Orientadores: Antonio Condino Neto, Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado)- Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T18:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_AnaCarolinade_D.pdf: 1227023 bytes, checksum: 25438a379e180eeb0d1972b464b909b0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: SIRP 'alfa'(Signal Regulatory Protein 'alfa') é um receptor que medeia funções inibidoras em fagócitos. Sua ativação e conseqüente fosforilação dos ITIMs ocorre pela ligação ao CD47 presente na membrana dos eritrócitos, e permite o recrutamento e a ativação de SHP-1, a qual desfosforila substratos específicos envolvidos na mediação de diversos efeitos fisiológicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da dexametasona (dexa) e de IFN?/TNFa sobre a expressão de SIRPa e SHP-1; a consequência desta regulação sobre a eritrofagocitose; e o nível de expressão gênica de SIRPa e SHP-1 em monócitos de pacientes com anemia hemolítica autoimune (AHAI) antes e depois de corticoterapia. Monócitos de doadores sadios e células mielomonocíticas U937 foram cultivados por 48 horas com dexa (1µM) ou IFN? (100U/ml) e TNFa (1000U/ml), por 6 horas com Hemina® (30uM), ou por 72 horas com prednisolona (0,15 e 1mg/l). Monócitos foram isolados de pacientes com AHAI antes e depois da corticoterapia. A expressão gênica de SIRPa e SHP-1 foi determinada por PCR em Tempo Real, a expressão protéica de SIRPa e SHP-1 foi determinada por Western Blotting, e a capacidade de eritrofagocitose foi determinada por microscopia. IFN? e TNFa, in vitro, promoveram o aumento da expressão gênica e protéica de SIRPa e a expressão gênica de SHP-1, em paralelo com a redução da capacidade de eritrofagocitose em monócitos normais. Em contrapartida, embora tenha aumentado a expressão gênica de SIRPa e SHP-1, dexa in vitro não alterou a expressão destas proteínas, assim como não alterou a capacidade de eritrofagocitose de monócitos normais. A expressão gênica de SIRPa e SHP-1 foi maior em monócitos de pacientes com AHAI em comparação a doadores sadios. Após corticoterapia, a expressão gênica de SIRPa e SHP-1 em monócitos de pacientes com AHAI se mostrou similar a doadores sadios. Pacientes com AHAI estudados antes da corticoterapia apresentaram baixos níveis de hemoglobina e após corticoterapia esse índice de mostrou normal. A expressão gênica de SIRPa foi aumentada pela cultura de monócitos com hemina, mas a expressão de proteína permaneceu a mesma. Nossos resultados confirmam o papel fundamental da SIRPa na regulação da eritrofagocitose e sugere que a expressão de mRNA de SIRPa em monócitos de pacientes com AHAI antes de corticoterapia é aumentada pela liberação de heme, e que a redução da expressão gênica de SIRPa após corticoterapia se deve a um efeito indireto desta droga pela redução da eritrofagocitose e diminuição da disponibilidade de heme. / Abstract: SIRPa (Signal Regulatory Protein a) is an inhibitory receptor in phagocytes. Its activation and consequent phosphorylation of ITIMs occurs by the binding to CD47 on erythrocyte membrane, what allows SHP-1 recruitment, which dephosphorylates specific substrates involved in the mediation of several physiologic effects. The aim of this work was to determine the role of dexamethasone and IFN?/TNFa upon SIRPa and SHP-1 expression, and the consequence of this regulation over erythrophagocytosis; and to evaluate the regulation of SIRPa and SHP-1 in peripheral blood monocytes (PBM) of autoimmune hemolytic anemia (AIHA) patients before and after glucocorticoid (GC) therapy. PBM from healthy donors and U937 myelomonocytic cells were cultured for 48 hours with dexamethasone (1µM) or IFN? (100U/ml) and TNFa (1000U/ml), for 6 hours with Hemin (30uM), or for 72 hours with prednisolone (0.15 and 1mg/l). PBM were isolated from AIHA patients under GC therapy or not. SIRPa and SHP-1 gene expression was determined by Real Time PCR, SIRPa and SHP-1 protein level was determined by Western Blotting, and erythrophagocytosis was determined by microscopy. IFN? and TNFa increased SIRPa gene and protein expression and SHP-1 gene expression, in parallel with a decrease in erythrophagocytosis ability in PBM. On the other hand, although SIRPa and SHP-1 gene expression was significantly increased, dexamethasone did not alter SIRPa and SHP-1 protein expression, and did not alter erythrophagocytosis ability in monocytes. SIRPa and SHP-1 expression was significantly higher in PBM from AIHA patients compared to normal. After GC therapy, SIRPa and SHP-1 expression was similar in PBM of AIHA patients compared to healthy donors. AIHA patients studied before glucocorticoid therapy showed low hemoglobin and after glucocorticoid therapy the level of hemoglobin was normal. SIRPa gene expression was increased by culture with hemin, but protein expression remained the same. Our results confirm the key role of SIRPa in erythrophagocytosis regulation and suggest that SIRPa mRNA expression in AIHA patients before glucocorticoid therapy is increased by heme release, and the decrease of SIRPa gene expression after glucocorticoid therapy is due to an indirect effect of this drug by the reduction of erythophagocytosis and free heme availability. / Doutorado / Doutor em Farmacologia