglycoside subclasses. On the other hand, amino acid variations in two-component system PmrAB activate the expression of genes PA4773-PA4774-PA4775, and production of norspermidine and spermidine. This upregulated polyamine biosynthesis is associated with a 4- to 16-fold decreased susceptibility to 4,6-di-substituted deoxystreptamine aminoglycosides (gentamicin, amikacin and tobramycin). Moreover, our work reveals that the acquired resistance of pmrB mutants to colistin partially depends upon pump MexXY(OprM), a system that otherwise mediates intrinsic, adaptive and acquired resistance to aminoglycosides. Finally, we show that pmrB mutants overproduce azetidine-containing alkaloids by a quorum-sensing-regulated, nonribosomal peptide synthetase pathway. These alkaloids impair the virulence of P. aeruginosa in a Galleria mellonella infection model.