The sensory cells of the inner ear, hair cells, provide vertebrates with the ability to detect auditory stimuli and balance. In mammals, cochlear hair cells, those responsible for hearing, do not regenerate. Zebrafish hair cells do regenerate. Gaining an understanding of the role and regulation of the genes involved in the formation and regeneration of these cells may provide information important for the development of genetic therapies. We show that zebrafish atoh1 acts as the proneural gene responsible for defining the equivalence group from which hair cells form. Expression of atoh1 is dependent upon Fgf and Pax. Atoh1 induces expression of delta, resulting in activation of Notch and subsequent lateral inhibition. Another factor known to be important for hair cell formation in mice is Sox2. In zebrafish, sox2 expression is downstream of Atoh1, Notch and Fgf. Zebrafish Sox2 is not required for hair cell formation, but rather Sox2 is important for hair cell maintenance. In zebrafish, otic hair cell regeneration has not yet been characterized. We show that, following laser ablation, hair cells regenerate by way of transdifferentiation. We further show that this regeneration requires Sox2 activity. These data suggest that Sox2 acts to maintain support cell plasticity. This role is likely conserved because Sox2 is also important for stem cell plasticity in mammals. This new understanding of the role and regulation of both Atoh1 and Sox2 provides essential information that can be used to further efforts to provide genetic therapies for hair cell regeneration in mammals.

Le médulloblastome est la plus fréquente des tumeurs pédiatriques malignes du cerveau et est divisé en quatre sous-groupes moléculaires. Le groupe Sonic Hedgehog (SHH), caractérisé par l’activation de la voie SHH, présente une surexpression du facteur de transcription basique hélice-boucle-hélice Atoh1. Atoh1 est essentiel pour le développement du cervelet et plus spécifiquement pour la formation des précurseurs des cellules granulaires, qui sont aussi la cellule d’origine du médulloblastome SHH. Dans le médulloblastome SHH, Atoh1 agit comme un facteur pro-tumoral en collaboration avec la voie SHH. De plus, l’inhibition des niveaux protéiques d’Atoh1 inhibe la prolifération tumorale in vitro et in vivo. Etant donnée l’importance de la protéine Atoh1 dans la formation du médulloblastome SHH, Atoh1 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour traiter le médulloblastome SHH. Cependant, les mécanismes de régulation d’Atoh1 sont encore mal connus.Les modifications post-traductionnelles sont connues pour réguler les niveaux protéiques dans les cellules. Plusieurs types de modifications régulent la dégradation protéique et elles incluent l’ubiquitination et la phosphorylation. Nous avons décidé de nous concentrer dans un premier temps sur le rôle potentiel de la phosphorylation d’Atoh1 sur sa fonction et régulation durant le développement du cervelet et la formation de médulloblastome.Par une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié douze sites de phosphorylation sur la protéine Atoh1. Parmi ces douze sites, seulement deux, la sérine 328 (S328) et la sérine 339 (S339), sont importantes pour la stabilité et la fonction de la protéine. En effet, les deux mutants de phosphorylation spécifiques de ces deux sites, Atoh1-S328A et Atoh1-S339A, ont une demi-vie plus longue ainsi qu’une activité transcriptionnelle augmentée dans les précurseurs des cellules granulaires par rapport à la forme sauvage d’Atoh1. Nous avons ensuite réalisé une purification d’affinité en tandem différentielle suivie par une analyse par la technologie d’identification protéique multidimensionnelle (MudPIT) pour définir les partenaires phospho-spécifiques d’Atoh1. Nous avons découvert que l’ubiquitine ligase E3 Huwe1 est responsable de la dégradation d’Atoh1 de manière phospho-dépendante dans les progéniteurs des cellules granulaires. Nous avons aussi montré que SHH protège Atoh1 de la dégradation médiée par Huwe1 par l’intermédiaire des phosphatases de la famille des PP2A. De manière importante, ce mécanisme de régulation d’Atoh1 est nécessaire au bon développement du cervelet. De plus, dans le contexte tumoral, un faible niveau d’ARNm d’HUWE1 est associé à une mauvaise survie chez les patients ayant un medulloblastome SHH.Au vu de ces résultats, nous souhaitons étudier plus en détail le rôle de la phosphorylation d’Atoh1 ainsi que la contribution de ce nouveau mécanisme dans le médulloblastome. Nous souhaiterions ainsi exploiter nos résultats pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le médulloblastome SHH. / Medulloblastoma (MB) is the most common pediatric malignant brain tumor and is divided in four subgroups by gene profiling. The well-known subgroup harboring an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway shows an upregulation of the proneural basic helix-loop-helix transcription factor Atoh1. Atoh1 is essential for cerebellum development and more specifically for the formation of the granule neuronal progenitors (GNPs), which are the cells of origin of SHH induced MB. In tumoral context, Atoh1 acts as a pro-tumor factor in cooperation with SHH pathway. In addition, the inhibition of Atoh1 protein level prevents MB proliferation in vitro and in vivo. Thus, given the strong implication of Atoh1 protein in MB formation, Atoh1 seems to be a potential therapeutic target to treat SHH MB. However, up to date, mechanisms underlying its regulation remain to be elucidated. Posttranslational modifications are known to regulate protein levels in cells. Several modifications regulate protein turnover including the two most prominent, ubiquitination and phosphorylation. We decided to focus primarily our study on a potential role of Atoh1’s phosphorylation on its function and regulation both during cerebellar development and MB genesis. Using mass spectrometry analysis, we identified twelve phosphorylation sites on Atoh1 protein. Among them, only two, the serine 328 (S328) and serine 339 (S339), were critical for Atoh1 stability and function. The two single phospho-deficient mutants, Atoh1-S328A and Atoh1-S339A, displayed a longer half-life and increased transcriptional activity in granule neuron progenitors when compared to the wild-type form of Atoh1. Next, we employed differential tandem affinity purification followed by Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) analysis to define Atoh1 phospho-specific partners. We uncovered that the E3 ubiquitin ligase Huwe1 is responsible for Atoh1 degradation in a phospho-dependent manner in granule neuron progenitors. We also discovered that SHH protects Atoh1 against its degradation mediated by Huwe1 through the phosphatases of PP2A family. Importantly, this machinery is required for proper cerebellar development and we highlighted that low levels of HUWE1 are associated with a poor prognosis in patient harboring a SHH medulloblastoma.Given this data, we wish to dissect the role of Atoh1 phosphorylation, and the contribution of this new pathway in MB. We anticipate exploiting our findings to develop new therapeutic strategies in SHH MB.

Pendant le développement du cervelet, les progéniteurs des neurones granulaires (PNG) nécessitent la présence du cil primaire pour proliférer en réponse à Sonic Hedgehog (SHH). En effet, la prolifération dérégulée des PNGs peut conduire à la formation d'une tumeur pédiatrique maligne appelée SHH-médulloblastome (MB), de ce fait comprendre comment le cil primaire est régulé dans les PNGs est crucial.Nous montrons que le facteur de transcription Atoh1 contrôle la présence du cil primaire dans les PNGs in vitro et in vivo. En particulier, la suppression du cil primaire par l’inactivation génétique de gènes impliqués dans la ciliogenèse (par exemple, Kif3a ou Ift88) empêche Atoh1 de maintenir les PNGs en prolifération, ce qui indique qu’Atoh1 favorise l’expansion des PNGs en maintenant la présence du cil primaire. D’un point de vue moléculaire, Atoh1 contrôle la formation du cil primaire en régulant le bon positionnement peri-centrosomal des satellites centriolaires (SC), complexes protéiques essentiels pour la ciliogenèse. L'inactivation de Atoh1 dans les PNGs perturbe en effet la distribution subcellulaire des SCs, altérant ainsi inévitablement la ciliogenèse. Cette nouvelle fonction de Atoh1 est gouvernée par la régulation transcriptionnelle directe d'un composant clé des SCs, Cep131. L’expression ectopique de Cep131 dans les PNGs restore les effets liés à l'inactivation d'Atoh1, rétablissant la localisation correcte du SC et comme conséquence la présence d’un cil primaire.De plus, nous avons montré que cette voie Atoh1-SC-cil primaire-SHH contrôlant la prolifération des PNGs est également conservée dans le contexte du SHH-MB, où Atoh1 est surexprimée et essentielle pour sa formation et sa maintenance.Ces données révèlent un mécanisme par lequel la ciliogenèse est régulée dans des progéniteurs de neurones, offrant de nouvelles informations sur la neurogenèse dans le cervelet et sur la pathogenèse du SHH-MB. / Cerebellar granule neuron progenitors (GNPs) require the primary cilium to proliferate in response to Sonic Hedgehog (SHH) during cerebellar development. As aberrant proliferation of GNPs may lead to SHH-type medulloblastoma (SHH-MB), a pediatric brain tumor, understanding which mechanisms control ciliogenesis in GNPs represents a major interest in the field. Here, we show that the proneural bHLH transcription factor Atoh1 controls the presence of primary cilia in GNPs both in vitro and in vivo, thus maintaining GNPs responsive to the mitogenic effects of SHH. Indeed, loss of primary cilia induced via knockdown of specific ciliary components (e.g. Kif3a and Ift88) abolishes the ability of Atoh1 to keep GNPs in proliferation in vivo. Mechanistically, Atoh1 controls ciliogenesis by regulating the proper peri-centrosomal clustering of centriolar satellites (CS), large multiprotein complexes working as essential machineries for ciliogenesis. Knockdown of Atoh1 in GNPs perturbs CS subcellular distribution, leading to impairment of ciliogenesis. Luciferase reporter assays and chromatin immunoprecipitation experiments indicate that Atoh1 can directly regulate the expression of Cep131, a key CS core component. Importantly, ectopic expression of Cep131 in GNPs depleted of Atoh1, is sufficient to restore proper CS localization and consequent primary cilia formation, indicating that the Atoh1-Cep131-CS axis is responsible for ciliogenesis in GNPs.In addition, we further demonstrated that these functions of Atoh1 are conserved in the context of SHH-MB, where Atoh1 is typically overexpressed and acts as a lineage-dependent transcription factor.These data reveal a mechanism whereby ciliogenesis is regulated in neuron progenitors providing novel insights into cerebellar neurogenesis and pathogenesis of SHH-MB.

The inner ear is a complex sensory organ of interconnected chambers, each with a sensory epithelium comprised of hair cells and support cells for detection of sound and motion. This dissertation focuses on the development and regulation of sensory epithelia in zebrafish and utilizes loss of function, gain of function and laser ablation techniques. Hair cells and support cells develop from an equivalence group specified by proneural genes encoding bHLH transcription factors. The vertebrate Atoh1 bHLH transciption factor is a potential candidate for this role. However, data in mouse has led some researchers to conclude it does not have a proneural activity, but, rather, is involved in later stages of hair cell differentiation. In addition, the factors regulating Atoh1 are mostly unknown. We address these issues in zebrafish and show that the zebrafish homologs atoh1a and atoh1b are required during two developmental phases, first in the preotic placode and later in the otic vesicle. They interact with the Notch pathway and are necessary and sufficient for specification of sensory epithelia. Our data confirm atoh1 genes have proneural function. We also go on to show Atoh1 works in a complex network of factors, Pax2/5/8, Sox2, Fgf and Notch. Misexpression of atoh1 alters axial patterning and leads to expanded sensory epithelia, which is enhanced by misexpression of either fgf8 or sox2. Lastly, we examine the role of sox2 in sensory epithelia development and regeneration. Sox2 has been implicated in maintainence of pluripotent stem cells as well as cell differentiation. In the inner ear, Sox2 is initially expressed in the prosensory domain and is required for its formation. Eventually, Sox2 is downregulated in hair cells and maintained in support cells; however, its later role has not been determined. We show that in the zebrafish inner ear, sox2 is expressed after sensory epithelium development has begun and, like in mouse, expression is down regulated in hair cells and maintained in support cells. Our data demonstrate a role for sox2 in maintenance of hair cells and in transdifferentation of support cells into hair cells after laser ablation. Additionally, sox2 is regulated by Aoth1a/1b, Fgf, and Notch.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23094号 / 医博第4721号 / 新制||医||1050(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙橋 良輔, 教授 井上 治久, 教授 伊佐 正 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM