Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:01:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_DanielHenriquedoAmaral_D.pdf: 14618006 bytes, checksum: 0865223d71dcf2f775b71ebcedecc875 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Proteínas enoveladas incorretamente, com freqüência levam à formação de agregados fibrilares contendo extensas estruturas em folha-?, comumente denominadas de fibrilas amilóides. A hipótese acerca da capacidade de formar fibrilas amilóides com estruturas idênticas e ricas em estruturas beta, ser uma propriedade genérica de toda proteína, apoia-se no fato de até mesmo proteínas sem conexão com doenças, como a mioglobina, serem capazes de gerar estruturas fibrilares. Embora várias proteínas sejam intrinsecamente desordenadas, muitas são apropriadamente empacotadas, podendo se desenovelar totalmente ou parcialmente de maneira a expor regiões propensas à agregação, que podem converter o polipeptídeo em fibrilas amilóides. De fato, vários estudos sugerem que intermediários parcialmente enovelados estão envolvidos na fibrilogênese. A apomioglobina (apoMb) de baleia do espermacete é uma proteína bem caracterizada, que forma um intermediário durante o desenovelamento do estado nativo ou após a diluição do estado desenovelado em tampão de enovelamento. A mioglobina é uma proteína altamente solúvel, cujas propriedades do estado nativo não sugerem uma predisposição dessa em formar fibrilas amilóides, corroborado pela organização de sua seqüência de resíduos de aminoácidos em hélices-? bem definidas sem elementos de estrutura em folha-?. Contudo, até a mioglobina forma fibrilas amilóides em certas condições, sugerindo que a capacidade de formar fibrilas seja uma característica comum de toda proteína e, portanto, não estando relacionada a uma estrutura primária específica. Neste projeto, visamos mapear as potenciais interações envolvidas na agregação e formação de fibrilas amilóides em apomioglobinas. Para tanto, apresentamos aqui os estudos dos efeitos de 19 mutantes de apoMb na cinética amiloidogênica da mesma. A indução de fibrilas amilóides foi realizada através da incubação das apoMbs em tampão borato de sódio 50 mM, pH 9 e aquecidas a 65°C. O processo de agregação foi acompanhado por medidas da emissão de fluorescência de Tioflavina T (ThT) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Outras propriedades morfo-fisicoquímicas das amilóides de apoMb foram também estudadas: energia de ativação da formação de fibrilas, organização estrutural, citotoxicidade, efeito de semeadura, desmontagem por uréia. Nossos resultados mostram que alguns mutantes (7 no total) afetaram a cinética de formação das amilóides, e surpreendentemente, esses efeitos correlacionam-se bem com o efeito que a mutação tem sobre a estabilidade do estado nativo, mas não com o efeito sobre a estabilidade do estado intermediário do enovelamento. As estruturas globais (investigadas por difração de raios-X) das fibrilas formadas pelas ampomioglobinas selvagem e mutantes mostram-se indistinguíveis. Experimentos de citotoxicidade, utilizando um modelo de células neuronais N2A (neuroblastoma de camundongo), e semeadura, confirmam que as diferentes formas de agregados das proteínas são capazes de diminuir a viabilidade celular e de acelerar a formação das fibrilas. Generalizando, nossos resultados suportam a hipótese de que, embora o desenovelamento parcial preceda a formação de fibrilas em apomioglobina, a formação do intermediário de enovelamento não parece ser um passo obrigatório no processo e assim, o enovelamento e a formação de agregados/fibrilas são aparentemente distintos para essa proteína. / Abstract: Protein misfolding usually leads to the formation of fibrillar aggregates with extensive ?-sheet structure, commonly termed amyloid fibrils. The hypothesis that the ability to form ordered ?-rich amyloid fibers with identical structures is a generic property of proteins is supported by the fact that even proteins with no connection to disease, such as myoglobin, are able to generate fibrillar structures. Although several proteins are intrinsically disordered, many are properly packed and should unfold totally or partially exposing aggregation-prone regions that can convert the polypeptide into amyloid fibrils. Actually, several studies suggest that partially folded intermediates are involved in fibrillogenesis. Sperm whale apomyoglobin (apoMb) is a well-characterized protein that forms an intermediate after either unfolding from the native state or dilution of the unfolded protein in a folding buffer. Mb is a highly soluble protein whose native state properties do not suggest a predisposition to form amyloid fibrils, corroborated by its amino acid residues sequence organization in well-defined ?-helices with no ?-sheet elements. However, even Mb forms amyloid fibrils under certain conditions, suggesting that the ability to form fibrils is a common feature of all proteins and is not related to a specific primary structure. In this work, we aim to map potential interactions involved in apomioglobin aggregation and fibrils formation. To such aim, we present here the studies of effects on amiloidogenic kinetics of 19 apoMb mutants. The induction of amyloid fibrils was performed by incubating apoMb proteins on 50 mM sodium borate buffer at pH 9 and heat to 65°C. The aggregation process was monitored both by thioflavin T (ThT) emitted fluorescence and circular dichroism (CD) spectroscopy measurements. Other morph-physicochemical properties of apoMb amyloids were also studied: activation energy of fibril formation, structure organization, cytotoxicity, seeding effect, disassembly by urea. Our results show that some mutants (7 in total) affect the amyloid formation kinetics, and surprisingly, these effects are well correlated with the effect that the mutation has on the stability of the native state but not with the effect on the stability of the folding intermediate. The overall structures, probed by X-ray diffraction, of fibers formed by mutants and wild-type apomyoglobin are indistinguishable. Cytotoxicity experiments, using a neuronal cell line model N2A (murine neuroblastoma), and seeding experiments, confirm that different aggregated forms of proteins are capable of decreasing the cell viability and to speed up the formation of fibrils. Generally, our results support the hypothesis that although partially unfolding precedes fibril formation in apomyoglobin, formation of the folding intermediate is not an obligatory step in the process and thus folding and aggregation/fibril formation are apparently distinct in this protein. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular