Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-05-17T18:37:10Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-05-22T11:40:51Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-05-22T11:40:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-07-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A artepilina C é o principal marcador químico utilizado no controle de qualidade da própolis verde, a qual é produzida especialmente em Minas Gerais e comercializada principalmente para o Japão e que possui como principal fonte botânica a planta Baccharis dracunculifolia DC. (Asteraceae). Entre as técnicas que podem ser utilizadas para a análise da artepilina C, a cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) acoplada a espectrometria de massas (EM) apresenta inúmeras vantagens. Em relação às suas atividades biológicas, a artepilina C apresenta ação antioxidante e antitumoral, não tendo sido ainda avaliada sua embriotoxicidade e atividade antienvelhecimento. O presente trabalho teve como objetivos isolar a artepilina C, desenvolver e validar método analítico de quantificação dessa substância por CLUE-EM-Q-TOF, bem como determinar sua atividade antienvelhecimento em nematoides Caenorhabditis elegans e sua toxicidade em embriões de Zebrafish. Para isolar a artepilina C de amostra de própolis verde, foi realizada extração básica seguida de acidificação, com posterior fracionamento por cromatografia líquida a vácuo (CLV) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. Para identificação da substância, foi realizada análise por CLAE e ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C. Após isolamento, a substância foi utilizada como padrão para validação de metodologia de quantificação da artepilina C em própolis verde por CLUE-EM-Q-TOF. A metodologia mostrou-se específica, linear, precisa, exata e robusta nas condições avaliadas. Em relação aos ensaios biológicos frente ao nematoide C. elegans, a artepilina C não foi tóxica ao animal, em nenhuma das concentrações avaliadas. Contudo, a artepilina C (125 μM) não foi capaz de prolongar seu tempo de vida. Em embriões de Zebrafish, a substância foi tóxica nas concentrações de 250, 125 e 50 μM, indicando a necessidade de estudos mais aprofundados quanto à sua embriotoxicidade. / Artepillin C is the main chemical marker used in quality control of green propolis, which is produced especially in Minas Gerais and marketed mainly to Japan, being Baccharis dracunculifolia DC. (Asteraceae) its main botanical source. Among the techniques that can be used for the analysis of artepillin C, ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled with mass spectrometry (MS) has many advantages. Regarding its biological activities, artepillin C shows antioxidant and antitumor action, and its embryotoxicity and antiaging activity have not been evaluated yet. The aim of this work was to isolate artepillin C, to develop and validate the analytical method of quantification of this substance by UHPLC-MS-Q-TOF, as well as to determine its antiaging activity in Caenorhabditis elegans nematodes and its toxicity in Zebrafish embryos. To isolate the artepillin C from green propolis sample, basic extraction was performed followed by acidification, with subsequent fractionation by vacuum liquid chromatography (VLC) and semipreparative high performance liquid chromatography (HPLC). HPLC and nuclear magnetic resonance (NMR) 1H and 13C analysis were performed for the substance identification. After isolation, the substance was used as standard for validation of quantification methodology of artepillin C in green propolis by UHPLC-MS-Q-TOF. The methodology was specific, precise, accurate and robust for the evaluated conditions. About the biological assays in C. elegans nematode, artepillin C was not toxic for the animal at any of evaluated concentrations. However, artepillin C (125 μM) was not able to prolong its life span. In Zebrafish embryos, the substance was toxic at 250, 125 e 50 μM concentrations, showing the need for further studies about its embryotoxicity.

A própolis verde brasileira é um dos produtos de abelha mais consumidos no mundo devido às suas atividades antioxidantes, antiinflamatórias, antimicrobianas e antitumorais. Coletada pela espécie Apis mellifera, esta própolis possui a maior porcentagem de Artepilina C dentre as demais própolis. A molécula, derivada do ácido cinâmico, possui dois grupos prenilados, o que favorece a afinidade do composto pelo ambiente lipofílico. Um grupo carboxila também está presente na estrutura da Artepilina C, tornando-a um composto sensível ao pH, o que pode modular sua atividade biológica relacionada a interações com a membrana celular de organismos e tecidos. Neste trabalho investigamos as propriedades da Artepilina C em solução aquosa e interações entre Artepilina C e agregados anfifílicos comumente usados como modelos de membranas, ou seja, micelas e vesículas unilamelares, usando absorção óptica e espectroscopias de fluorescência em estado estacionário e resolvida no tempo. O grupo carboxila pode estar tanto na forma protonada quanto na forma desprotonada, mostrando equilíbrio em pH 4,65. Em pH abaixo do valor de pKa, uma banda de absorção aumentou em torno de 350 nm em concentração de Artepillin C acima de 50 M devido à agregação da molécula. Em pH neutro, com excitação a 310 nm, a Artepilina C apresenta dupla emissão a 400 e 450 nm, onde a segunda pode estar relacionada com diferentes interações entre as formas isoméricas da molécula. O tempo de vida fluorescente foi ajustado por uma função triexponencial, dominada por uma componente muito curta, em torno de 60 ps. Desta forma, a emissão fluorescente ocorreu antes da despolarização, resultando em valores muito altos de anisotropia de fluorescência. A interação da Artepilina C e membranas modelo foi estudada com micelas aniônicas, catiônicas e zwitteriônicas (respectivamente SDS, CTAB e HPS) e com vesículas unilamelares grandes de DMPC, DMPG e DODAB. Devido às cargas na superfície das micelas e das vesículas, o pH local é diferente do meio (bulk) e os espectros de absorção óptica mostraram que o estado de protonação do composto depende deste pH local. A polaridade em torno da Artepilina C diminuiu na presença de micelas e vesículas de acordo com os espectros de emissão de fluorescência, levando-nos a acreditar que a molécula está localizada na interface água/lipídio. A carga negativa do composto em estado desprotonado favorece a interação com micelas catiônicas e vesículas neutras. Os efeitos são mais proeminentes quando vesícula lipídica está na fase fluida. / Brazilian green propolis is one of the most consumed bee product in the world because of its known antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial and antitumor activities. Collected by the species Apis mellifera, this propolis has the major percentage of Artepillin C among others worldwide propolis. The molecule, derived of cinnamic acid, has two prenylated groups, which improves the affinity of the compound for lipophilic environment. A carboxylic group is also present in the Artepillin C structure, making it a pH-sensitive compound, what may modulate its biological activity related to interactions with the cellular membrane of organisms and tissues. In this work we investigated the properties of Artepillin C on aqueous solution and interactions between Artepillin C and amphiphilic aggregates commonly used as membrane models, namely, micelles and unilamellar vesicles, using optical absorption, steady state and time-resolved fluorescence spectroscopies. The carboxyl group may be either in protonated or deprotonated form, showing equilibrium at pH 4,65. In pH below the pKa value, an absorption band raised around 350 nm at Artepillin C concentration above 50 M, due to aggregation of the molecule. In neutral pH, with excitation at 310 nm, Artepillin C presents dual emission at 400 and 450 nm, where the second one could be related with different interactions between isomeric forms of the molecule. The fluorescent lifetime is a three-exponential function dominated by a very short component, around 60 ps. Therefore, the emission occurred before fluorescence depolarization, resulting in very high values of fluorescence anisotropy. The interaction of Artepillin C and membrane models was studied with anionic, cationic and zwitterionic (respectively SDS, CTAB and HPS) micelles, and with large unilamellar vesicles of DMPC, DMPG and DODAB. Due to the charges in micelles and in vesicles surfaces, the local pH was different from the bulk and the optical absorption spectra showed that the protonation state of the compound depends on this pH. The polarity around Artepillin C decreased in the presence of micelles and vesicles according to fluorescence emission spectra, leading us to believe that the molecule should be located at the water/lipid interface. The negative charge of the compound in deprotonated state favors the interaction with cationic micelles and neutral vesicles. The effects are more prominent when the lipid vesicles are in the fluid phase

A própolis verde brasileira é um dos produtos de abelha mais consumidos no mundo devido às suas atividades antioxidantes, antiinflamatórias, antimicrobianas e antitumorais. Coletada pela espécie Apis mellifera, esta própolis possui a maior porcentagem de Artepilina C dentre as demais própolis. A molécula, derivada do ácido cinâmico, possui dois grupos prenilados, o que favorece a afinidade do composto pelo ambiente lipofílico. Um grupo carboxila também está presente na estrutura da Artepilina C, tornando-a um composto sensível ao pH, o que pode modular sua atividade biológica relacionada a interações com a membrana celular de organismos e tecidos. Neste trabalho investigamos as propriedades da Artepilina C em solução aquosa e interações entre Artepilina C e agregados anfifílicos comumente usados como modelos de membranas, ou seja, micelas e vesículas unilamelares, usando absorção óptica e espectroscopias de fluorescência em estado estacionário e resolvida no tempo. O grupo carboxila pode estar tanto na forma protonada quanto na forma desprotonada, mostrando equilíbrio em pH 4,65. Em pH abaixo do valor de pKa, uma banda de absorção aumentou em torno de 350 nm em concentração de Artepillin C acima de 50 M devido à agregação da molécula. Em pH neutro, com excitação a 310 nm, a Artepilina C apresenta dupla emissão a 400 e 450 nm, onde a segunda pode estar relacionada com diferentes interações entre as formas isoméricas da molécula. O tempo de vida fluorescente foi ajustado por uma função triexponencial, dominada por uma componente muito curta, em torno de 60 ps. Desta forma, a emissão fluorescente ocorreu antes da despolarização, resultando em valores muito altos de anisotropia de fluorescência. A interação da Artepilina C e membranas modelo foi estudada com micelas aniônicas, catiônicas e zwitteriônicas (respectivamente SDS, CTAB e HPS) e com vesículas unilamelares grandes de DMPC, DMPG e DODAB. Devido às cargas na superfície das micelas e das vesículas, o pH local é diferente do meio (bulk) e os espectros de absorção óptica mostraram que o estado de protonação do composto depende deste pH local. A polaridade em torno da Artepilina C diminuiu na presença de micelas e vesículas de acordo com os espectros de emissão de fluorescência, levando-nos a acreditar que a molécula está localizada na interface água/lipídio. A carga negativa do composto em estado desprotonado favorece a interação com micelas catiônicas e vesículas neutras. Os efeitos são mais proeminentes quando vesícula lipídica está na fase fluida. / Brazilian green propolis is one of the most consumed bee product in the world because of its known antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial and antitumor activities. Collected by the species Apis mellifera, this propolis has the major percentage of Artepillin C among others worldwide propolis. The molecule, derived of cinnamic acid, has two prenylated groups, which improves the affinity of the compound for lipophilic environment. A carboxylic group is also present in the Artepillin C structure, making it a pH-sensitive compound, what may modulate its biological activity related to interactions with the cellular membrane of organisms and tissues. In this work we investigated the properties of Artepillin C on aqueous solution and interactions between Artepillin C and amphiphilic aggregates commonly used as membrane models, namely, micelles and unilamellar vesicles, using optical absorption, steady state and time-resolved fluorescence spectroscopies. The carboxyl group may be either in protonated or deprotonated form, showing equilibrium at pH 4,65. In pH below the pKa value, an absorption band raised around 350 nm at Artepillin C concentration above 50 M, due to aggregation of the molecule. In neutral pH, with excitation at 310 nm, Artepillin C presents dual emission at 400 and 450 nm, where the second one could be related with different interactions between isomeric forms of the molecule. The fluorescent lifetime is a three-exponential function dominated by a very short component, around 60 ps. Therefore, the emission occurred before fluorescence depolarization, resulting in very high values of fluorescence anisotropy. The interaction of Artepillin C and membrane models was studied with anionic, cationic and zwitterionic (respectively SDS, CTAB and HPS) micelles, and with large unilamellar vesicles of DMPC, DMPG and DODAB. Due to the charges in micelles and in vesicles surfaces, the local pH was different from the bulk and the optical absorption spectra showed that the protonation state of the compound depends on this pH. The polarity around Artepillin C decreased in the presence of micelles and vesicles according to fluorescence emission spectra, leading us to believe that the molecule should be located at the water/lipid interface. The negative charge of the compound in deprotonated state favors the interaction with cationic micelles and neutral vesicles. The effects are more prominent when the lipid vesicles are in the fluid phase