Bis zu 95 % der Wirkstoffe von Arzneimittel der Humanmedizin werden unverändert ausgeschieden oder gelangen über die täglichen Hygiene in den Wasserkreislauf. Die meisten Substanzen werden sehr schnell und vollständig abgebaut oder liegen in Konzentrationen vor, in denen sie keine Gefährdung für die Umwelt und den Menschen darstellen. Im Gegensatz dazu gibt es aber auch Substanzen, die nur sehr schwer abgebaut werden können (persistent sind) und für die bereits negative Langzeiteffekte in umweltrelevanten Konzentrationen für Tiere nachgewiesen wurden. Ein Beispiel dafür ist der schmerzstillende Wirkstoff Diclofenac. Aus diesem Grund und wegen der guten Kenntnislage hinsichtlich Vorkommen, Abbauprodukte und Analytik wurde Diclofenac als Referenzverbindung für die Experimente im Rahmen dieses Projekts verwendet. Aufgrund der geringen Konzentration von Diclofenac in Wasser und der chemischen Stabilität von Diclofenac sowie einiger anderer Spurenstoffe sind herkömmliche Wasserbehandlungsverfahren, wie sie derzeit in Kläranlangen verwendet werden, ineffizient oder zu teuer. Deshalb gibt es zahlreiche Bemühungen, alternative und umweltschonende Behandlungsverfahren zur Entfernung von Arzneimittelrückständen aus Wasser zu entwickeln, die einen vollständigen Abbau der Rückstände ermöglichen. Idealerweise sollten technische Lösungen zur Verfügung stehen, die gegebenenfalls in jedem Land der Erde einsetzbar wären. Der in diesem Projekt verfolgte Ansatz zur Entwicklung fotokatalytischer Schichten, die idealerweise bereits bei Tageslicht eine ausreichend hohe Aktivität aufweisen, ist besonders interessant, da es nach Optimierung weder des zusätzlichen Einsatzes von Chemikalien noch des Einsatzes von Energie bedarf. So werden durch die Bestrahlung des Katalysators (z.B. ZnO, TiO2) mit künstlichem UV-Licht, perspektifisch aber mit UV-A-Strahlung der Sonne sowohl Wasser als auch Luftsauerstoff zu reaktiven Hydroxylradikalen umgesetzt, die letztendlich die unspezifischen Spaltung organischer Verbindungen im Wasser bewirken. Voraussetzung für die Optimierung hinsichtlich katalytischer Aktivität und Empfindlichkeit gegenüber Tageslicht ist ein Herstellungsverfahren, das die Optimierung der fotokatalytischen Schichten bezüglich verschiedener Parameter (optimale Größe, enge Größenverteilung, Möglichkeit der einfachen Dotierung, Verhinderung der Agglomeration bei gleichzeitiger dauerhafter Immobilisierung) erlaubt. Diesbezüglich besonders aussichtsreich ist die Verwendung von hoch geordneten bakteriellen Hüllproteinen sogenannten „surface-layer“ (S-Layer)-Proteinen, die sowohl eine einfache Herstellung von fotokatalytisch aktiven Nanopartikeln aus verschiedenen Elementen erlauben, als auch zur Beschichtung verschiedener Materialien geeignet sind. Ein Ziel im Projekt ist die Herstellung von reinen und dotierten ZnO und TiO2-Nanopartikeln zur Eliminierung von Diclofenac aus Wasser (siehe Abbildung 1). Dabei dienen S-Layer verschiedener Bakterien und damit Proteinschichten mit unterschiedlichen Symmetrien, Gitterabständen und Porengröße als Template für die Herstellung von Nanopartikeln verschiedener aber definierter Größe. Darüber hinaus werden die S-Layer im Projekt als Trenn- und Immobilisierungsschicht für die erzeugten Nanopartikel genutzt. Letzteres vor allem zur Verhinderung einer Agglomeration und des Austrags der Nanopartikel, was beides einen Verlust der katalytischen Aktivität entsprechender Schichten bedeuten würde. Als Träger werden im Rahmen des Projekts verschiedene in technischen Anwendungen genutzte Materialien dahin gehend überprüft, in wie weit sich S-Layer darauf abscheiden lassen und stabile Schichten ausbilden und darauf aufbauend ein Trägermaterial für die Herstellung fotokatalytisch aktiver Beschichtungen ausgewählt. Gleichzeitig war es Ziel des Projektes, die Biomassegewinnung hinsichtlich eines Upscalings und hinsichtlich der Kosten zu optimieren. Ausgehend von dieser konkreten wissenschaftlichen Fragestellung war es auch Ziel des Projektes, ein verwertungsorientiertes Netzwerk aufzubauen. Dies vor allem zur Sicherung der Fortentwicklung der neuen Materialien und der Weiterführung der begonnenen Arbeiten in dem konkreten Forschungsgebiet mit dem Ziel der Entwicklung eines marktreifen Produktes aber auch zur Etablierung einer dauerhaften Kooperation zwischen den verschiedenen Forschungs- und Industriepartnern. Diese Ziele sollten insbesondere über eine Vernetzung von Instituten innerhalb der Leibniz-Gemeinschaft, weiteren regionalen und überregionalen Forschungseinrichtungen sowie Industriepartnern erreicht werden. Die sehr gute gerätetechnische Ausstattung, die im vorliegenden Fall über die Projektmittel erreicht wurde, war nicht nur Voraussetzung zur Durchführung der geplanten Forschungs- und Entwicklungsarbeiten und zur Herstellung von Materialien im kleintechnischen Maßstab, sondern erhöhte auch die Attraktivität des Teams als Projektpartner weiter und nachhaltig. Erfahrungen aus dem Projekt und dem Prozess der Netzwerkbildung sollen insbesondere unter Einbeziehung der Geschäftsstelle der Leibniz-Gemeinschaft zur Entwicklung eines Prozessleitfadens für die Bildung von Verwertungs- und Transfernetzwerken innerhalb der Leibniz-Gemeinschaft genutzt werden.

Aus der Anwendung von Arzneimitteln bei Lebensmittel liefernden Tieren erwächst das Problem der Rückstandsbelastung tierischer Lebensmittel. Bei der Sicherheitsbewertung von Rückständen im Rahmen der Zulassung von Tierarzneimitteln wird der Aspekt des Einflusses von Verdauungsprozessen auf die Struktur und Bioverfügbarkeit von Rückständen beim Endverbraucher Mensch bisher nicht berücksichtigt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das präsystemische Schicksal proteingebundener Arzneitmittelrückstände zu untersuchen. Da native Arzneitmittelrückstände nach Art und Menge schwer zu erfassen sind, wurde mit halbsynthetischen Rückständen gearbeitet, die durch Inkubation mit Rattenlebermikrosomen mit der Modellsubstanz Furazolidon gebildet wurden. Nach der Inkubation wurden freie und schwach gebundene Metaboliten durch Lösungsmittelextraktion entfernt, um nur die fest an Proteine gebundenen Rückstände zu gewinnen. Diese proteingebundenen Rückstände wurden in vitro mithilfe von Salzsäure und Pronase E verdaut. Die intestinale Bioverfügbarkeit der verdauten Rückstände wurde im isoliert perfundierten Darm untersucht. Zur Verifizierung der In-vitro-Befunde wurde die Bioverfügbarkeit der gebundenen Furazolidonrückstände außerdem bei Ratten untersucht. Der quantitative Nachweis der proteingebundenen Furazolidonrückstände erfolgte hochdruckflüssigkeitschromatographisch. Es wurden nur Rückstände erfasst, die die intakte Seitenkette des Furazolidons, das 3-Amino-2-oxazolidinon (AOZ), enthielten. Der Nachweis erfordert eine Derivatisierung des AOZ mit Nitrobenzaldehyd unter sauren Bedingungen. Während der Derivatisierung wird AOZ aus den Rückständen säurehydrolytisch freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode wurde eine Methode entwickelt, die die sichere Unterscheidung zwischen freiem und gebundenem AOZ ermöglicht, da AOZ auch bei der Verdauung der Rückstände abgespalten wird. Nach In-vitro-Verdauung wurden zirka 80% der Rückstände als freies AOZ und nur noch 20% in der ursprünglichen gebundenen Form gemessen. Perfusionsversuche mit reinem AOZ zeigten, dass die Seitenkette des Furazolidons intestinal bioavearfügbar ist. Es scheint, dass AOZ die Darmwand durch passive Diffusion überwindet, da sich im Verlauf der zweistündigen Perfusion in der resorbierten Flüssigkeit eine AOZ-Konzentration aufbaute, die annährend so hoch war wie im Perfusionsmedium. Untersuchungen zur Biotransformation von AOZ in isolierten Enterozyten und Rattendarmmikrosomen gaben keine Hinweise auf einen intestinalen Abbau des AOZ. Hingegen deuten ein geringfügiger Abfall von AOZ in isolierten Hepatozyten und ein limitierter, jedoch signifikanter Abfall in Rattenlebermikrosomen auf hepatische Verstoffwechslung hin. Die Perfusion mit verdauten Furazolidonrückständen zeigte, dass proteingebunde Rückstände die Darmwand mit großer Wahrscheinlichkeit nicht überwinden konnten. Im Unterschied dazu wurde das während der Verdauung freigesetzte AOZ resorbiert. Fütterungsversuche mit Ratten zeigten, dass auch die natürliche Verdauung zur Freisetzung von AOZ aus Rückständen führt. Messungen in Geweben, Organen und Körperflüssigkeiten der Ratten ergaben, dass wahrscheinlich nur freies AOZ resorbiert wird, jedoch keine proteingebundenen Rückstände resorbiert werden und dass AOZ in unveränderter Form renal eliminiert werden kann. Quantitative Aussagen ließen sich aus den Versuchen nicht ableiten. Aus den Befunden wurde geschlossen, dass proteingebundene Arzneimittelrückstände im Gastrointestinaltrakt modifiziert werden können, so dass Verbindungen entstehen, die in tierischen Produkt noch nicht vorhanden sind. Die kovalente Bindung ist offensichtlich nicht der Endpunkt im Prozess der Rückstandsbildung, wie es einige Autoren postulieren. Die neuen Moleküle können bioverfügbar sein. Bei der Sicherheitsbewertung von Arzneimittelrückständen kann nicht a priori angenommen werden, dass sie pharmakologisch und toxikologisch unwirksam sind, da sie eliminiert werden müssen und wahrscheinlich auch biotransformiert werden. Im Fall von Furazolidon ist die wasserlösliche Seitenkette AOZ ein "neuer" Metabolit, der partiell bioverfügbar ist und möglicherweise in geringem Maße verstoffwechselt wird. Die Ausscheidung erfolgt renal, eventuell auch über andere Wege. Der Teil der proteingebundenen Rückstände, der die saure Hydrolyse im Magen übersteht, scheint hingegen im Darm nicht in nenneswerten Maße resorbiert zu werden. Dies könnte auch für den proteingebundenen Restrückstand, der nach Abspaltung von AOZ übrig bleibt, gelten. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass mit den verwendeten In-vitro-Modellen eine quantitative Aussage über das Schicksal proteingebundener Rückstände im Organismus zu erzielen ist. / The use of veterinary drugs in food producing animals give rise to contamination of animal food with drug residues. At present, the influence of digestion on structure and bioavailability of residues in humans has not been considered within the scope of saftety evaluation of residues during veterinary drug authorization. The aim of this study is the investigation of the presystemic fate of protein-bound drug residiues.

Bis zu 95 % der Wirkstoffe von Arzneimittel der Humanmedizin werden unverändert ausgeschieden oder gelangen über die täglichen Hygiene in den Wasserkreislauf. Die meisten Substanzen werden sehr schnell und vollständig abgebaut oder liegen in Konzentrationen vor, in denen sie keine Gefährdung für die Umwelt und den Menschen darstellen. Im Gegensatz dazu gibt es aber auch Substanzen, die nur sehr schwer abgebaut werden können (persistent sind) und für die bereits negative Langzeiteffekte in umweltrelevanten Konzentrationen für Tiere nachgewiesen wurden. Ein Beispiel dafür ist der schmerzstillende Wirkstoff Diclofenac. Aus diesem Grund und wegen der guten Kenntnislage hinsichtlich Vorkommen, Abbauprodukte und Analytik wurde Diclofenac als Referenzverbindung für die Experimente im Rahmen dieses Projekts verwendet. Aufgrund der geringen Konzentration von Diclofenac in Wasser und der chemischen Stabilität von Diclofenac sowie einiger anderer Spurenstoffe sind herkömmliche Wasserbehandlungsverfahren, wie sie derzeit in Kläranlangen verwendet werden, ineffizient oder zu teuer. Deshalb gibt es zahlreiche Bemühungen, alternative und umweltschonende Behandlungsverfahren zur Entfernung von Arzneimittelrückständen aus Wasser zu entwickeln, die einen vollständigen Abbau der Rückstände ermöglichen. Idealerweise sollten technische Lösungen zur Verfügung stehen, die gegebenenfalls in jedem Land der Erde einsetzbar wären. Der in diesem Projekt verfolgte Ansatz zur Entwicklung fotokatalytischer Schichten, die idealerweise bereits bei Tageslicht eine ausreichend hohe Aktivität aufweisen, ist besonders interessant, da es nach Optimierung weder des zusätzlichen Einsatzes von Chemikalien noch des Einsatzes von Energie bedarf. So werden durch die Bestrahlung des Katalysators (z.B. ZnO, TiO2) mit künstlichem UV-Licht, perspektifisch aber mit UV-A-Strahlung der Sonne sowohl Wasser als auch Luftsauerstoff zu reaktiven Hydroxylradikalen umgesetzt, die letztendlich die unspezifischen Spaltung organischer Verbindungen im Wasser bewirken. Voraussetzung für die Optimierung hinsichtlich katalytischer Aktivität und Empfindlichkeit gegenüber Tageslicht ist ein Herstellungsverfahren, das die Optimierung der fotokatalytischen Schichten bezüglich verschiedener Parameter (optimale Größe, enge Größenverteilung, Möglichkeit der einfachen Dotierung, Verhinderung der Agglomeration bei gleichzeitiger dauerhafter Immobilisierung) erlaubt. Diesbezüglich besonders aussichtsreich ist die Verwendung von hoch geordneten bakteriellen Hüllproteinen sogenannten „surface-layer“ (S-Layer)-Proteinen, die sowohl eine einfache Herstellung von fotokatalytisch aktiven Nanopartikeln aus verschiedenen Elementen erlauben, als auch zur Beschichtung verschiedener Materialien geeignet sind. Ein Ziel im Projekt ist die Herstellung von reinen und dotierten ZnO und TiO2-Nanopartikeln zur Eliminierung von Diclofenac aus Wasser (siehe Abbildung 1). Dabei dienen S-Layer verschiedener Bakterien und damit Proteinschichten mit unterschiedlichen Symmetrien, Gitterabständen und Porengröße als Template für die Herstellung von Nanopartikeln verschiedener aber definierter Größe. Darüber hinaus werden die S-Layer im Projekt als Trenn- und Immobilisierungsschicht für die erzeugten Nanopartikel genutzt. Letzteres vor allem zur Verhinderung einer Agglomeration und des Austrags der Nanopartikel, was beides einen Verlust der katalytischen Aktivität entsprechender Schichten bedeuten würde. Als Träger werden im Rahmen des Projekts verschiedene in technischen Anwendungen genutzte Materialien dahin gehend überprüft, in wie weit sich S-Layer darauf abscheiden lassen und stabile Schichten ausbilden und darauf aufbauend ein Trägermaterial für die Herstellung fotokatalytisch aktiver Beschichtungen ausgewählt. Gleichzeitig war es Ziel des Projektes, die Biomassegewinnung hinsichtlich eines Upscalings und hinsichtlich der Kosten zu optimieren. Ausgehend von dieser konkreten wissenschaftlichen Fragestellung war es auch Ziel des Projektes, ein verwertungsorientiertes Netzwerk aufzubauen. Dies vor allem zur Sicherung der Fortentwicklung der neuen Materialien und der Weiterführung der begonnenen Arbeiten in dem konkreten Forschungsgebiet mit dem Ziel der Entwicklung eines marktreifen Produktes aber auch zur Etablierung einer dauerhaften Kooperation zwischen den verschiedenen Forschungs- und Industriepartnern. Diese Ziele sollten insbesondere über eine Vernetzung von Instituten innerhalb der Leibniz-Gemeinschaft, weiteren regionalen und überregionalen Forschungseinrichtungen sowie Industriepartnern erreicht werden. Die sehr gute gerätetechnische Ausstattung, die im vorliegenden Fall über die Projektmittel erreicht wurde, war nicht nur Voraussetzung zur Durchführung der geplanten Forschungs- und Entwicklungsarbeiten und zur Herstellung von Materialien im kleintechnischen Maßstab, sondern erhöhte auch die Attraktivität des Teams als Projektpartner weiter und nachhaltig. Erfahrungen aus dem Projekt und dem Prozess der Netzwerkbildung sollen insbesondere unter Einbeziehung der Geschäftsstelle der Leibniz-Gemeinschaft zur Entwicklung eines Prozessleitfadens für die Bildung von Verwertungs- und Transfernetzwerken innerhalb der Leibniz-Gemeinschaft genutzt werden.

Aus der Anwendung von Arzneimitteln bei Lebensmittel liefernden Tieren erwächst das Problem der Rückstandsbelastung tierischer Lebensmittel. Bei der Sicherheitsbewertung von Rückständen im Rahmen der Zulassung von Tierarzneimitteln wird der Aspekt des Einflusses von Verdauungsprozessen auf die Struktur und Bioverfügbarkeit von Rückständen beim Endverbraucher Mensch bisher nicht berücksichtigt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das präsystemische Schicksal proteingebundener Arzneitmittelrückstände zu untersuchen. Da native Arzneitmittelrückstände nach Art und Menge schwer zu erfassen sind, wurde mit halbsynthetischen Rückständen gearbeitet, die durch Inkubation mit Rattenlebermikrosomen mit der Modellsubstanz Furazolidon gebildet wurden. Nach der Inkubation wurden freie und schwach gebundene Metaboliten durch Lösungsmittelextraktion entfernt, um nur die fest an Proteine gebundenen Rückstände zu gewinnen. Diese proteingebundenen Rückstände wurden in vitro mithilfe von Salzsäure und Pronase E verdaut. Die intestinale Bioverfügbarkeit der verdauten Rückstände wurde im isoliert perfundierten Darm untersucht. Zur Verifizierung der In-vitro-Befunde wurde die Bioverfügbarkeit der gebundenen Furazolidonrückstände außerdem bei Ratten untersucht. Der quantitative Nachweis der proteingebundenen Furazolidonrückstände erfolgte hochdruckflüssigkeitschromatographisch. Es wurden nur Rückstände erfasst, die die intakte Seitenkette des Furazolidons, das 3-Amino-2-oxazolidinon (AOZ), enthielten. Der Nachweis erfordert eine Derivatisierung des AOZ mit Nitrobenzaldehyd unter sauren Bedingungen. Während der Derivatisierung wird AOZ aus den Rückständen säurehydrolytisch freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode wurde eine Methode entwickelt, die die sichere Unterscheidung zwischen freiem und gebundenem AOZ ermöglicht, da AOZ auch bei der Verdauung der Rückstände abgespalten wird. Nach In-vitro-Verdauung wurden zirka 80% der Rückstände als freies AOZ und nur noch 20% in der ursprünglichen gebundenen Form gemessen. Perfusionsversuche mit reinem AOZ zeigten, dass die Seitenkette des Furazolidons intestinal bioavearfügbar ist. Es scheint, dass AOZ die Darmwand durch passive Diffusion überwindet, da sich im Verlauf der zweistündigen Perfusion in der resorbierten Flüssigkeit eine AOZ-Konzentration aufbaute, die annährend so hoch war wie im Perfusionsmedium. Untersuchungen zur Biotransformation von AOZ in isolierten Enterozyten und Rattendarmmikrosomen gaben keine Hinweise auf einen intestinalen Abbau des AOZ. Hingegen deuten ein geringfügiger Abfall von AOZ in isolierten Hepatozyten und ein limitierter, jedoch signifikanter Abfall in Rattenlebermikrosomen auf hepatische Verstoffwechslung hin. Die Perfusion mit verdauten Furazolidonrückständen zeigte, dass proteingebunde Rückstände die Darmwand mit großer Wahrscheinlichkeit nicht überwinden konnten. Im Unterschied dazu wurde das während der Verdauung freigesetzte AOZ resorbiert. Fütterungsversuche mit Ratten zeigten, dass auch die natürliche Verdauung zur Freisetzung von AOZ aus Rückständen führt. Messungen in Geweben, Organen und Körperflüssigkeiten der Ratten ergaben, dass wahrscheinlich nur freies AOZ resorbiert wird, jedoch keine proteingebundenen Rückstände resorbiert werden und dass AOZ in unveränderter Form renal eliminiert werden kann. Quantitative Aussagen ließen sich aus den Versuchen nicht ableiten. Aus den Befunden wurde geschlossen, dass proteingebundene Arzneimittelrückstände im Gastrointestinaltrakt modifiziert werden können, so dass Verbindungen entstehen, die in tierischen Produkt noch nicht vorhanden sind. Die kovalente Bindung ist offensichtlich nicht der Endpunkt im Prozess der Rückstandsbildung, wie es einige Autoren postulieren. Die neuen Moleküle können bioverfügbar sein. Bei der Sicherheitsbewertung von Arzneimittelrückständen kann nicht a priori angenommen werden, dass sie pharmakologisch und toxikologisch unwirksam sind, da sie eliminiert werden müssen und wahrscheinlich auch biotransformiert werden. Im Fall von Furazolidon ist die wasserlösliche Seitenkette AOZ ein "neuer" Metabolit, der partiell bioverfügbar ist und möglicherweise in geringem Maße verstoffwechselt wird. Die Ausscheidung erfolgt renal, eventuell auch über andere Wege. Der Teil der proteingebundenen Rückstände, der die saure Hydrolyse im Magen übersteht, scheint hingegen im Darm nicht in nenneswerten Maße resorbiert zu werden. Dies könnte auch für den proteingebundenen Restrückstand, der nach Abspaltung von AOZ übrig bleibt, gelten. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass mit den verwendeten In-vitro-Modellen eine quantitative Aussage über das Schicksal proteingebundener Rückstände im Organismus zu erzielen ist. / The use of veterinary drugs in food producing animals give rise to contamination of animal food with drug residues. At present, the influence of digestion on structure and bioavailability of residues in humans has not been considered within the scope of saftety evaluation of residues during veterinary drug authorization. The aim of this study is the investigation of the presystemic fate of protein-bound drug residiues.