Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T11:57:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Regis_WiliamCesarBento_D.pdf: 2288615 bytes, checksum: 63ccd34d93524d993a42e51b4e2f9855 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os estudos em biologia estrutural avançaram muito nos últimos anos e inúmeras informações, obtidas principalmente por dados cristalográficos, ajudaram no entendimento dos mecanismos de ação e efeito biológico de várias proteínas contudo o caminho que vai da síntese até a estruturação dde uma porteína aidna é pouco conhecido. Uma descrição termodinâmica detalhada de proteínas é fundamental para se entender seu papel biológico e conhecer as interações e forças que determinam o enovelamento. Este é o foco pincipal deste trabalho que utilizou para isso as mioglobinas de baleia e de cavalo. O estudo da apomioglobina se divide quase igualmente entre as proteínas oriundas de espermacete, a qual está clonada, e de cavalo, a qual é obtida comercialmente. Ambas possuem alta homologia e comportamento similar quanto ao enovelamento, assumindo-se em geral que estas proteínas apresentam o mesmo fenômeno no que diz respeito ao enovelamento. Contudo, esta hipótese pode não ser verdadeira, o que torna necessário medir e comparar a estabilidade destas proteínas. Apenas recentemente um método confiável para medir a estabilidade de mioglobina em uma reação reversível foi implantado: análise do desenovelamento por uréia de um derivado ciano de mioglobina em uma faixa de pH limitado. Nossos resultados mostraram que a mioglobina de cavalo é 2,1 kcal/mol menos estável que a mioglobina de espermacete em pH 5,0 e 25 ºC. Além disso, a mioglobina de cavalo agregou em altas concentrações, como medido por experimentos de gel filtração e ultracentrifugação analítica. A alta estabilidade da mioglobina de espermacete foi identificada tanto para a forma apoquanto para a forma holo e se mostrou independente de pH, na faixa de 5 até 8, e da presença de até 200 mM de cloreto de sódio. A substituição dos resíduos de alanina nas posições 15 e 74 por glicina, encontrados na mioglobina de cavalo, diminuiu a estabilidade da proteína em 1,0 kcal/mol. As apoproteínas de mamíferos que mergulham são significativamente mais estáveis do que as apoproteínas de mamíferos terrestres. Este fenômeno pode ser explicado pela suposição de que sob pressão seletiva um acúmulo de mutações que levam a pequenas estabilizações nas características globais de estabilidade das proteínas. Mamíferos que mergulham em grandes profundidades, como a baleia, são expostos a anaerobiose prolongada e conseqüente condições de acidose. Isto pode levar a uma série de acúmulos de mutações que promoverão resistência ao desenovelamento e a perda do grupo heme, fenômenos que podem ocorrer durante a acidose (Tang et al., 1998). Os resultados deste trabalho indicaram que a propensão a formação de hélices é um componente importante para explicar as diferenças de estabilidade entre as mioglobinas de cavalo e de espermacete / Abstract: The work in the literature on the stability and folding pathway of myoglobin is almost equally divided between horse myoglobin, which is available commercially, and sperm whale myoglobin, which must be cloned and expressed. The two proteins share high homology, show similar folding behavior and it is often assumed that all folding phenomena found with one protein will also be found with the other. This assumption may not be true, which makes essential to compare their basic properties, such as stability and dependence on temperature and salt concentration. However, no reliable method have been used to access the precisely difference in stability between these two proteins because it was not possible until recently to measure the stability of holoMb in a reversible unfoldingr efolding reaction. The reversible folding of myoglobin can be measured by using the cyanmet derivative and urea unfolding but only in a limited pH range. We report data at equilibrium showing that horse myoglobin was 2.1 kcal/mol less stable than sperm whale myoglobin at pH 5.0, 25 ºC, and aggregated at high concentrations as measured by gel filtration and analytical ultracentrifugation experiments. The higher stability of sperm whale myoglobin was identified for both apo and holo forms, and was independent of pH from 5 to 8 and of the presence of sodium chloride. We also show that the substitution of sperm whale myoglobin residues Ala15 and Ala74 to Gly, the residues found at positions 15 and 74 in horse myoglobin, decreased the stability by 1.0 kcal/mol, indicating that helix propensity is an important component of the explanation for the difference in stability between the two proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Anna Wedell / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soardi_FernandaCaroline_D.pdf: 4267789 bytes, checksum: 80c77e1664dcc041014d42a92bdd435e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A causa mais freqüente de hiperplasia congênita da adrenal (HCA) é a deficiência da enzima CYP21A2 responsável por cerca de 90% dos casos, seguida da deficiência de CYP11B1, a qual é responsável por 5-8%. A deficiência de CYP21A2 apresenta diferentes sintomas clínicos, que podem variar de uma forma leve não clássica (NC) a uma forma grave clássica, dividida em virilizante simples (VS) e perdedora de sal (PS). Enquanto a deficiência de CYP11B1 é classificada nas formas clássica e não-clássica, dependendo da gravidade do fenótipo. As diferentes formas destas deficiências estão associadas a mutações distintas ou a combinação de mutações nos genes, sendo estas mutações provenientes dos genes homólogos ou não. O primeiro objetivo desta tese foi identificar novas mutações em alelos de 31 pacientes. As variantes protéicas novas p.G56R, p.L107R e p.L142P e, as raras p.H62L, p.H62L+p.P453S e p.R408C do gene CYP21A2 foram expressas para comparar as atividades da enzima CYP21A2 nas suas formas normal e mutantes. Foi objetivo, também, estudar através da técnica de mini-genes as possíveis alterações no processo de splicing para as variantes IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E do gene CYP21A2 e para a variante g.1753G>A do gene CYP11B1. O estudo da atividade enzimática do gene CYP21A2, realizado pela técnica de mutagênese sítio-dirigida, demonstrou que as mutações p.L107R, p.L142P e p.R408C reduziram a atividade enzimática para valores praticamente nulos, classificando-as como responsáveis pela forma PS. A alteração p.G56R apresentou uma quantidade mínima de conversão de progesterona em desoxicorticosterona, quantidade suficiente para evitar a perda de sal, sendo considerada clássica associada à forma VS. A mutação p.H62L foi encontrada no mesmo alelo que a mutação p.P34L, em uma das pacientes da casuística desse trabalho, ambas inseridas num gene quimérico portador da deleção de 30 Kb. A mutação p.H62L também foi encontrada em associação com a mutação p.P453S, em dois pacientes de origem Escandinava. No estudo funcional a mutação p.H62L reduziu parcialmente a atividade enzimática. Os resultados cinéticos classificaram essa mutação como relacionada à forma NC da deficiência de CYP21A2. Em combinação com a mutação p.P453S, observou-se um sinergismo, uma vez que reduziu a atividade da enzima para a faixa limítrofe entre NC e VS. A investigação no processo de splicing utilizando a técnica de minigenes para as alterações no gene CYP21A2 indicou que a variação IVS2+5G>A causa a perda do exon 2 na formação do mRNA, sendo relacionada à forma PS. Da mesma forma, a variação IVS2- 2A>G foi classificada como associada à forma PS, pois inseriu no mRNA 19 bases provenientes do intron 2 na junção exon2-exon3, o que modificou o frame de leitura do mRNA criando um códon de parada prematura. Por outro lado, ficou demonstrado que as variações IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E não interferem no processamento normal do mRNA do gene CYP21A2. No caso da alteração g.1753G>A no gene CYP11B1, que foi classificada como responsável pela forma clássica da deficiência de CYP11B1, o estudo de mini-gene indicou a perda dos últimos 45 nucleotídeos do exon 4, criando um códon de parada prematura. A elucidação do papel funcional e estrutural das mutações nos genes estudados permitiu o correto estabelecimento da correlação genótipo-fenótipo na maioria dos pacientes com HCA estudados / Abstract: Deficiency of CYP21A2 enzyme is responsible for more than 90% of congenital adrenal hyperplasia (CAH) followed by the deficiency of CYP11B1, which is responsible for 5-8% of the cases. The deficiency of CYP21A2 is normally classified in clinical forms that vary from a mild non-classical (NC) to a severe classical form, which can manifest as salt wasting (SW) or as simple virilizing (SV). Depending on the severity of phenotype, deficiency of CYP11B1 can be classified in classical or non-classical forms. In both deficiencies the clinical forms are associated with different mutations or combination of mutations, which may or may not be originated from the homologous genes. The aim of this study was to identify novel or rare mutations in alleles of 31 patients with CYP21A2 deficiency. Using site-direct mutagenesis strategies, nucleotide variants were introduced into the cDNA and the novel p.G56R, p.L107R and p.L142P and rare p.H62L, p.H62L+p.P453S and p.R408C protein variants of CYP21A2 were expressed to compare the enzymatic activity between the wild-type and mutant proteins. Furthermore, splicing activities were investigated for IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4-15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E sequence CTP21A2 variations and for g.1753G>A on CYP11B1 gene by minigene constructions. The analysis of enzymatic conversion of both CYP21A2 substrates, 17-hydroxyprogesterone and progesterone, into 11-desoxycortisol and corticosterone, respectively, showed low levels of residual activities for p.L107R, p.L142P and p.R408C, which were classified as SW mutations. Whereas, the result of enzyme activity for p.G56R indicated that it might be a SV-related mutation due a residual activity of 1.4% toward progesterone as substrate. The p.H62L was associated to p.P34L mutation in a chimeric gene present in a 30-kb deletion allele in Brazilian patients. In Scandinavian patients, the p.H62L mutation was found associated to the p.P453S which is known as a NC mutation. The p.H62L itself showed an activity within the range of NC mutations. The apparent kinetic constant confirmed this classification. A synergistic effect was observed for the allele bearing the p.H62L+p.P453S combination as it had caused a significant reduction in the enzymatic activity bringing it to the borderline level between SV and NC mutations. On the minigene analyses for CYP21A2, the IVS2+5G>A variation showed skipping of exon 2, therefore this alteration was classified as SW mutation. Likely, IVS2-2A>G was considered as a SW mutation due to the insertion of 19 nucleotides from intron 2 into the resulting mRNA, which changed the reading frame and created a premature stop codon. Conversely, the group of variations IVS4-15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E did not affect the normal splicing of CYP21A2 mRNA. In the CYP11B1 minigene analysis, the g.1753G>A nucleotide variation was classified as responsible for the classical form of deficiency. An alternative splicing due to disruption of the normal donor site was used and the skipping of the last 45 nucleotides of exon 4 was observed. This alteration modified the mRNA reading frame and created a premature stop codon. The elucidation of functional and structural characters of the steroidogenic gene mutations led to the establishment of a correct genotype-phenotype in most patients studied. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Petroli_ReginaldoJose_D.pdf: 6228632 bytes, checksum: e6e99d402e3d99ccab57c84290065e84 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O receptor de andrógenos (AR) é um fator de transcrição pertencente à superfamília de receptores nucleares e é ativado por fosforilação e dimerização sob a ligação ao hormônio. Várias funções são atribuídas a este receptor, sendo a principal delas o desenvolvimento e manutenção das características sexuais masculinas, atua na regulação da expressão gênica e diferenciação celular em tecidos alvos. O presente trabalho teve por objetivo principal a análise do efeito das mutações p.Pro695Ser, p.Ser759Tre, p.Leu768Val., p.Cis806Fen+p.Gln798Glu, p.Leu830Fen, p.Ile898Fen e p.Pro904Arg sobre a função do AR. As mutações acima citadas, localizadas no domínio de ligação ao hormônio, foram identificadas por sequenciamento direto do gene do AR de pacientes 46,XY com diferentes graus da Síndrome da Insensibilidade Androgênica (AIS). Mutações nesse domínio geralmente rompem a ligação aos andrógenos naturais, porém há algumas que não afetam essa ligação, mas interferem na interação entre os domínios amino e carboxi-terminal (N/C terminal), importante para a estabilização receptor-ligante. Assim, ambas funções foram investigadas. Para se avaliar a capacidade de transativação das proteínas AR mutantes, foi realizada a técnica de mutagênese sítio dirigida no cDNA completo, seguida de transfecção e expressão em células e mamíferos e, análise de transativação induzida por concentrações crescentes de 5?-diidrotestosterona (DHT) utilizando-se um gene repórter. A análise das interações N/C-terminal para cada AR mutante foi realizada pela técnica de duplo-híbrido em células de mamíferos. A mutação p.Pro695Ser apresentou atividades de transativação de 85% e 82% nos ensaios transativação com o cDNA completo e no duplo-híbrido, respectivamente, em valores de DHT fisiológicos (cerca de 1 nM). As atividades atingiram valores normais em concentrações elevadas de DHT indicando um baixo efeito sobre a atividade gonadal. No entanto, em concentrações de DHT inferiores a atividade de transativação decai para menos de 50% nos dois experimentos, podendo afetar as funções do AR em tecidos não gonadais. Esta mutação foi considerada "branda" e corresponde perfeitamente ao fenótipo masculino do paciente que se apresentava com ginecomastia, mas com fertilidade preservada. Com 1 nM de hormônio, as mutações p.Ser759Tre, p.Leu830Fen, p.Ile898Fen apresentaram atividade de transativação superior a 20%, havendo um aumento de resposta com concentrações crescentes. No entanto, o comportamento de cada uma no experimento de interação N/C diferiu sendo que a p.Ile898Fen não apresentou atividade em nenhuma concentração de ligante; as p.Ser759Tre e p.Leu830Fen responderam positivamente ao aumento da concentração de DHT atingindo 50% e 250% da atividade trancricional do receptor selvagem, respectivamente. Esses resultados indicam um fenótipo parcial de AIS (PAIS) para os portadores das mutações p.Ser759Tre e p.Leu830Fen. Nesses casos verificou-se uma boa correlação dos achados funcionais com os fenótipos dos pacientes que apresentavam graus variados de PAIS. Já para a mutação p.Ile898Fen o fenótipo esperado baseando-se nos resultados funcionais seria o de AIS na forma completa (CAIS), porém os pacientes portadores desta mutação apresentavam graus variados de ambiguidade genital compatíveis com o fenótipo PAIS. Isto indica que outros fatores devem estar influenciando a manifestação fenotípica nesse caso. A mutação p.Leu768Val apresentou atividade transcricional nula em 1 nM de DHT nos dois experimentos, um perfil típico do fenótipo CAIS apresentado pelo portador desta mutação. As mutações p.Gln798Glu e p.Cis806Fen estudadas separadamente apresentaram respostas à indução de DHT semelhantes às de mutações "brandas" e PAIS, respectivamente. No entanto, quando estudadas em conjunto, a atividade de transativação com 1 nM foi inferior a 10%, aumentando com o aumento da concentração de ligante, comportamento compatível com mutações mais graves resultando no fenótipo CAIS observado nesse caso. Por último, a mutação p.Pro904Arg, embora tenha reduzido a atividade trancricional para cerca de 20% da selvagem no experimento com o cDNA completo, no experimento com duplo híbrido a atividade foi nula indicando uma ação mais grave compatível com a forma CAIS observada. A análise funcional do AR aqui realizada pode elucidar alguns mecanismos moleculares associados a cada mutação, bem como pode fornecer subsídios para a resposta ao tratamento com DHT em cada caso em particular / Abstract: The androgen receptor (AR) is a transcription factor that belongs to the superfamily of nuclear receptors activated by phosphorylation and dimerization by hormone binding. Several functions are attributed for AR, like male sex development, regulation of gene expression and cell differentiation in target tissues. The aim of this study was to analyze the effect of mutations p.Pro695Ser, p.Ser759Tre, p.Leu768Val, p.Cys806Phe+ p.Gln798Glu, p.Leu830Phe, p.Ile898Phe and p.Pro904Arg upon AR transactivation activity. All mutations studied here are located in the hormone-binding domain and were identified in patients with different degrees of androgen insensitivity syndrome (AIS) by AR gene sequencing. Mutations in this domain can result in the impairment of androgen ligation, but there are cases that it does not affect the binding but interfere with the interaction between the amino and carboxi-terminal domains (N/C terminal), important step for receptor-binding stabilization. Thus, both functions have been studied in this work. To evaluate the ability of AR transactivation of mutant proteins, the site-directed mutagenesis assay was performed on full-length cDNA, followed by transfection and expression in mammalian cells. The analysis of transactivation of a reporter gene with different dihydrotestosterone (DHT) concentrations was performed. The analysis of N/C-terminal interactions for each mutant AR was performed by two- hybrid mammalian assay. The mutation p.Pro695Ser reveled transactivation activities of 85% and 82% in transactivation assays with the full-length cDNA and two hybrid assay, respectively, at DHT physiological values (approximately 1 nM). The activities reached normal values at high DHT concentrations, indicating a low effect on gonadal activity. However, in low DHT concentrations, the transactivation activity decays to less than 50% in both experiments, which may affect AR functions in non-gonadal tissues. This mutation was considered "mild" and corresponds perfectly to the male phenotype of the patient who presented with gynecomastia, but with preserved fertility. With 1 nM hormone, the p.Ser759Tre, p.Leu830Phe, p.Ile898Phe mutations showed transactivation activity higher than 20%, the response increased with higher DHT concentrations. However, in N/C interaction assays, those mutations showed different results. The p.Ile898Phe revealed a complete disruption in N/C interaction at all hormone concentrations; the p.Ser759Tre and p.Leu830Phe showed positive response with the increasing in DHT concentrations and reached 50% and 250% of the transcriptional activity of wild type, respectively. Such results indicate a partial AIS phenotype (PAIS) as functional effect for p.Ser759Tre and p.Leu830Phe. In these cases there was a positive correlation with the phenotypes of patients that presented different degrees of PAIS. For the p.Ile898Phe, the expected phenotype based on functional analysis would be the complete form of AIS (CAIS), but the patients with this mutation had variable degrees of genital ambiguity consistent to PAIS. This indicates that other factors must influence the phenotypic manifestation. The p.Leu768Val revealed a complete disruption at 1 nM DHT in both experiments, typical of CAIS. The p.Gln798Glu and p.Cys806Phe mutations studied separately revealed responses to the induction of DHT similar to Mild and Partial phenotypes, respectively. However, when analyzed together, the transactivation activity of 1 nM was lower than 10%, increasing in high ligand concentration, which is consistent to CAIS phenotype. Finally, p.Pro904Arg, although showed residual transcriptional activity around 20% of the wild type in the experiment with the full-length cDNA, it abolished the transcriptional activity when N/C terminal interaction was tested indicating a CAIS phenotype, as observed in the patient. Functional analysis of the AR performed here could elucidate some molecular mechanisms associated with each mutation, and may provide a basis for response to treatment with DHT in each particular case / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:01:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_DanielHenriquedoAmaral_D.pdf: 14618006 bytes, checksum: 0865223d71dcf2f775b71ebcedecc875 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Proteínas enoveladas incorretamente, com freqüência levam à formação de agregados fibrilares contendo extensas estruturas em folha-?, comumente denominadas de fibrilas amilóides. A hipótese acerca da capacidade de formar fibrilas amilóides com estruturas idênticas e ricas em estruturas beta, ser uma propriedade genérica de toda proteína, apoia-se no fato de até mesmo proteínas sem conexão com doenças, como a mioglobina, serem capazes de gerar estruturas fibrilares. Embora várias proteínas sejam intrinsecamente desordenadas, muitas são apropriadamente empacotadas, podendo se desenovelar totalmente ou parcialmente de maneira a expor regiões propensas à agregação, que podem converter o polipeptídeo em fibrilas amilóides. De fato, vários estudos sugerem que intermediários parcialmente enovelados estão envolvidos na fibrilogênese. A apomioglobina (apoMb) de baleia do espermacete é uma proteína bem caracterizada, que forma um intermediário durante o desenovelamento do estado nativo ou após a diluição do estado desenovelado em tampão de enovelamento. A mioglobina é uma proteína altamente solúvel, cujas propriedades do estado nativo não sugerem uma predisposição dessa em formar fibrilas amilóides, corroborado pela organização de sua seqüência de resíduos de aminoácidos em hélices-? bem definidas sem elementos de estrutura em folha-?. Contudo, até a mioglobina forma fibrilas amilóides em certas condições, sugerindo que a capacidade de formar fibrilas seja uma característica comum de toda proteína e, portanto, não estando relacionada a uma estrutura primária específica. Neste projeto, visamos mapear as potenciais interações envolvidas na agregação e formação de fibrilas amilóides em apomioglobinas. Para tanto, apresentamos aqui os estudos dos efeitos de 19 mutantes de apoMb na cinética amiloidogênica da mesma. A indução de fibrilas amilóides foi realizada através da incubação das apoMbs em tampão borato de sódio 50 mM, pH 9 e aquecidas a 65°C. O processo de agregação foi acompanhado por medidas da emissão de fluorescência de Tioflavina T (ThT) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Outras propriedades morfo-fisicoquímicas das amilóides de apoMb foram também estudadas: energia de ativação da formação de fibrilas, organização estrutural, citotoxicidade, efeito de semeadura, desmontagem por uréia. Nossos resultados mostram que alguns mutantes (7 no total) afetaram a cinética de formação das amilóides, e surpreendentemente, esses efeitos correlacionam-se bem com o efeito que a mutação tem sobre a estabilidade do estado nativo, mas não com o efeito sobre a estabilidade do estado intermediário do enovelamento. As estruturas globais (investigadas por difração de raios-X) das fibrilas formadas pelas ampomioglobinas selvagem e mutantes mostram-se indistinguíveis. Experimentos de citotoxicidade, utilizando um modelo de células neuronais N2A (neuroblastoma de camundongo), e semeadura, confirmam que as diferentes formas de agregados das proteínas são capazes de diminuir a viabilidade celular e de acelerar a formação das fibrilas. Generalizando, nossos resultados suportam a hipótese de que, embora o desenovelamento parcial preceda a formação de fibrilas em apomioglobina, a formação do intermediário de enovelamento não parece ser um passo obrigatório no processo e assim, o enovelamento e a formação de agregados/fibrilas são aparentemente distintos para essa proteína. / Abstract: Protein misfolding usually leads to the formation of fibrillar aggregates with extensive ?-sheet structure, commonly termed amyloid fibrils. The hypothesis that the ability to form ordered ?-rich amyloid fibers with identical structures is a generic property of proteins is supported by the fact that even proteins with no connection to disease, such as myoglobin, are able to generate fibrillar structures. Although several proteins are intrinsically disordered, many are properly packed and should unfold totally or partially exposing aggregation-prone regions that can convert the polypeptide into amyloid fibrils. Actually, several studies suggest that partially folded intermediates are involved in fibrillogenesis. Sperm whale apomyoglobin (apoMb) is a well-characterized protein that forms an intermediate after either unfolding from the native state or dilution of the unfolded protein in a folding buffer. Mb is a highly soluble protein whose native state properties do not suggest a predisposition to form amyloid fibrils, corroborated by its amino acid residues sequence organization in well-defined ?-helices with no ?-sheet elements. However, even Mb forms amyloid fibrils under certain conditions, suggesting that the ability to form fibrils is a common feature of all proteins and is not related to a specific primary structure. In this work, we aim to map potential interactions involved in apomioglobin aggregation and fibrils formation. To such aim, we present here the studies of effects on amiloidogenic kinetics of 19 apoMb mutants. The induction of amyloid fibrils was performed by incubating apoMb proteins on 50 mM sodium borate buffer at pH 9 and heat to 65°C. The aggregation process was monitored both by thioflavin T (ThT) emitted fluorescence and circular dichroism (CD) spectroscopy measurements. Other morph-physicochemical properties of apoMb amyloids were also studied: activation energy of fibril formation, structure organization, cytotoxicity, seeding effect, disassembly by urea. Our results show that some mutants (7 in total) affect the amyloid formation kinetics, and surprisingly, these effects are well correlated with the effect that the mutation has on the stability of the native state but not with the effect on the stability of the folding intermediate. The overall structures, probed by X-ray diffraction, of fibers formed by mutants and wild-type apomyoglobin are indistinguishable. Cytotoxicity experiments, using a neuronal cell line model N2A (murine neuroblastoma), and seeding experiments, confirm that different aggregated forms of proteins are capable of decreasing the cell viability and to speed up the formation of fibrils. Generally, our results support the hypothesis that although partially unfolding precedes fibril formation in apomyoglobin, formation of the folding intermediate is not an obligatory step in the process and thus folding and aggregation/fibril formation are apparently distinct in this protein. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular