Aniridia congênita é um distúrbio raro com uma ampla gama de manifestações clínicas que inclui hipoplasia de íris associada a anormalidades de outras estruturas e tecidos oculares. Normalmente diagnosticada na primeira infância, eventualmente envolve perda total da visão na idade adulta. Em aproximadamente 2/3 dos casos esta condição é herdada como uma característica familiar (autossômica dominante) e no 1/3 restante ocorre como um distúrbio esporádico por uma mutação “de novo”. Apesar da grande variabilidade fenotípica, mais de 90% das mutações identificadas ocorrem no gene PAX6 (Paired box gene). O PAX6 é um fator de transcrição de importância fundamental nos processos de neurogênese e formação dos olhos. O objetivo desse estudo foi investigar uma grande família com aniridia congênita. Nós identificamos 53 indivíduos afetados através de cinco gerações de uma família de 163 indivíduos vivendo em uma área rural do Nordeste do Brasil (Água Branca, Alagoas). O diagnóstico foi estabelecido após exame oftalmológico completo. Amostras biológicas foram obtidas para 60 (31 afetados e 29 controles) membros da família. Utilizando primers específicos, o DNA de cinco afetados e dois não-afetados foi amplificado por PCR para 18 regiões cobrindo todos os éxons e parte das regiões adjacentes do gene PAX6, um total de 7527pb, em busca da provável mutação. Os produtos de amplificação foram purificados, e sequenciados no equipamento ABI3730XL. Os cromatogramas foram alinhados e sua qualidade e precisão foram checados utilizando o software CodonCode Aligner. Todos os cinco indivíduos afetados apresentaram uma mudança em heterozigose de G>A no primeiro nucleotídeo após o éxon na posição 141 (c.141+1G>A). Os dois familiares nãoafetados testados não apresentaram a mutação. Os fenótipos observados nos indivíduos afetados variaram desde a ausência completa até leves defeitos da íris. Mutações no sítio de splice modificam ou eliminam o processamento correto e maturação do mRNA, podendo ou não abolir completamente a expressão do transcrito normal, o que poderia levar a variação dos fenótipos. Isto poderia explicar a variabilidade fenotípica encontrada nesta família. / Congenital aniridia is a rare genetic disorder, with a wide range of clinical manifestations that include several degrees of iris hypoplasia associated with abnormalities of many other ocular structures and tissues. Usually diagnosed in early infancy, it eventually evolves to blindness in the adulthood. In about 2/3 of the cases this condition is inherited as an autosomal dominant trait, in the remaining 1/3 it occurs as a sporadic disorder by “de novo” mutation. Despite the wide phenotype variability, more than 90% of the mutations identified are in the PAX6 (Paired box gene). PAX6 is a transcription factor of critical importance in the neurogenesis and oculogenesis processes. The aim of this study was to investigate a large Brazilian family with congenital aniridia. We identified 53 subjects across a 5-generation pedigree of a family of 163 individuals living in a rural area of the Northeast of Brazil (Água Branca, Alagoas). Diagnosis was established after complete ophthalmological examination. Biological samples were obtained for 60 (31 affected and 29 controls) family members. Using specific primers, DNA from five affected and two controls were amplified by PCR for 18 regions covering all PAX6 gene exons, a total of 7527bp, for screening in search of the mutation. The amplicons were purified, and sequenced in the ABI3730XL machine. The chromatograms were aligned and their quality and accuracy were checked using the CodonCode Aligner software. All the five affected individuals sequenced presented a heterozygous G>A change in the first nucleotide after 141 exon position (c.141+1G>A). The two controls tested from this family didn’t show the mutation. The phenotype related varies from complete absence to mild iris defects. Splice site mutations modify or eliminate correct processing and maturation of the mRNA, and may or may not abolish the wild-type transcript expression completely, which could lead to variation in the phenotypes. Thus, this mutation in the splice site could explain the phenotype variability found in this family.

Aniridia congênita é um distúrbio raro com uma ampla gama de manifestações clínicas que inclui hipoplasia de íris associada a anormalidades de outras estruturas e tecidos oculares. Normalmente diagnosticada na primeira infância, eventualmente envolve perda total da visão na idade adulta. Em aproximadamente 2/3 dos casos esta condição é herdada como uma característica familiar (autossômica dominante) e no 1/3 restante ocorre como um distúrbio esporádico por uma mutação “de novo”. Apesar da grande variabilidade fenotípica, mais de 90% das mutações identificadas ocorrem no gene PAX6 (Paired box gene). O PAX6 é um fator de transcrição de importância fundamental nos processos de neurogênese e formação dos olhos. O objetivo desse estudo foi investigar uma grande família com aniridia congênita. Nós identificamos 53 indivíduos afetados através de cinco gerações de uma família de 163 indivíduos vivendo em uma área rural do Nordeste do Brasil (Água Branca, Alagoas). O diagnóstico foi estabelecido após exame oftalmológico completo. Amostras biológicas foram obtidas para 60 (31 afetados e 29 controles) membros da família. Utilizando primers específicos, o DNA de cinco afetados e dois não-afetados foi amplificado por PCR para 18 regiões cobrindo todos os éxons e parte das regiões adjacentes do gene PAX6, um total de 7527pb, em busca da provável mutação. Os produtos de amplificação foram purificados, e sequenciados no equipamento ABI3730XL. Os cromatogramas foram alinhados e sua qualidade e precisão foram checados utilizando o software CodonCode Aligner. Todos os cinco indivíduos afetados apresentaram uma mudança em heterozigose de G>A no primeiro nucleotídeo após o éxon na posição 141 (c.141+1G>A). Os dois familiares nãoafetados testados não apresentaram a mutação. Os fenótipos observados nos indivíduos afetados variaram desde a ausência completa até leves defeitos da íris. Mutações no sítio de splice modificam ou eliminam o processamento correto e maturação do mRNA, podendo ou não abolir completamente a expressão do transcrito normal, o que poderia levar a variação dos fenótipos. Isto poderia explicar a variabilidade fenotípica encontrada nesta família. / Congenital aniridia is a rare genetic disorder, with a wide range of clinical manifestations that include several degrees of iris hypoplasia associated with abnormalities of many other ocular structures and tissues. Usually diagnosed in early infancy, it eventually evolves to blindness in the adulthood. In about 2/3 of the cases this condition is inherited as an autosomal dominant trait, in the remaining 1/3 it occurs as a sporadic disorder by “de novo” mutation. Despite the wide phenotype variability, more than 90% of the mutations identified are in the PAX6 (Paired box gene). PAX6 is a transcription factor of critical importance in the neurogenesis and oculogenesis processes. The aim of this study was to investigate a large Brazilian family with congenital aniridia. We identified 53 subjects across a 5-generation pedigree of a family of 163 individuals living in a rural area of the Northeast of Brazil (Água Branca, Alagoas). Diagnosis was established after complete ophthalmological examination. Biological samples were obtained for 60 (31 affected and 29 controls) family members. Using specific primers, DNA from five affected and two controls were amplified by PCR for 18 regions covering all PAX6 gene exons, a total of 7527bp, for screening in search of the mutation. The amplicons were purified, and sequenced in the ABI3730XL machine. The chromatograms were aligned and their quality and accuracy were checked using the CodonCode Aligner software. All the five affected individuals sequenced presented a heterozygous G>A change in the first nucleotide after 141 exon position (c.141+1G>A). The two controls tested from this family didn’t show the mutation. The phenotype related varies from complete absence to mild iris defects. Splice site mutations modify or eliminate correct processing and maturation of the mRNA, and may or may not abolish the wild-type transcript expression completely, which could lead to variation in the phenotypes. Thus, this mutation in the splice site could explain the phenotype variability found in this family.

Aniridia congênita é um distúrbio raro com uma ampla gama de manifestações clínicas que inclui hipoplasia de íris associada a anormalidades de outras estruturas e tecidos oculares. Normalmente diagnosticada na primeira infância, eventualmente envolve perda total da visão na idade adulta. Em aproximadamente 2/3 dos casos esta condição é herdada como uma característica familiar (autossômica dominante) e no 1/3 restante ocorre como um distúrbio esporádico por uma mutação “de novo”. Apesar da grande variabilidade fenotípica, mais de 90% das mutações identificadas ocorrem no gene PAX6 (Paired box gene). O PAX6 é um fator de transcrição de importância fundamental nos processos de neurogênese e formação dos olhos. O objetivo desse estudo foi investigar uma grande família com aniridia congênita. Nós identificamos 53 indivíduos afetados através de cinco gerações de uma família de 163 indivíduos vivendo em uma área rural do Nordeste do Brasil (Água Branca, Alagoas). O diagnóstico foi estabelecido após exame oftalmológico completo. Amostras biológicas foram obtidas para 60 (31 afetados e 29 controles) membros da família. Utilizando primers específicos, o DNA de cinco afetados e dois não-afetados foi amplificado por PCR para 18 regiões cobrindo todos os éxons e parte das regiões adjacentes do gene PAX6, um total de 7527pb, em busca da provável mutação. Os produtos de amplificação foram purificados, e sequenciados no equipamento ABI3730XL. Os cromatogramas foram alinhados e sua qualidade e precisão foram checados utilizando o software CodonCode Aligner. Todos os cinco indivíduos afetados apresentaram uma mudança em heterozigose de G>A no primeiro nucleotídeo após o éxon na posição 141 (c.141+1G>A). Os dois familiares nãoafetados testados não apresentaram a mutação. Os fenótipos observados nos indivíduos afetados variaram desde a ausência completa até leves defeitos da íris. Mutações no sítio de splice modificam ou eliminam o processamento correto e maturação do mRNA, podendo ou não abolir completamente a expressão do transcrito normal, o que poderia levar a variação dos fenótipos. Isto poderia explicar a variabilidade fenotípica encontrada nesta família. / Congenital aniridia is a rare genetic disorder, with a wide range of clinical manifestations that include several degrees of iris hypoplasia associated with abnormalities of many other ocular structures and tissues. Usually diagnosed in early infancy, it eventually evolves to blindness in the adulthood. In about 2/3 of the cases this condition is inherited as an autosomal dominant trait, in the remaining 1/3 it occurs as a sporadic disorder by “de novo” mutation. Despite the wide phenotype variability, more than 90% of the mutations identified are in the PAX6 (Paired box gene). PAX6 is a transcription factor of critical importance in the neurogenesis and oculogenesis processes. The aim of this study was to investigate a large Brazilian family with congenital aniridia. We identified 53 subjects across a 5-generation pedigree of a family of 163 individuals living in a rural area of the Northeast of Brazil (Água Branca, Alagoas). Diagnosis was established after complete ophthalmological examination. Biological samples were obtained for 60 (31 affected and 29 controls) family members. Using specific primers, DNA from five affected and two controls were amplified by PCR for 18 regions covering all PAX6 gene exons, a total of 7527bp, for screening in search of the mutation. The amplicons were purified, and sequenced in the ABI3730XL machine. The chromatograms were aligned and their quality and accuracy were checked using the CodonCode Aligner software. All the five affected individuals sequenced presented a heterozygous G>A change in the first nucleotide after 141 exon position (c.141+1G>A). The two controls tested from this family didn’t show the mutation. The phenotype related varies from complete absence to mild iris defects. Splice site mutations modify or eliminate correct processing and maturation of the mRNA, and may or may not abolish the wild-type transcript expression completely, which could lead to variation in the phenotypes. Thus, this mutation in the splice site could explain the phenotype variability found in this family.

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O desenvolvimento dos olhos em humanos tem início na quarta semana de vida embrionária. Neste período uma grande série de sinalizadores estão envolvidos. Várias anomalias oculares decorrem de alterações nos genes envolvidos neste período, como a aniridia e a catarata. A aniridia congênita (AC) é uma anomalia rara caracterizada por diversos graus de hipoplasia de íris e afeta aproximadamente 1:40,000 a 1:100,000 nascidos vivos. Diversas anormalidades oculares estruturais e/ou funcionais podem estar associadas, entre estas, a catarata. Cerca de 90% das mutações que levam ao fenótipo da aniridia ocorrem no gene PAX6, o gene mestre do desenvolvimento dos olhos. Apesar de bem estabelecida a relação entre o PAX6 e a aniridia, variações fenotípicas inter- e intrafamilial em indivíduos que compartilham a mesma mutação no PAX6 é amplamente relatada na literatura. Este trabalho teve por objetivo investigar variações no gene PAX6, e potenciais genes modificadores envolvidos nas variações fenotípicas observadas nos indivíduos afetados por AC. No primeiro artigo, relatamos um indivíduo com AC total associada a catarata e glaucoma, onde detectamos uma mutação ainda não descrita no domínio de transativação do gene PAX6 (c.955_958dupGACA). Devido ao fato que esta mutação não afeta os domínios de ligação ao DNA da proteína PAX6, sugerimos que esta alteração apresenta um efeito dominante-negativo. No segundo artigo, tentamos identificar genes modificadores candidatos utilizando uma abordagem in silico com buscas nos bancos curados de genes e fenótipos, revisão de literatura e ferramentas de bioinformática para avaliações de expressão e redes preditas de proteínas. Avaliamos genes relacionados a expressão da catarata, uma vez que esta anomalia é frequentemente associada a AC e identificamos 5 potenciais genes modificadores: GJA3, GJA8, MIP, CRYAA e CRYBB3. Estes genes estão envolvidos em processos de transporte de metabólitos entre as células como o GJA3, GJA8 e o MIP e componentes estruturais como o CRYAA e o CRYBB3. Ambos grupos possuem grande importância na manutenção 12 da transparência do cristalino e mutações nestes genes também já foram relacionadas a outras anormalidades associadas a AC, como microcórnea, microftalmia e glaucoma. Sugerimos que variações nestes genes são candidatas a serem investigadas em sua influência na expressividade fenotípica dos indivíduos com AC por mutações no PAX6 No terceiro artigo, investigamos um polimorfismo no gene TP53 (rs1042522), e outro em seu principal regulador, o MDM2 (rs2279744) em indivíduos com AC, com e sem catarata associada. Já foi sugerido na literatura o potencial papel de genes da via da apoptose durante o desenvolvimento do cristalino. As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo no TP53 entre indivíduos afetados por AC sem catarata (n = 12; CC: 0; CG: 66.7%; GG: 33.3%; C: 33.3% e G: 66.6%) e indivíduos afetados por AC e catarata (n = 17; CC: 23.5%; CG: 41.2% e GG: 35.3%; C: 44.1% e G: 55.9%) não foram diferentes (p = 0,22 e p = 1). O mesmo foi observado em relação ao polimorfismo no MDM2, onde nenhuma diferença foi encontrada entre as frequências genotípicas e alélicas do grupo afetado por AC sem catarata (n = 12; TT: 16.7%; TG: 50% e GG: 33.3%; T: 41,7% e G: 58,3%) e do grupo afetado por AC e catarata (n = 17; TT: 41.2%; TG: 35.3% e GG: 23.5%; T: 55.9% e G: 44.1%; p = 0,453 e p = 0,350). Entretanto nossas conclusões são limitadas devido ao nosso pequeno número amostral. Em conclusão, os dados apresentados neste trabalho confirmam a grande complexidade molecular da AC e a importância da investigação de fatores modificadores de fenótipo, a fim de auxiliar o manejo e em pesquisas futuras no desenvolvimento de drogas e terapias que possam reverter os prejuízos clínicos, ou inibir a progressão destes, nos indivíduos afetados. / Human eye development begins in the fourth week of the embryonic life. At this time a wide range of signals are involved. Several ocular anomalies result from changes in the genes involved in this period, such as aniridia and cataract. Congenital aniridia (CA) is a rare anomaly characterized by varying degrees of iris hypoplasia and affects approximately 1:40,000 to 1:100,000 live births. Several structural and/or functional ocular abnormalities may be associated, among them, the cataract. About 90% of the mutations that lead to the aniridia phenotype occur in the PAX6 gene, the master gene for eye development. Although well-established the relationship between PAX6 and aniridia, inter- and intra-familial phenotypic variations in individuals sharing the same mutation in PAX6 is widely reported in the literature. In this work, we aimed to investigate variations in the PAX6 gene, and potential modifying genes involved in the phenotypic variations observed in individuals affected by CA. In the first article, we report an individual with total CA associated with cataract and glaucoma, where we detected a mutation not yet described in the PAX6 gene transactivation domain (c.955_958dupGACA). Since this mutation does not affect the DNA binding domains of the PAX6 protein, we suggest that this change has a dominant-negative effect. In the second article, we attempted to identify candidate modifying genes using an in silico approach with researches in cured banks of genes and phenotypes, literature review and bioinformatics tools for expression evaluations and predicted protein networks. We evaluated genes related to cataract expression, since this anomaly is frequently associated with CA and we identified five potential modifier genes: GJA3, GJA8, MIP, CRYAA, and CRYBB3. These genes are involved in the transport of metabolites between cells such as GJA3, GJA8 and MIP and structural components such as CRYAA and CRYBB3. Both groups have great importance in the maintenance of crystalline transparency and mutations in these genes have also been related to other abnormalities associated with CA, such as microcornea, microphthalmia and glaucoma. We suggest that variations in these genes are 14 candidates to be investigated for their influence on the phenotypic expressivity of CA individuals by mutations in PAX6. In the third article, we investigated a polymorphism in the TP53 gene (rs1042522), and another in its main regulator, MDM2 (rs2279744) in individuals with CA, with and without associated cataract. The potential role of genes in the apoptosis pathway during lens development has been suggested in the literature. The genotype and allelic frequencies of the polymorphism within TP53 between affected individual by CA without cataract (n = 12; CC: 0; CG: 66.7%; GG: 33.3%; C: 33.3% and G: 66.6%) and affected individuals by CA and cataract (n = 17; CC: 23.5%; CG: 41.2% and GG: 35.3%; C: 44.1% and G: 55.9%) were not different (p = 0,22 and p = 1). The same was observed regarding the polymorphism in MDM2, where no difference was found between the genotypic and allelic frequencies of the group affected by CA without cataract (n = 12; TT: 16.7%; TG: 50% and GG: 33.3%; T: 41,7% and G: 58,3%) and affected group by CA and cataract (n = 17; TT: 41.2%; TG: 35.3% and GG: 23.5%; T: 55.9% and G: 44.1%; p = 0,453 and p = 0,350). However, our conclusions are limited because of our small sample size. In conclusion, the data presented in this thesis confirm the great molecular complexity of CA and the importance of investigating phenotype-modifying factors, in order to assist the management and in future research on the development of drugs and therapies that may reverse clinical losses, or inhibit the progression of these in the affected individuals.

O desenvolvimento dos olhos em humanos tem início na quarta semana de vida embrionária. Neste período uma grande série de sinalizadores estão envolvidos. Várias anomalias oculares decorrem de alterações nos genes envolvidos neste período, como a aniridia e a catarata. A aniridia congênita (AC) é uma anomalia rara caracterizada por diversos graus de hipoplasia de íris e afeta aproximadamente 1:40,000 a 1:100,000 nascidos vivos. Diversas anormalidades oculares estruturais e/ou funcionais podem estar associadas, entre estas, a catarata. Cerca de 90% das mutações que levam ao fenótipo da aniridia ocorrem no gene PAX6, o gene mestre do desenvolvimento dos olhos. Apesar de bem estabelecida a relação entre o PAX6 e a aniridia, variações fenotípicas inter- e intrafamilial em indivíduos que compartilham a mesma mutação no PAX6 é amplamente relatada na literatura. Este trabalho teve por objetivo investigar variações no gene PAX6, e potenciais genes modificadores envolvidos nas variações fenotípicas observadas nos indivíduos afetados por AC. No primeiro artigo, relatamos um indivíduo com AC total associada a catarata e glaucoma, onde detectamos uma mutação ainda não descrita no domínio de transativação do gene PAX6 (c.955_958dupGACA). Devido ao fato que esta mutação não afeta os domínios de ligação ao DNA da proteína PAX6, sugerimos que esta alteração apresenta um efeito dominante-negativo. No segundo artigo, tentamos identificar genes modificadores candidatos utilizando uma abordagem in silico com buscas nos bancos curados de genes e fenótipos, revisão de literatura e ferramentas de bioinformática para avaliações de expressão e redes preditas de proteínas. Avaliamos genes relacionados a expressão da catarata, uma vez que esta anomalia é frequentemente associada a AC e identificamos 5 potenciais genes modificadores: GJA3, GJA8, MIP, CRYAA e CRYBB3. Estes genes estão envolvidos em processos de transporte de metabólitos entre as células como o GJA3, GJA8 e o MIP e componentes estruturais como o CRYAA e o CRYBB3. Ambos grupos possuem grande importância na manutenção 12 da transparência do cristalino e mutações nestes genes também já foram relacionadas a outras anormalidades associadas a AC, como microcórnea, microftalmia e glaucoma. Sugerimos que variações nestes genes são candidatas a serem investigadas em sua influência na expressividade fenotípica dos indivíduos com AC por mutações no PAX6 No terceiro artigo, investigamos um polimorfismo no gene TP53 (rs1042522), e outro em seu principal regulador, o MDM2 (rs2279744) em indivíduos com AC, com e sem catarata associada. Já foi sugerido na literatura o potencial papel de genes da via da apoptose durante o desenvolvimento do cristalino. As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo no TP53 entre indivíduos afetados por AC sem catarata (n = 12; CC: 0; CG: 66.7%; GG: 33.3%; C: 33.3% e G: 66.6%) e indivíduos afetados por AC e catarata (n = 17; CC: 23.5%; CG: 41.2% e GG: 35.3%; C: 44.1% e G: 55.9%) não foram diferentes (p = 0,22 e p = 1). O mesmo foi observado em relação ao polimorfismo no MDM2, onde nenhuma diferença foi encontrada entre as frequências genotípicas e alélicas do grupo afetado por AC sem catarata (n = 12; TT: 16.7%; TG: 50% e GG: 33.3%; T: 41,7% e G: 58,3%) e do grupo afetado por AC e catarata (n = 17; TT: 41.2%; TG: 35.3% e GG: 23.5%; T: 55.9% e G: 44.1%; p = 0,453 e p = 0,350). Entretanto nossas conclusões são limitadas devido ao nosso pequeno número amostral. Em conclusão, os dados apresentados neste trabalho confirmam a grande complexidade molecular da AC e a importância da investigação de fatores modificadores de fenótipo, a fim de auxiliar o manejo e em pesquisas futuras no desenvolvimento de drogas e terapias que possam reverter os prejuízos clínicos, ou inibir a progressão destes, nos indivíduos afetados. / Human eye development begins in the fourth week of the embryonic life. At this time a wide range of signals are involved. Several ocular anomalies result from changes in the genes involved in this period, such as aniridia and cataract. Congenital aniridia (CA) is a rare anomaly characterized by varying degrees of iris hypoplasia and affects approximately 1:40,000 to 1:100,000 live births. Several structural and/or functional ocular abnormalities may be associated, among them, the cataract. About 90% of the mutations that lead to the aniridia phenotype occur in the PAX6 gene, the master gene for eye development. Although well-established the relationship between PAX6 and aniridia, inter- and intra-familial phenotypic variations in individuals sharing the same mutation in PAX6 is widely reported in the literature. In this work, we aimed to investigate variations in the PAX6 gene, and potential modifying genes involved in the phenotypic variations observed in individuals affected by CA. In the first article, we report an individual with total CA associated with cataract and glaucoma, where we detected a mutation not yet described in the PAX6 gene transactivation domain (c.955_958dupGACA). Since this mutation does not affect the DNA binding domains of the PAX6 protein, we suggest that this change has a dominant-negative effect. In the second article, we attempted to identify candidate modifying genes using an in silico approach with researches in cured banks of genes and phenotypes, literature review and bioinformatics tools for expression evaluations and predicted protein networks. We evaluated genes related to cataract expression, since this anomaly is frequently associated with CA and we identified five potential modifier genes: GJA3, GJA8, MIP, CRYAA, and CRYBB3. These genes are involved in the transport of metabolites between cells such as GJA3, GJA8 and MIP and structural components such as CRYAA and CRYBB3. Both groups have great importance in the maintenance of crystalline transparency and mutations in these genes have also been related to other abnormalities associated with CA, such as microcornea, microphthalmia and glaucoma. We suggest that variations in these genes are 14 candidates to be investigated for their influence on the phenotypic expressivity of CA individuals by mutations in PAX6. In the third article, we investigated a polymorphism in the TP53 gene (rs1042522), and another in its main regulator, MDM2 (rs2279744) in individuals with CA, with and without associated cataract. The potential role of genes in the apoptosis pathway during lens development has been suggested in the literature. The genotype and allelic frequencies of the polymorphism within TP53 between affected individual by CA without cataract (n = 12; CC: 0; CG: 66.7%; GG: 33.3%; C: 33.3% and G: 66.6%) and affected individuals by CA and cataract (n = 17; CC: 23.5%; CG: 41.2% and GG: 35.3%; C: 44.1% and G: 55.9%) were not different (p = 0,22 and p = 1). The same was observed regarding the polymorphism in MDM2, where no difference was found between the genotypic and allelic frequencies of the group affected by CA without cataract (n = 12; TT: 16.7%; TG: 50% and GG: 33.3%; T: 41,7% and G: 58,3%) and affected group by CA and cataract (n = 17; TT: 41.2%; TG: 35.3% and GG: 23.5%; T: 55.9% and G: 44.1%; p = 0,453 and p = 0,350). However, our conclusions are limited because of our small sample size. In conclusion, the data presented in this thesis confirm the great molecular complexity of CA and the importance of investigating phenotype-modifying factors, in order to assist the management and in future research on the development of drugs and therapies that may reverse clinical losses, or inhibit the progression of these in the affected individuals.

O desenvolvimento dos olhos em humanos tem início na quarta semana de vida embrionária. Neste período uma grande série de sinalizadores estão envolvidos. Várias anomalias oculares decorrem de alterações nos genes envolvidos neste período, como a aniridia e a catarata. A aniridia congênita (AC) é uma anomalia rara caracterizada por diversos graus de hipoplasia de íris e afeta aproximadamente 1:40,000 a 1:100,000 nascidos vivos. Diversas anormalidades oculares estruturais e/ou funcionais podem estar associadas, entre estas, a catarata. Cerca de 90% das mutações que levam ao fenótipo da aniridia ocorrem no gene PAX6, o gene mestre do desenvolvimento dos olhos. Apesar de bem estabelecida a relação entre o PAX6 e a aniridia, variações fenotípicas inter- e intrafamilial em indivíduos que compartilham a mesma mutação no PAX6 é amplamente relatada na literatura. Este trabalho teve por objetivo investigar variações no gene PAX6, e potenciais genes modificadores envolvidos nas variações fenotípicas observadas nos indivíduos afetados por AC. No primeiro artigo, relatamos um indivíduo com AC total associada a catarata e glaucoma, onde detectamos uma mutação ainda não descrita no domínio de transativação do gene PAX6 (c.955_958dupGACA). Devido ao fato que esta mutação não afeta os domínios de ligação ao DNA da proteína PAX6, sugerimos que esta alteração apresenta um efeito dominante-negativo. No segundo artigo, tentamos identificar genes modificadores candidatos utilizando uma abordagem in silico com buscas nos bancos curados de genes e fenótipos, revisão de literatura e ferramentas de bioinformática para avaliações de expressão e redes preditas de proteínas. Avaliamos genes relacionados a expressão da catarata, uma vez que esta anomalia é frequentemente associada a AC e identificamos 5 potenciais genes modificadores: GJA3, GJA8, MIP, CRYAA e CRYBB3. Estes genes estão envolvidos em processos de transporte de metabólitos entre as células como o GJA3, GJA8 e o MIP e componentes estruturais como o CRYAA e o CRYBB3. Ambos grupos possuem grande importância na manutenção 12 da transparência do cristalino e mutações nestes genes também já foram relacionadas a outras anormalidades associadas a AC, como microcórnea, microftalmia e glaucoma. Sugerimos que variações nestes genes são candidatas a serem investigadas em sua influência na expressividade fenotípica dos indivíduos com AC por mutações no PAX6 No terceiro artigo, investigamos um polimorfismo no gene TP53 (rs1042522), e outro em seu principal regulador, o MDM2 (rs2279744) em indivíduos com AC, com e sem catarata associada. Já foi sugerido na literatura o potencial papel de genes da via da apoptose durante o desenvolvimento do cristalino. As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo no TP53 entre indivíduos afetados por AC sem catarata (n = 12; CC: 0; CG: 66.7%; GG: 33.3%; C: 33.3% e G: 66.6%) e indivíduos afetados por AC e catarata (n = 17; CC: 23.5%; CG: 41.2% e GG: 35.3%; C: 44.1% e G: 55.9%) não foram diferentes (p = 0,22 e p = 1). O mesmo foi observado em relação ao polimorfismo no MDM2, onde nenhuma diferença foi encontrada entre as frequências genotípicas e alélicas do grupo afetado por AC sem catarata (n = 12; TT: 16.7%; TG: 50% e GG: 33.3%; T: 41,7% e G: 58,3%) e do grupo afetado por AC e catarata (n = 17; TT: 41.2%; TG: 35.3% e GG: 23.5%; T: 55.9% e G: 44.1%; p = 0,453 e p = 0,350). Entretanto nossas conclusões são limitadas devido ao nosso pequeno número amostral. Em conclusão, os dados apresentados neste trabalho confirmam a grande complexidade molecular da AC e a importância da investigação de fatores modificadores de fenótipo, a fim de auxiliar o manejo e em pesquisas futuras no desenvolvimento de drogas e terapias que possam reverter os prejuízos clínicos, ou inibir a progressão destes, nos indivíduos afetados. / Human eye development begins in the fourth week of the embryonic life. At this time a wide range of signals are involved. Several ocular anomalies result from changes in the genes involved in this period, such as aniridia and cataract. Congenital aniridia (CA) is a rare anomaly characterized by varying degrees of iris hypoplasia and affects approximately 1:40,000 to 1:100,000 live births. Several structural and/or functional ocular abnormalities may be associated, among them, the cataract. About 90% of the mutations that lead to the aniridia phenotype occur in the PAX6 gene, the master gene for eye development. Although well-established the relationship between PAX6 and aniridia, inter- and intra-familial phenotypic variations in individuals sharing the same mutation in PAX6 is widely reported in the literature. In this work, we aimed to investigate variations in the PAX6 gene, and potential modifying genes involved in the phenotypic variations observed in individuals affected by CA. In the first article, we report an individual with total CA associated with cataract and glaucoma, where we detected a mutation not yet described in the PAX6 gene transactivation domain (c.955_958dupGACA). Since this mutation does not affect the DNA binding domains of the PAX6 protein, we suggest that this change has a dominant-negative effect. In the second article, we attempted to identify candidate modifying genes using an in silico approach with researches in cured banks of genes and phenotypes, literature review and bioinformatics tools for expression evaluations and predicted protein networks. We evaluated genes related to cataract expression, since this anomaly is frequently associated with CA and we identified five potential modifier genes: GJA3, GJA8, MIP, CRYAA, and CRYBB3. These genes are involved in the transport of metabolites between cells such as GJA3, GJA8 and MIP and structural components such as CRYAA and CRYBB3. Both groups have great importance in the maintenance of crystalline transparency and mutations in these genes have also been related to other abnormalities associated with CA, such as microcornea, microphthalmia and glaucoma. We suggest that variations in these genes are 14 candidates to be investigated for their influence on the phenotypic expressivity of CA individuals by mutations in PAX6. In the third article, we investigated a polymorphism in the TP53 gene (rs1042522), and another in its main regulator, MDM2 (rs2279744) in individuals with CA, with and without associated cataract. The potential role of genes in the apoptosis pathway during lens development has been suggested in the literature. The genotype and allelic frequencies of the polymorphism within TP53 between affected individual by CA without cataract (n = 12; CC: 0; CG: 66.7%; GG: 33.3%; C: 33.3% and G: 66.6%) and affected individuals by CA and cataract (n = 17; CC: 23.5%; CG: 41.2% and GG: 35.3%; C: 44.1% and G: 55.9%) were not different (p = 0,22 and p = 1). The same was observed regarding the polymorphism in MDM2, where no difference was found between the genotypic and allelic frequencies of the group affected by CA without cataract (n = 12; TT: 16.7%; TG: 50% and GG: 33.3%; T: 41,7% and G: 58,3%) and affected group by CA and cataract (n = 17; TT: 41.2%; TG: 35.3% and GG: 23.5%; T: 55.9% and G: 44.1%; p = 0,453 and p = 0,350). However, our conclusions are limited because of our small sample size. In conclusion, the data presented in this thesis confirm the great molecular complexity of CA and the importance of investigating phenotype-modifying factors, in order to assist the management and in future research on the development of drugs and therapies that may reverse clinical losses, or inhibit the progression of these in the affected individuals.

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Aniridia is a rare genetic disorder that affects the development of the eye and is caused in most cases by mutations in the PAX6 gene. Patients with a heterozygous mutation in their PAX6 gene are born without irises. Aniridia patients are also prone to other eye diseases over their lifetimes such as cataracts and glaucoma. Aniridia’s progressive nature suggests that therapeutic intervention aimed at restoring PAX6 expression may be effective at ameliorating the progression of this disease. PAX6 is necessary for the development and maintenance not only of the eye, but also the pancreas. Patients with aniridia have an increased likelihood of developing glucose intolerance and diabetes. Indeed, genetic studies in rodents have confirmed that haploinsufficient animals for Pax6 develop glucose intolerance due to an ongoing requirement for Pax6 expression in the pancreas and gut. This thesis is a proof-of-concept study designed to determine the effects of repressing miRNA regulation of murine Pax6. Pax6 is regulated by miRNA-7 and miRNA-375. I hypothesized that repression of miRNA-7 and miRNA-375 would restore Pax6 expression and that this strategy might be useful in treating some of the progressive symptoms that emerge in aniridia patients in adulthood. As a first step towards evaluating miRNA inhibition as a therapeutic strategy for the treatment of aniridia, my first objective was to confirm whether miRNA-7 and miRNA-375 regulate Pax6 expression in pancreatic cells and tissue. My second objective was to determine whether these miRNAs could be efficiently inhibited. My third objective was to determine whether repression of miRNA-7 or miRNA-375 alters endogenous PAX6 protein levels in pancreatic cell lines. My final objective was to determine whether target protectors, delivered to explants of pancreatic islets through an adeno-associated virus (AAV) vector, could be used to restore Pax6 expression in murine haploinsufficient islets. From this study, I have confirmed that miRNA-7 and miRNA-375 regulate Pax6 in pancreatic cells that these miRNAs can be specifically inhibited, and that inhibition leads to an increase in Pax6 on both the reporter and protein levels. I have shown that target protectors against the miRNA-7 and miRNA-375 binding sites within the Pax6 3’UTR are effective at increasing the levels of PAX6 protein in pancreatic cell lines. Finally, I have also shown that a target protector against the miRNA-7 binding site can increase PAX6 protein levels in islets from murine haploinsufficient islets to near wild-type levels. My thesis lays the groundwork for the development of anti-miRNA-based therapies aimed at restoring PAX6 expression in the eye and pancreas. / Graduate

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Monica Barbosa de Melo, Fernanda Caroline Soardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T10:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_EmersonSalvadordeSouza_M.pdf: 3804995 bytes, checksum: 694d80ade56340a0a1125338c03238ad (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O gene PAX6 é o principal gene para o controle da organização do sistema ocular durante a embriogênese. Este gene pertence a uma família de reguladores de transcrição denominada PAX, sendo que seus membros compartilham um domínio funcional de 128 aminoácidos chamado de paired domain. O PAX6 é o mais bem estudado dessa família. O gene PAX6 está localizado na banda 13 do braço curto do cormossomo11 em humanos, e apresenta 14 exons sendo que os três primeiros e parte do quarto exon não são traduzidos. A proteína do PAX6 possui dois domínios funcionais: o paired domain e o homeo domain, que são separados por um segmento de ligação denominado LNK e seguidos por uma região com importante função na ativação transcricional denominada PST. A proteína do gene PAX6 é um fator de regulação transcricional altamente conservado com funções importantes para o desenvolvimento normal dos olhos e do sistema nervoso. Alterações no gene PAX6 em humanos foram associadas ao fenótipo de aniridia, da síndrome de Morning Glory (MGS) e também de doenças associadas ao desenvolvimento ocular. A aniridia é um defeito congênito raro, a qual provoca uma formação incompleta ou a ausência da íris. Embora seus efeitos variem entre os indivíduos, pode causar perda de visão. A doença pode ser de herança autossômica dominante ou de manifestação esporádica. MGS é uma anomalia congênita do nervo óptico, comumente unilateral, podendo encontrar-se associada estrabismo, ambliopia e nistagmo. Freqüentemente essa síndrome pode encontrar-se associada a anomalias endócrinas, renais e do sistema nervoso central. Sendo assim, o projeto teve por objetivos a análise molecular do gene PAX6 através de seqüenciamento e da técnica de MLPA em pacientes com aniridia e pacientes portadores da síndrome de MGS, a fim de se detectar mutações e/ou polimorfismos que pudessem estar ligados ao quadro clínico dos indivíduos. A casuística do projeto foi de três famílias com segregação aniridia, um indivíduo esporádico com aniridia e quatro indivíduos portadores da síndrome de Morning Glory. O grupo controle consistiu de 50 indivíduos triados como não tendo alterações oftalmológicas. Foi encontrada uma mutação p.R240X no gene PAX6, que causa uma troca de uma arginina por um stop codon, segregando nos indivíduos afetados da Família 1 e assim explicando o fenótipo dos indivíduos. Essa mutação é a mais freqüente associada à aniridia, porém é a primeira vez que ela foi descrita na população brasileira. Também foram encontradas diversas alterações descritas e não descritas que necessitam de mais estudos para que possam ser associadas à manifestação do fenótipo dos indivíduos afetados. Além disso, foi observada pela técnica de MLPA, uma possível micro-deleção ou alteração nucleotídica no exon 1 do gene RCN1 encontrada nos filhos das Famílias 1 e 3 podendo estar envolvida na regulação 5' do gene PAX6. Outra possível micro-deleção ou alteração nucleotídica foi também observada no exon 9 do gene ELP4, que pode estar associada a regulação 3' do gene PAX6. Esse estudo demonstrou que para a etiologia de aniridia e síndrome Morning Glory devem existir outros genes cuja expressão possa estar alterada durante o desenvolvimento. / Abstract: PAX6 gene is the major gene in the control of eye organization during development. It belongs to a family of transcription regulators called PAX, formed by several members which share a 128 aminoacid functional domain called paired domain. PAX6 is best studied within this family. In humans, it is located on chromosome 11p13 and is formed by 14 exons; the first three and part of the fourth are not translated. PAX6 protein comprises two functional domains: the paired domain and the homeo domain which are separated by a linker called LNK and followed by an important region with trancriptional activity called PST. The PAX6 protein is a highly conserved transcriptional regulator factor that is important for normal ocular and neural development. Mutations on human PAX6 gene were associated to aniridia, Morning Glory Syndrome and other ocular diseases. Aniridia is rare birth defect which leads to an incomplete formation or the absence of the iris. Although their effects vary between individual, aniridia can cause loss of vision. The disease may be autosomal dominant or sporadic event. The Morning Glory Syndrome (MGS) is a congenital optic disk dysplasia, generally unilateral, which can be associated with strabismus, amblyopia and nystagmus. This syndrome may be often associated with endocrine, renal and central nervous system abnormalities. Thus the aim of this investigation was to evaluate the molecular composition of PAX6 gene using direct sequencing and MLPA technique in patients with Aniridia and Morning Glory Syndrome, to detect mutations and/or polymorphisms associated with the patient's phenotypes. Were included in the study 1 family with segregation of aniridia, 1 family with Axenfeld-Rieger Syndrome, 1 sporadic individual with aniridia and 4 individuals carrying MGS. The control group comprised 50 individuals considered ophthalmologically normal. The nonsense mutation p.R240X was found in the PAX6 gene, segregating with the affected members in family 1, what explains their phenotypes. This mutation is one of the most frequent nonsense mutations associated with the aniridia, however this is the first report on a PAX6 gene mutation familial case of aniridia in Brazil. Several described and non-described nucleotide variations were found, but additional studies are required to correlate them to the phenotype of affected individuals. Furthermore, the MLPA technique showed possible micro-deletions or mutations in exon 1 of RCN1 gene, located 5' to PAX6. This result was observed in both male children of families 1 and 3. Other possible micro-deletion or mutation was observed in exon 9 of ELP4 gene, which can be associated to 3' regulation of PAX6 gene. This study demonstrated that the involvement of other gene whose expressions may be altered during the development cannot be excluded for the etiology of aniridia and Morning Glory Syndrome. / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular