Ce sujet se situe dans le cadre de la mise au point de systèmes de délivrance de composés thérapeutiques ou d’imagerie, c’est à dire d’objets qui doivent transporter des composés dans un organisme et posséder une spécificité pour une zone à traiter ou à imager. Les objectifs de mon travail de thèse étaient l’addition d’une spécificité aux liposomes grâce à la liaison ou l’utilisation de protéines dérivées de l’Annexine 5 (Anx5) et l’encapsulation dans l’espace interne des vésicules de composés permettant le suivi de ces vecteurs. Nous avons tout d’abord mis au point des liposomes pour lesquels l’Anx5 est couplée à l’extrémité d’un lipide-PEG et sert d’élément d’adressage vers des cellules en apoptose. La liaison Anx5 / lipide-PEG a été caractérisée par SDS-PAGE de façon à contrôler la densité de ligand en surface des vésicules. L’influence de cette densité de ligand sur l’efficacité de liaison des vecteurs à des membranes cibles et sur l’agrégation des vésicules a été évaluée par QCM-D et DLS. Il apparait qu’une densité de 60 Anx5 / liposome est un optimum vis-à-vis de ces facteurs. Enfin l’encapsulation de fluorophores a permis d’imager l’interaction des liposomes-Anx5 avec des cellules en apoptose. Pour former des magnétoliposomes nous avons mis au point et caractérisé l’encapsulation de particules d’oxyde de fer dans des liposomes neutres et anioniques. La procédure d’encapsulation passive ainsi que l’influence de la charge membranaire négative et la stabilité des magnétoliposomes ont été évaluées. Le nombre de particules d’oxyde de fer par vésicule a été déterminé par dosages et l’aspect des liposomes a été examiné par cryomicroscopie électronique à transmission. Un maximum d’environ 50 particules par liposome a été encapsulé dans des vésicules de 100nm de diamètre. La présence de lipides anioniques limite l’efficacité d’encapsulation et favorise la déstabilisation des magnétoliposomes. Enfin, la liaison d’anticorps en surface des liposomes grâce à l’Anx5ZZ a été caractérisée et optimisée de façon à utiliser ces anticorps comme éléments d’adressage pour cibler deux pathologies : l’athérosclérose et l’inflammation. La composition lipidique a été optimisée pour encapsuler de façon stable des fluorophores tout en liant des Anx5. Les expériences de caractérisation de la fonctionnalisation par DLS et FRET nous ont conduits à choisir une séquence pour l’association des anticorps qui consiste a associer les anticorps aux Anx5ZZ dans un premier temps à lier ce complexe en surface des liposomes. Deux anticorps ont été utilisés pour vérifier les capacités d’adressage des vecteurs vers des cibles biologiques, tout d’abord ex vivo sur des modèles de plaques d’athérome puis ex et in vivo sur des rats présentant des zones d’inflammation. L’ensemble de ces travaux ont donc consistés à mettre au point des liposomes fonctionnalisés avec des dérivés d’Anx5 et encapsulant des éléments dans l’espace interne des vésicules. Ces vecteurs ont étés utilisés pour imager des cibles biologiques. / This subject is in the framework of drug or imaging agent delivery system. This object must carry compound in an organism and selectively recognize a target area. The aims of my work were to add a targeting element to liposomes by use of Anx5 derivative and to encapsulate imaging compound inside the aqueous inner space. First we designed Anx5-bearing liposomes with the Anx5 protein covalently linked at the distal end of a PEG-lipid and used as targeting element. Anx5 conjugation was monitored by SDS-PAGE in order to control Anx5 density on the liposome surface. The influence of ligand density on the efficiency of binding to target membranes and on solutions dispersity was assessed by QCM-D and DLS. A density of 60 Anx5 / liposomes ensure the best target recognition efficiency and dispersity. Finally fluorescent dyes encapsulation was used to image the interaction between Anx5 bearing liposomes and apoptotic cells. To prepare magnetoliposomes we have synthesized and characterized the encapsulation of iron oxide nanoparticle inside neutral and anionic liposomes. The passive encapsulation procedure, the influence of the negative charge and the magnetoliposome stability were evaluated. The number of particle / vesicle was assayed and the liposomes aspect was examined using cryoelectron microscopy. An average of 50 particles / liposomes was encapsulated inside 100nm vesicles. Anionic lipids limit the encapsulation efficiency and promote liposomes destabilization. Finally the use of Anx5ZZ to anchor antibodies on the liposomes surface was characterized and optimized to use antibodies as homing device to target two diseases: atherosclerosis and inflammation. Lipid composition was optimized to stably entrap fluorescent dyes while Anx5 are bound on the membrane. To functionalize the vector, DLS and FRET experiment leads us to choose a sequence that consists in associating antibodies to the Anx5ZZ in a first time and then binding this complex on the liposome surface. Two antibodies were used to address the liposome toward biological targets, ex vivo on atherosclerosis models and in vivo on rats bearing inflammation areas.

Ce travail, qui fait partie d’un projet européen, « NANOTHER », est focalisé sur la fonctionnalisation de nanoparticules polymériques et lipidiques fonctionnalisées par des anticorps Herceptine® pour cibler des cellules du cancer du sein HER2+. Deux stratégies de fonctionnalisation ont été étudiées : une a reposé sur l’utilisation de protéines de fusion, l’Anx5-ZZ, composée d’Annexine A5 et deux domaines Z homologues de la protéine A de Staphylococcus aureus qui peuvent se fixer des anticorps d’une manière orientée par leur fragment cristallisable ; l’autre a porté sur le couplage direct d’anticorps modifiés pour exposer des groupes sulfhydryles aux nanoparticules exposant des groupes maléimides.La première partie concerne le développement d’un agent de ciblage simplifié du complexe l’Anx5-ZZ-anticorps, à savoir l’Anx5-scFv (single-chain variable fragment). Puisque la cible n’avait pas été décidée au début de ce travail, deux scFvs ont été utilisé comme système modèle. L’expression de protéines de fusion a été essayée chez Escherichia Coli avec différentes constructions de protéines de fusion, différentes conditions d’expression et différentes souches bactériennes. Toutes les protéines sont soient agrégées soient non surexprimées.La deuxième partie consiste à fonctionnaliser les polymersomes par l’Herceptine® via l’Anx5-ZZ. D’abord, nous avons validé une méthode de modification de la surface de polymersome pour présenter des groupes maléimides. Ensuite, le couplage covalent de l’Anx5(SH)-ZZ aux polymersomes-maléimide a été réalisé et quantifié. Nous avons obtenu maximum 30 Anx5-ZZ par polymersome. Puis, la liaison d’affinité d’anticorps aux polymersomes-Anx5-ZZ a été caractérisée, réalisée et quantifiée. Pour 30 Anx5-ZZ par polymersome, nous avons 60 Herceptine® par polymersome. Cependant, l’efficacité de ciblage de ces systèmes est très faible.La troisième partie consiste à fonctionnaliser les liposomes par l’Herceptine® via couplage direct. Tout d’abord, la modification de l’Herceptine® pour présenter des groupes SH a été caractérisée et contrôlée. Ensuite, le couplage covalent d’Herceptine®-SH aux liposomes-maléimides a été réalisé et quantifié. L’étude de ciblage montre que les liposomes fonctionnalisés par une molécule d’Herceptine® sont capable de cibler les cellules HER2+. / This work, which is part of a European project "NANOTHER", focus on the functionalization of polymeric and lipidic nanoparticles by Herceptin® to target HER2+ cancer cells. Two functionalization strategies were studied: one was based on the use of a fusion protein, Anx5-ZZ, composed of Annexin A5 and two Z domains which are homologous with the protein A of Staphylococcus aureus that can bind antibodies by their crystallizable fragment in a oriented way; the other focused on the direct coupling of modified antibodies exposing sulfhydryl groups to nanoparticles exposing maleimid groups.The first part concerns the development of a targeting agent simplified from the Anx5-ZZ-antibody complex, namely Anx5-scFv (single-chain variable fragment). Since the target had not been decided at the beginning of this work, two scFvs were used as model system. The expression of fusion proteins was tested in Escherichia coli with different fusion protein constructions, different expression conditions and different bacterial strains. All proteins are either aggregated or non-overexpressed.The second part is to functionalize the polymersomes by Herceptin® via Anx5-ZZ. First, we validated a method for modifying the surface of polymersome to expose maleimid groups. Then, the covalent coupling of Anx5(SH)-ZZ to polymersomes-maleimid was performed and quantified. We obtained maximum 30 Anx5-ZZ per polymersome. Then, the affinity binding of antibodies to polymersomes-Anx5-ZZ was characterized, performed and quantified. For 30 Anx5-ZZ per polymersome, we have 60 Herceptin® per polymersome. However, the targeting efficiency of this system is very low.The third part consists in functionalizing the liposomes by Herceptin® via direct coupling. Firstly, the modification of Herceptin® to expose SH groups was characterized and controlled. Then, the covalent coupling of Herceptin®-SH to liposomes exposing maleimid groups was performed and quantified. The targeting study shows that liposomes functionalized with one Herceptin® are able to target HER2+ cells.