Selon les estimations de l'OMS, le bilan mondial du paludisme a atteint 212 millions de cas et 429 000 décèsen 2015 (OMS, 2016). Cette gravité est principalement due à Plasmodium falciparum. A l’heure actuelle, P. falciparum présente des résistances à tous les antipaludiques donnés en monothérapie.Par conséquent, pour réduire le risque d’échec thérapeutique, l'OMS a recommandé depuis 2001 l’utilisation de bithérapie, notamment d'Artemisinin Combination Therapy (ACT), comme traitement de première intention.Les ACT sont composés essentiellement d’un dérivé d’artéminisine, à demi-vie courte et un autre antipaludique à demi-vie longue, connu en monothérapie.Le parasite a également montré des signes de résistance aux ACT, principalement en Asie du Sud-est, menaçant les programmes d’éradications contre le paludisme.La découverte de nouveaux composés à activité antipaludique ou de nouvelles procédures de traitement sont urgentes.La valorisation d’anciennes molécules est également au cœur des études afin d’améliorer notamment leur biodisponibilité et réverser les mécanismes de résistance du parasite. Ainsi, des études prouvent l’intérêt de l’utilisation de nanotechnologies pour l’amélioration de l’efficacité d’antipaludiques. L’atovaquone en est un exemple, cette modification a notamment permis d’améliorer sa biodisponibilité. Notre étude a porté sur une de ces formulations, de l’atovaquone encapsulée dans une nanoémulsion cationique (NE) appelée ATQ. Une deuxième génération a ensuite été testée par association d’oligonucléotides antisens anti-ARNm de topoisomérase II(AST) de P. falciparum. En effet, des stratégies antisens thérapeutiques font leur preuve en santé humaine et présentent un intérêt croissant en parasitologie. Les NE/AST ont montré une activité anti-palustre spécifique contre P. falciparum in vitro. Leur spécificité a permis d’aboutir à l’arrêt du cycle cellulaire et une forte diminution du taux d’ARNm de la topoisomérase II. Ce phénomène a montré être dépendant de l’action de la RNase H. Un effet synergique de ces NE/AST a également été montré en association avec la chloroquine, l’atovaquone et la dihydroartémisinine sur une souche sensible de P. falciparum et des souches résistantes aux antipaludiques précédemment cités.L’ATQ a également montré une forte efficacité sur une souche résistante à l’atovaquone d’un facteur 5. En présence d’ATQ, la mitochondrie a rapidement été altérée conduisant à une mort précoce du parasite. Un traitement à l’ATQ a abouti à la guérison de souris Swiss infectée par P. berghei après deux injections en i.v. en 5 jours. Enfin, l’ATQ/AST a montré une efficacité in vitro contre P. falciparum et P. berghei in vivo. Un test de cytoadhérance des hématies parasitées a des cellules endothéliales a révélé un fort pourvoir d’inhibition de la cytoadhérance de l’ATQ/AST.Un résultat prometteur dans le cadre de traitement du neuropaludisme. / According to the estimations of theWHO, in 2015, 212million cases ofmalariahave been reported(WHO,2016). These figuresmakemalariathe most deadlyparasitic diseasein the world, with429.000deaths per year. Some treatments against Plasmodium falciparum exist. However, no really good treatment option can be found in monotherapy due to the resistance emergency. Therefore To reduce the risk of resistance, WHO has recommended since 2001 combination therapies, which is basically an Artemisinin Combined Therapy (ACT), as first-line treatment. The main problem of commercialized bi-therapy is that they are composed of two molecules with individual resistance which leaded to the emergence of resistance to the latest ACTs such as a dihydroartemisinin /piperaquine combinationmainly in South-East Asia.Thus the use of new therapeutic combination strategy that can bypass the parasites' mechanisms of resistance is urgent to effectively treat malaria. As the pathway from drug discovery to drug commercialization is both long and very expensive, it is essential to develop ways to improve existing antimalarial treatments. In the first place it’s necessary to find a new antimalarial formulation based on an already commercialized drug to modify its biodisponibility and its mechanism of action in order to revert the resistance. In the second place its necessary to associate this formulation with a novel none commercialized antimalarial strategy such as the antisens oligonucleotides already usedinhumanhealth. In our lab we have developed nanoemulsions containing atovaquone and antisense oligonucleotides anti topoisomerase II against P. falciparum.Nanoemulsionsvectoringantisens oligonucleotidesandused againstP. falciparum topoisomerase II(NE/AST) showed encouraging anti-parasite killing results.Additionalresultshave showna synergistic in vitro effectwithantimalarial drugs(chloroquine, dihydroartemisinin and atovaquone) in sensitive and resistances strains. Moreover NE/ASTrestricted Topoisomerase II gene expression and blocked the cell cycle in G2/M phase leading to parasite’s death by mitophagy.As Drug delivery systemscan improve the efficacy ofcommon antimalarial drugs by delivering the drug to its target, while protecting it from degradation in biological environment and increasing its biodisponibility, our nanoemulsions containing atovaquone (ATQ) leaded to reversion of atovaquone resistance with 5 fold decrease in its IC50. Observations made with confocal microscopy have shown mitochondrial alteration after ATQ treatment.Our novel and original bi-therapy is focused on the association ofATQ with NE/AST (ATQ/AST).We obtained an IC50 8-fold lower than atovaquone’s IC50with total inhibition of parasites’ capacity to reinfect new red blood cells. A cytoadherence test of parasitized erythrocytes to endothelial cells revealed a strong capacity of cytoadherence inhibition of ATQ / AST, a promising result in the treatment of cerebral malaria.

La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une maladie musculaire autosomique dominante rare. Cette pathologie est causée par la perte des marques épigénétiques répressives au macrosatellite D4Z4 en région subtélomérique du chromosome 4, ce qui conduit à la relaxation de la chromatine, l’expression aberrante du facteur de transcription DUX4 et la dérégulation de centaines de gènes. A ce jour, aucun traitement thérapeutique n’existe pour la FSHD. Le but de ce projet était de déterminer si cibler ou non par des oligonucléotides antisens (AOs) les séquences clés impliquées dans la polyadénylation des ARNm peut-être une stratégie thérapeutique pour inhiber l’expression de DUX4 chez les patients FSHD. En effet, le clivage et la polyadénylation en 3’ des ARNm sont des mécanismes fondamentaux de la maturation des ARNm nécessaires à leur export nucléaire, leur stabilité ou leur traduction efficace. Ces mécanismes représentent donc des cibles intéressantes pour une suppression de l’expression d’un gène dans des maladies à gain de fonction. Pour la première fois, nous avons pu montrer in vitro que l’utilisation d’AOs ciblant les séquences clés impliquées dans l’ajout d’une queue poly(A), notamment le signal de polyadénylation ou le site de clivage, conduit à une sous-expression de l’ARNm gène ciblé, et en particulier DUX4. Les AOs présentant in vivo une faible capacité à pénétrer les cellules et une forte clairance, les séquences des AOs les plus prometteurs ont été insérées dans un vecteur AAV sous promoteur U7. Les premiers résultats obtenus avec ces vecteurs sur un modèle murin sont prometteurs. Cette stratégie innovante apparait comme une option thérapeutique pour la FSHD. / FacioScapuloHumeral Dystrophy (FSHD) is a rare autosomal dominant neuromuscular disorder. This disease is caused by a loss of epigenetic marks within the D4Z4 macrosatellite located in the subtelomeric region of chromosome 4 leading to chromatin relaxation, aberrant expression of the DUX4 transcription factor and a cascade of gene deregulations. So far, there is no curative treatment for FSHD. The aim of this project was to determine whether or not targeting 3’-end key sequences involved in the polyadenylation of mRNA by antisens oligonucleotides (AOs) can be used as an efficient strategy for DUX4 gene silencing in FSHD. Indeed, cleavage and polyadenylation of the 3’-end of mRNAs are fundamental mechanisms of mRNAs maturation required for nuclear export, stability of the mRNAs and efficient translation and consequently could represent interesting targets for suppression of gene expression for gain of function diseases. For the first time, we demonstrated in vitro that targeting 3’-end key sequences involved in the addition of the poly(A) tail, such as the polyadenylation signal and the cleavage site, leads to an efficient extinction of the mRNA targeted and in particular DUX4. Because AOs have a weak cellular uptake and a rapid clearance in vivo, the sequences of the most promising AOs have been vectorised into an AAV vector under the control of the U7 promoter. The first results that we obtained with a FSHD mouse model treated with these vectors are promising. This innovating strategy appears as a therapeutic option for FSHD.

La protéine du TGF-[bêta]1 est une protéine multifonctionnelle qui agit dans plusieurs types cellulaires. Son action varie selon le type de cellulaire. Bien qu'elle ait un rôle inhibiteur chez les astrocytes normaux, elle posséderait un rôle principalement activateur de nombreuses voies carcinogéniques chez les tumeurs astrocytaires primaires malignes. L'isoforme du TGF-[bêta]1 est celle qui est la plus impliquée dans ces processus. Elle joue un rôle dans l'activation des voies d'invasion tissulaire et d'angiogenèse, mais inhibe des mécanismes d'apoptose et d'immunosuppression.La présente étude vise à évaluer l'effet de l'inhibition de la protéine du TGF-[bêta]1 sur le modèle cellules de glioblastome F98/Fischer sur la prolifération et la migration cellulaire. Pour ce faire, un inhibiteur sélectif au récepteur a d'abord été utilisé. Par la suite, des techniques d'inhibitions nucléotidiques (oligoantisens, siRNA, shRNA) ont été testées. Nous avons d'abord validé l'utilisation du modèle F98/Fischer dans l'étude des fonctions du TGF-[bêta]1 et de l'inhibition de la production de cette protéine. Nous avons observé la production importante de TGF-[bêta]1 par les cellules F98 avec des essais immunologiques (Western, ELISA). Avec l'essai ELISA, nous avons observé la production considérable de TGF-[bêta]1 actif d'emblée.La présence de notre protéine d'intérêt a été détectée dans le cerveau de rat Fischer implanté avec les cellules F98 contrairement aux animaux sains qui ne montrent aucune trace de TGF-[bêta]1. Ensuite, nous avons tenté de mettre au point une approche nucléotidique pour inhiber la production du TGF-[bêta]1. Pour les oligoantisens et les siRNA qui ont été couplés avec le vecteur liposomale Metafecten, nous n'avons pas réussi à obtenir de diminution significative du TGF-[bêta]1 dans les surnageants des cultures de F98 . Pour l'approche au shRNA/lentivirus, nous n'avons pas réussi à former de bactéries contenant la construction recherchée. Par la suite, nous avons testé sur notre modèle cellulaire un inhibiteur pharmacologique sélectif, le SB-431642, du récepteur permettant la phosphoryllation de la voie instracellulaire Smad, le T[bêta]R-I. Les essais de prolifération (WST-1) ont permis de constater un ralentissement dans la croissance des F98 traitées au SB-431542. Un essai immunologique western a permis de constater que la production de VEGF était d'ailleurs influencée par cette inhibition du TGF-[bêta]1. L'utilisation d'un vecteur luciférase couplé à un élément de réponse Smad a permis de constater que la voie du TGF-[bêta]1 était bel et bien affectée à la baisse par cet inhibiteur. En effet, le dosage luminescent de la luciférase a permis de noter une diminution significative de sa quantité. L'activité d'un tel vecteur est proportionnelle à l'activité Smad intracellulaire. Nous avons aussi testé cet inhibiteur sur le modèle de croissance tumorale tridimensionnelle de sphéroïdes F98.La croissance des sphéroïdes a été ralentie par la présence de l'inhibiteur et l'invasion de la matrice de collagène observée chez les sphéroïdes contrôles a été freinée par l'ajout de SB-431542. Bien que certains de nos essais n'aient pas donné les résultats escomptés, l'utilisation de l'inhibiteur SB-431542 nous a permis de voir l'implication à du TGF-[bêta]1 dans les mécanismes de progression tumorale chez la lignée cellulaire F98, tel que la prolifération et la migration cellulaire. Ces résultats sont le préalable à d'éventuels essais avec le modèle d'étude animal, le rat Fischer avec l'utilisation de cellules de glioblastomes F98.

Les oligonucléotides (ONs) antisens présentent un fort potentiel en tant qu’agents thérapeutiques. Toutefois, leurs propriétés physicochimiques limitent leur utilisation en thérapie génique. Pour pallier aux divers obstacles, des systèmes de vectorisation, tels que les micelles polyioniques (PICMs), ont été développés. Grâce à leur structure unique, les micelles protégent l’ON contre une dégradation prématurée et le couplage d’un ligand à leur surface augmente leur spécificité et leur internalisation. Dans d’autres systèmes, un polymère adjuvant aux propriétés pH-sensibles peut être ajouté pour faciliter la sortie de l’endosome et augmenter l’efficacité de l’ON. L’objectif général de ce mémoire était de mettre au point des PICMs ternaires ciblées pour l’administration d’ONs. Ces micelles assureraient à la fois l’internalisation cellulaire de leur cargaison en interagissant avec des récepteurs cellulaires et sa fuite de l’endosome grâce à un mécanisme de déstabilisation de la membrane endosomale. Pour cela, des PICMs composées d’un copolymère cationique de type poly(éthylène glycol)-bloc-poly(méthacrylate d’(alkylamino)éthyle) et d’un copolymère d’acide méthacrylique ont été préparées. Les propriétés physicochimiques de ces vecteurs ont démontré qu’ils permettaient une condensation efficace de l’acide nucléique et ce, indépendamment de la nature du polymère cationique et de l’acide nucléique. Finalement, une approche de couplage par pont disulfure a été développée afin de greffer au copolymère un fragment d’anticorps dirigé contre les récepteurs de la transferrine. En conclusion, ces travaux démontrent la versatilité et le potentiel des PICMs ternaires en tant que vecteurs d’acide nucléique, et proposent une méthodologie de couplage d’un ligand afin de formuler des PICMs ciblées. / Antisens oligonucleotides (ONs) present great potential as therapeutic agents. However, their physicochemical properties hinder their use in gene therapy. Targeting systems, such as polyion complex micelles (PICMs), have been proposed to circumvent the main hurdles related to ON delivery. Their unique core/shell structure can protect the ON against premature degradation and the coupling of a ligand on their surface can increase their specificity and internalization. In other systems, a polymer with pH-sensitive properties can be added to facilitate the release of the ON from the endosome and increase its efficiency. The present work was aimed at optimizing ternary PICMs targeted for the delivery of antisens ON. Such systems would provide both cellular internalization of cargo by interaction with receptors on the surface of cell membranes and escape from the endosome through a mechanism of destabilization of the endosomal membrane. PICMs composed of cationic copolymers of poly(ethylene glycol)-bloc-poly((alkylamino)ethyl methacrylate) with a methacrylic acid copolymer adjuvant were prepared. Their physicochemical properties suggest that efficient complexation of nucleic acids was obtained, regardless of the nature of the cationic polymer and the nature of the nucleic acid. Finally, a synthetic approach was developed for the conjugation of an antibody fragment directed against the transferrin receptor via a labile disulfide bond at the end of the cationic copolymer. In conclusion, the work presented herein displays the versatility and potential of ternary PICMs as vehicles for the delivery of ONs and also provides a method for the conjugation of a ligand to generate targeted ternary PICMs.

Les oligonucléotides (ONs) antisens présentent un fort potentiel en tant qu’agents thérapeutiques. Toutefois, leurs propriétés physicochimiques limitent leur utilisation en thérapie génique. Pour pallier aux divers obstacles, des systèmes de vectorisation, tels que les micelles polyioniques (PICMs), ont été développés. Grâce à leur structure unique, les micelles protégent l’ON contre une dégradation prématurée et le couplage d’un ligand à leur surface augmente leur spécificité et leur internalisation. Dans d’autres systèmes, un polymère adjuvant aux propriétés pH-sensibles peut être ajouté pour faciliter la sortie de l’endosome et augmenter l’efficacité de l’ON. L’objectif général de ce mémoire était de mettre au point des PICMs ternaires ciblées pour l’administration d’ONs. Ces micelles assureraient à la fois l’internalisation cellulaire de leur cargaison en interagissant avec des récepteurs cellulaires et sa fuite de l’endosome grâce à un mécanisme de déstabilisation de la membrane endosomale. Pour cela, des PICMs composées d’un copolymère cationique de type poly(éthylène glycol)-bloc-poly(méthacrylate d’(alkylamino)éthyle) et d’un copolymère d’acide méthacrylique ont été préparées. Les propriétés physicochimiques de ces vecteurs ont démontré qu’ils permettaient une condensation efficace de l’acide nucléique et ce, indépendamment de la nature du polymère cationique et de l’acide nucléique. Finalement, une approche de couplage par pont disulfure a été développée afin de greffer au copolymère un fragment d’anticorps dirigé contre les récepteurs de la transferrine. En conclusion, ces travaux démontrent la versatilité et le potentiel des PICMs ternaires en tant que vecteurs d’acide nucléique, et proposent une méthodologie de couplage d’un ligand afin de formuler des PICMs ciblées. / Antisens oligonucleotides (ONs) present great potential as therapeutic agents. However, their physicochemical properties hinder their use in gene therapy. Targeting systems, such as polyion complex micelles (PICMs), have been proposed to circumvent the main hurdles related to ON delivery. Their unique core/shell structure can protect the ON against premature degradation and the coupling of a ligand on their surface can increase their specificity and internalization. In other systems, a polymer with pH-sensitive properties can be added to facilitate the release of the ON from the endosome and increase its efficiency. The present work was aimed at optimizing ternary PICMs targeted for the delivery of antisens ON. Such systems would provide both cellular internalization of cargo by interaction with receptors on the surface of cell membranes and escape from the endosome through a mechanism of destabilization of the endosomal membrane. PICMs composed of cationic copolymers of poly(ethylene glycol)-bloc-poly((alkylamino)ethyl methacrylate) with a methacrylic acid copolymer adjuvant were prepared. Their physicochemical properties suggest that efficient complexation of nucleic acids was obtained, regardless of the nature of the cationic polymer and the nature of the nucleic acid. Finally, a synthetic approach was developed for the conjugation of an antibody fragment directed against the transferrin receptor via a labile disulfide bond at the end of the cationic copolymer. In conclusion, the work presented herein displays the versatility and potential of ternary PICMs as vehicles for the delivery of ONs and also provides a method for the conjugation of a ligand to generate targeted ternary PICMs.