Zugl.: Magdeburg, Univ., Diss., 2010

Zugl.: Saarbrücken, Universiẗat, Diss., 1998.

Techn. Hochsch., Diss., 2001--Aachen.

University, Diss., 2003--Bonn.

Universiẗat, Diss., 2003--Kassel. / Download lizenzpflichtig.

Freie Universiẗat, Diss., 2005--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2005.

While malignant melanoma comprises a relatively minor fraction of skin cancer cases, it is responsible for the majority of skin cancer-related deaths and is characterized by a globally rising incidence rate. Due to combined inhibitor treatment targeting the MAPK pathway or immune checkpoint inhibition, efficacy of melanoma therapy has significantly improved. However, melanoma patients often develop therapy resistance following initial response, or do not respond to current treatment options. Challenging conditions caused by the tumor microenvironment or cancer therapy can lead to adaptation strategies, which are controlled by stress-induced transcription factors. In particular, the master regulator of the oxidative stress response, NRF2, is known to maintain the cellular redox homeostasis under stress conditions and is associated with tumor-promoting features in various tumor entities. Melanoma can be divided into different subtypes that are characterized by their gene expression profiles. One of the melanoma subgroups with particularly poor outcome and limited therapy response is associated with high expression of the receptor tyrosine kinase EGFR, accompanied with low levels of the regulator of the melanocytic lineage, MITF. This work reveals that NRF2 supports a dedifferentiated and pro-invasive melanoma phenotype, partly attributed to the positive effect of NRF2 on EGFR signaling. While NRF2 is able to bind directly to the promoter of the receptor ligand EGF, regulation of EGFR and its ligand TGFα occurs via an indirect mechanism by blocking MITF. Moreover, my study shows that stimulation with EGF leads to NRF2 nuclear translocation and activation, indicating that EGFR and NRF2 interact in a positive feedback loop in melanoma cells. Another transcription factor which plays a pivotal role in regulating adaptation mechanisms, thereby fostering cellular plasticity and therapeutic resistance, is ATF4. The key effector of the integrated stress response (ISR) is activated in response to diverse stress-sensing kinases, which, not unlike NRF2, react to stimuli like nutrient starvation, ROS accumulation or ER stress. Parallels between ATF4 and NRF2 were previously observed, but the underlying reasons were largely unknown. The present work demonstrates an unequivocal link between the ISR and NRF2. Here, ATF4 not only induces NRF2 activation by transcriptional regulation but also metabolically via glutathione (GSH) depletion mediated by the glutathione-degrading enzyme CHAC1. I could show that ATF4-dependent NRF2 activation improves cysteine supply to ensure cellular redox balance by promoting activity of the cystine/glutamate antiporter xCT. Moreover, GSH deprivation can be compensated by NRF2-dependent enhancement of the thioredoxin pathway and NADPH regeneration. In conclusion, my data illustrate that the NRF2 response functions as additional layer of the ISR after induction of ATF4, a finding of significant relevance for comprehending cellular viability and resilience. / Obwohl das maligne Melanom lediglich einen kleinen Teil aller Hautkrebsfälle umfasst, ist es für die Mehrheit der Todesfälle im Zusammenhang mit Hautkrebs verantwortlich und zeichnet sich durch eine weltweit steigende Inzidenz aus. Aufgrund von Therapien mit Immuncheckpoint-Inhibitoren oder kombinierter zielgerichteter Hemmung des MAPK- Signalweges, konnte die Effektivität der Behandlungsmöglichkeiten bei Melanompatient*innen signifikant verbessert werden. Jedoch entwickeln Patient*innen trotz anfänglichen Therapieerfolges häufig Resistenzen oder sprechen auf derzeitig verfügbare Therapie- möglichkeiten nicht an. Zelluläre Bedingungen, welche für das Überleben von Krebszellen herausfordernd sind, werden durch Therapien oder durch das Tumormikromilieu ausgelöst und können zu Anpassungsstrategien führen, welche durch stressinduzierte Transkriptionsfaktor reguliert werden. Eine wichtige Rolle spielt in diesem Kontext der Hauptregulator der oxidativen Stressantwort, NRF2, welcher für die Aufrechterhaltung der zellulären Redox-Homöostase bekannt ist, jedoch tumorfördernde Eigenschaften in mehreren Tumorentitäten aufweist. Das Melanom kann in verschiedene Subtypen unterteilt werden, welche durch ihre Genexpressionsprofile gekennzeichnet sind. Eine Untergruppe des Melanoms, welche eine besonders schlechte Prognose und eine begrenzte Therapieantwort zeigt, wird mit der Heraufregulierung der Rezeptor-Tyrosinkinase EGFR assoziiert, was von einer geringen Expression des Regulators der melanozytären Zellreihe, MITF, begleitet wird. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NRF2 den de-differenzierten und pro-invasiven Phänotypen im Melanom unterstützt, was zum Teil auf den positiven Effekt von NRF2 auf den EGFR-Signalweg zurückzuführen ist. Während NRF2 direkt an den Promotor des Rezeptorliganden EGF binden kann, werden EGFR und dessen Ligand TGFα über einen indirekten Mechanismus durch die Blockierung von MITF reguliert. Des Weiteren zeigt meine Arbeit, dass eine Stimulierung mit EGF zu einer Aktivierung von NRF2 und dessen Translokation in den Zellkern führt, was darauf hinweist, dass EGFR und NRF2 in Melanomzellen mittels einer positiven Rückkopplungsschleife interagieren. Ein weiterer Transkriptionsfaktor, der eine zentrale Rolle in der Regulierung von Anpassungsmechanismen spielt und dabei zelluläre Plastizität und Therapieresistenzen begünstigt, ist ATF4. Als Antwort auf verschiedene stresswahrnehmende Kinasen, welche auf Stressauslöser wie Nährstoffmangel, Akkumulierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) reagieren, wird ATF4 als Haupteffektor der integrierten Stressantwort (ISR) aktiviert. Während Parallelen zwischen ATF4 und NRF2 bereits zuvor beobachtet wurden, waren die zugrunde liegenden Mechanismen bislang weitgehend unbekannt. Die vorliegende Arbeit zeigt die eindeutige Verknüpfung zwischen der ISR und NRF2 auf. Hierbei induziert ATF4 die Aktivierung von NRF2 nicht nur durch transkriptionelle Regulierung, sondern auch auf metabolischer Ebene über den Entzug von Glutathion (GSH), was durch das Enzym CHAC1 abgebaut wird. Ich konnte zeigen, dass die ATF4-abhängige NRF2 Aktivierung die Versorgung mit Cystein verbessert, indem die Aktivität des Cystine/Glutamat Antiporters xCT unterstützt wird, um das zelluläre Redoxgleichgewicht sicherzustellen. Zudem kann der Verlust von Glutathion durch eine NRF2-abhängige Heraufregulierung des Thioredoxin- Signalweges und der Regeneration von NADPH kompensiert werden. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass NRF2 als eine zusätzliche Ebene der ISR nach Induktion von ATF4 fungiert, was von erheblicher Relevanz für das Verständnis von zellulärer Viabilität und Resilienz ist.

Zugl.: Erlangen, Nürnberg, Universiẗat, Diss., 2009.

Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level in a systematic way. However, a detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor (Tb927.11.2400) identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) and demonstrate that it is a result of a gene duplication event, which occurred in African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated a TbFlabarinL-specific antibody and showed that it localizes in the flagellum. The co-immunoprecipitation experiment together with a biochemical cell fractionation indicated a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod. / Trypansomen zeigen sich im Laufe ihres komplexen Lebeszyklus als Meister der Adaption an verschiedene Umweltbedingungen ihrer Wirte. Umfangreiche proteomische Analysen geben systematisch Auskunft über Änderungen auf zellulärer Ebene. Detailierte Arbeit an einzelnen Komponenten ist jedoch nötig, um die Adaptionsmechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen. Wir haben im Rahmen dieser Arbeit eine detaillierte Charakterisierung eines stadienspezifischen mutmaßlich flagellaren Wirtsadaptionsfaktors der Blutstromform (BSF) durchgeführt (Tb927.11.2400), der zuvor in einer SILAC-basierten vergleichenden Proteomstudie idendifiziert wurde. Tb927.11.2400 teilt 38% der mit TbFlabarin (Tb927.11.2410), eines stadienspezifischen flagellaren BAR- domänen Proteins der prozyklischen Form (PCF). Wir haben Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) genannt und zeigen, dass es das Ergebnis eines Genduplikations-Ereignisses darstellt, das in afrikanischen Trypanosomen aufgetreten ist. TbFlabarinL ist nicht essentiell für das Wachstum der Parasiten unter Zellkultur-Bedingungen und entbehrlich für den Differenzierungprozess von BSF zu PCF in vitro. Wir haben einen TbFlabarinL-spezifischen Antikörper entwickelt und zeigen, dass er in der Flagelle lokalisiert. Das Co-immunoprezipitations-Experiment deutet zusammen mit einer biochemischen Zellfraktionierung darauf hin, dass TbFlabarinL mit der flagellaren Membran und Komponenten der paraflagellaren Stab binär assoziiert ist.

München, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.