L’étude des phénomènes biologiques et notamment du rôle des protéines au sein d’un mécanisme cellulaire est un défi pour les biologistes. L’avènement de la microscopie de fluorescence à excitation biphotonique et des techniques « super-résolutives » a permis l’amélioration des performances des techniques de microscopie classiques et l’application l’imagerie in vivo pour l’analyse des tissus biologiques. Ces techniques requièrent cependant l’emploi de sondes aux propriétés photophysiques optimisées en complément de la spécificité vis-à-vis de la ou des cible(s) biologique(s). L’epicocconone, une molécule naturelle profluorescente de la famille des azaphilones, est employée en protéomique pour la détection des protéines sur gel d’électrophorèse. Ce composé a la faculté de réagir avec les amines des résidus lysine des protéines pour former un adduit covalent énaminone hautement fluorescent dans le proche infrarouge (610 nm) sous irradiation UV (395 nm) ou visible (520 nm). Différents analogues synthétisés au sein du laboratoire ont permis d’étudier la relation structure-fluorescence de ces composés capables de détecter non spécifiquement les protéines du milieu étudié. Afin d’améliorer la spécificité de ces molécules en vue d’applications en imagerie, la synthèse de sondes polyfonctionnelles, via une réaction de cycloaddition 1,3 dipolaire azoture-alcyne catalysée au cuivre, associant un analogue de l’epicocconone à un agent de reconnaissance possédant une affinité particulière pour une cible biologique a été étudiée. La synthèse d’analogues de l’epicocconone optimisés pour l’absorption biphotonique a également été réalisée lors de cette thèse. Les propriétés optiques linéaires et non linéaires de ces composés ont été étudiées afin de sélectionner le meilleur composé pour des applications en imagerie par microscopie de fluorescence à excitation biphotonique. Enfin, la réactivité particulière des azaphilones a servi de point de départ au développement d’une stratégie d’identification et d’isolement de nouvelles molécules naturelles azaphiles grâce à l’utilisation de sondes à produits naturels capables de cibler spécifiquement ce type de composés. / Understanding biological processes that involve proteins is a challenge for biologists. Two-photon excitation and super-resolution microscopy have improved drastically bioimaging techniques allowing in vivo deep tissue analysis. However those techniques require the use of optimized and selective fluorescent probes. Epicocconone is a natural profluorescent azaphilone widely used in proteomics for detecting proteins on electrophoresis gels. This compound can react reversibly with primary amines from lysines forming a covalent enaminone adduct that emits near infrared fluorescence light (610 nm) upon UV (395 nm) or visible (520 nm) excitation. Different analogues, that non-selectively bind to proteins, were previously synthesized in order to understand the structure-fluorescence relationship. The synthesis of polyfunctionnal probes was studied using copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition to connect the epicocconone scaffold to a recognition moiety, which can specifically recognise one biological target. New analogues optimized for two-photon absorption were synthesized. Their linear and non-linear optical properties were determined to select the most suitable molecule for two-photon excitation microscopy.In a last part, the particular reactivity of azaphilones was also regarded as a useful strategy for designing probes which could react specifically with azaphilic natural products in order to identify and isolate new ones

Sabe-se que micro-organismos são vistos como promissoras fontes de moléculas bioativas, incluindo-se nesse grupo fungos endofíticos e também entomopatogênicos. Desse modo, foram selecionados o fungo entompatogênico Beauveria bassiana e o fungo endofítico Mycoleptodiscus indicus. Numa primeira etapa foram prospectadas condições de cultivo favoráveis à obtenção de metabólitos secundários com atividade biológica. Este trabalho foi guiado por ensaios biológicos e análises cromatográficas. As frações obtidas nos cultivos de escala ampliada foram submetidas a ensaios biológicos (leishmanicida, antimalárico, antimcrobiano e citotóxico). As frações diclorometânicas e em acetato de etila de ambos os fungos apresentaram resultados promissores em ensaios antitumorais e leishmanicidas. Em seguida, estas frações foram submetidas a processos cromatográficos que permitiram o isolamento de substâncias, cujas estruturas químicas foram elucidadas por meio do uso de técnicas de RMN, espectrometria de massas, UV, IV, rotação óptica (?D) e difração de raio-X. A partir de cultivos de B. bassiana foram obtidos compostos da classe das piridonas: piridovericina, piridovericina-N-O-(4-O-metil-?-D-glucopiranosídeo) e 15-desóxi-piridovericina, sendo os dois últimos inéditos; e das aloxazinas: 7,8-dimetilaloxazina (lumicromo) e 1-metil-11-hidróxilumicromo, sendo este inédito. A partir dos cultivos de M. indicus foram obtidas substâncias de duas classes: cromenos e azafilonas. Neste trabalho foram isolados derivados cromenos: eugenitina, 6-metóxieugenina e 9-hidróxieugenina, os quais têm sido isolados de uma ampla variedade de plantas e fungos. As azafilonas são uma classe estruturalmente diversa de metabólitos fúngicos, conhecidos pigmentos com estrutura pirano-quinona que contêm um núcleo bicíclico altamente oxigenado e um centro quiral quaternário. Foram obtidas duas azafilonas conhecidas: austidiol e austidiol diacetato (produto de acetilação); e três azafilonas inéditas: dímero de austidiol, austidiol diidroisocumarina e austidiol cromeno. As três azafilonas inéditas de M. indicus apresentam um padrão não usual de conexão entre dois policetídeos aromáticos, uma ponte metilênica. O isolamento de tais moléculas reforça a hipótese de que a biossíntese ocorra com a participação de uma molécula de formaldeído. As substâncias purificadas foram submetidas aos ensaios biológicos para confirmar o potencial de suas frações geradoras. No ensaio citotóxico as azafilonas austidiol e austdiol diacetato e a piridona piridovericina mostraram-se ativas contra as linhagens tumorais avaliadas, embora em concentrações superiores aos padrões utilizados. Além disso, apresentaram algum grau de seletividade (não tóxicas para linfócitos humanos). Também nos ensaios leishmanicidas, austidiol, austidiol diacetato e piridovericina mostraram-se ativos, embora em níveis inferiores aos leishmanicidas padrões. De modo que, pode-se considerar que as azafilonas e piridonas são bons compostos líderes para a busca de agentes citotóxicos e leishmanicidas, uma vez que estas classes de compostos possuem dinamicidade biológica. Por fim, o isolamento e elucidação de novos metabólitos das classes azafilonas e piridonas contribuem para o enriquecimento destas importantes classes de metabólitos fúngicos, ao mesmo tempo, que evidenciam a importância dos fungos endofíticos e entomopatogênicos na química de produtos naturais. / It is known that microorganisms are considered as promising source of bioactive molecules and endophytic and entomopathogenic fungi are included in this group. Therefore, we selected the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana and the endophytic fungus Mycoleptodiscus indicus to initiate the prospection aiming to determine the favorable growing conditions to obtain secondary metabolites with biological activity. This work was guided by biological assays and chromatographic analysis. The fractions obtained in the cultivation in a large scale were subjected to biological tests (leishmanicidal, antimalarial, antimicrobial and cytotoxic). The dichloromethane and ethyl acetate fractions of both fungi showed promising results in antitumor and leishmanicidal assays. Then, these fractions were subjected to chromatographic processes that allowed the isolation of compounds whose chemical structures were elucidated through the use of NMR techniques, mass spectrometry, UV, IR, ?D, and X-ray diffraction. From cultures of B. bassiana were obtained compounds from the pyridone class: pyridovericin, pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-?-D-glucopyranoside) and pyridovericin-15-deoxy, being the latter two novel compounds; and alloxazine class: 7,8-dimethylalloxazine (lumichrome) and 1-methyl-11-hydroxylumichrome, being this last one unprecedented. From M. indicus cultures were obtained compounds from two classes: azaphilone and chromene. In this thesis we report the derivatives eugenitin, 6-methoxyeugenin and 9-hydroxyeugenin, which have been isolated from a wide variety of plants and fungi. Azaphilones are a class of structurally diverse fungal metabolites, known pigments with pyran-quinone structure and contains a highly oxygenated bicyclic core and a chiral quaternary center. Then, we obtained two known azaphilones: austdiol and austdiol diacetate (product of acetylation), and three unprecedent azaphilones: austdiol dimer, austdiol dihydroisocoumarin and austdiol chromen. The three new azaphilones from M. indicus have an unusual pattern of connection between two aromatic polyketides, a methylene bridge. The isolation of these molecules reinforces the hypothesis that the biosynthesis occurs with the participation of one formaldehyde molecule. The purified compounds were submitted to biological assays. In the cytotoxic assay the azaphilones austdiol and austdiol diacetate, and the pyridone pyridovericin displayed activity against tumor cell lines, although at higher concentrations than the standard compounds used. Moreover, there was some degree of selectivity, since the assayed compounds were not toxic to human lymphocytes. Also in leishmanicidal assays, austdiol, austdiol diacetate and pyridovericin displayed activity, although at levels lower than leishmanicidal standards. Thereby, it can be considered that azaphilone and pyridone compounds are good leader compounds to search for cytotoxic and leishmanicidal agents, since these classes of compounds have biological dynamicity. Finally, the isolation and elucidation of new metabolites belonging to azaphilone and pyridone classes contribute to the enrichment of these important fungal metabolites and, likewise, this study demonstrates the importance of endophytic and entomopathogenic fungi in natural products chemistry.

Sabe-se que micro-organismos são vistos como promissoras fontes de moléculas bioativas, incluindo-se nesse grupo fungos endofíticos e também entomopatogênicos. Desse modo, foram selecionados o fungo entompatogênico Beauveria bassiana e o fungo endofítico Mycoleptodiscus indicus. Numa primeira etapa foram prospectadas condições de cultivo favoráveis à obtenção de metabólitos secundários com atividade biológica. Este trabalho foi guiado por ensaios biológicos e análises cromatográficas. As frações obtidas nos cultivos de escala ampliada foram submetidas a ensaios biológicos (leishmanicida, antimalárico, antimcrobiano e citotóxico). As frações diclorometânicas e em acetato de etila de ambos os fungos apresentaram resultados promissores em ensaios antitumorais e leishmanicidas. Em seguida, estas frações foram submetidas a processos cromatográficos que permitiram o isolamento de substâncias, cujas estruturas químicas foram elucidadas por meio do uso de técnicas de RMN, espectrometria de massas, UV, IV, rotação óptica (?D) e difração de raio-X. A partir de cultivos de B. bassiana foram obtidos compostos da classe das piridonas: piridovericina, piridovericina-N-O-(4-O-metil-?-D-glucopiranosídeo) e 15-desóxi-piridovericina, sendo os dois últimos inéditos; e das aloxazinas: 7,8-dimetilaloxazina (lumicromo) e 1-metil-11-hidróxilumicromo, sendo este inédito. A partir dos cultivos de M. indicus foram obtidas substâncias de duas classes: cromenos e azafilonas. Neste trabalho foram isolados derivados cromenos: eugenitina, 6-metóxieugenina e 9-hidróxieugenina, os quais têm sido isolados de uma ampla variedade de plantas e fungos. As azafilonas são uma classe estruturalmente diversa de metabólitos fúngicos, conhecidos pigmentos com estrutura pirano-quinona que contêm um núcleo bicíclico altamente oxigenado e um centro quiral quaternário. Foram obtidas duas azafilonas conhecidas: austidiol e austidiol diacetato (produto de acetilação); e três azafilonas inéditas: dímero de austidiol, austidiol diidroisocumarina e austidiol cromeno. As três azafilonas inéditas de M. indicus apresentam um padrão não usual de conexão entre dois policetídeos aromáticos, uma ponte metilênica. O isolamento de tais moléculas reforça a hipótese de que a biossíntese ocorra com a participação de uma molécula de formaldeído. As substâncias purificadas foram submetidas aos ensaios biológicos para confirmar o potencial de suas frações geradoras. No ensaio citotóxico as azafilonas austidiol e austdiol diacetato e a piridona piridovericina mostraram-se ativas contra as linhagens tumorais avaliadas, embora em concentrações superiores aos padrões utilizados. Além disso, apresentaram algum grau de seletividade (não tóxicas para linfócitos humanos). Também nos ensaios leishmanicidas, austidiol, austidiol diacetato e piridovericina mostraram-se ativos, embora em níveis inferiores aos leishmanicidas padrões. De modo que, pode-se considerar que as azafilonas e piridonas são bons compostos líderes para a busca de agentes citotóxicos e leishmanicidas, uma vez que estas classes de compostos possuem dinamicidade biológica. Por fim, o isolamento e elucidação de novos metabólitos das classes azafilonas e piridonas contribuem para o enriquecimento destas importantes classes de metabólitos fúngicos, ao mesmo tempo, que evidenciam a importância dos fungos endofíticos e entomopatogênicos na química de produtos naturais. / It is known that microorganisms are considered as promising source of bioactive molecules and endophytic and entomopathogenic fungi are included in this group. Therefore, we selected the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana and the endophytic fungus Mycoleptodiscus indicus to initiate the prospection aiming to determine the favorable growing conditions to obtain secondary metabolites with biological activity. This work was guided by biological assays and chromatographic analysis. The fractions obtained in the cultivation in a large scale were subjected to biological tests (leishmanicidal, antimalarial, antimicrobial and cytotoxic). The dichloromethane and ethyl acetate fractions of both fungi showed promising results in antitumor and leishmanicidal assays. Then, these fractions were subjected to chromatographic processes that allowed the isolation of compounds whose chemical structures were elucidated through the use of NMR techniques, mass spectrometry, UV, IR, ?D, and X-ray diffraction. From cultures of B. bassiana were obtained compounds from the pyridone class: pyridovericin, pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-?-D-glucopyranoside) and pyridovericin-15-deoxy, being the latter two novel compounds; and alloxazine class: 7,8-dimethylalloxazine (lumichrome) and 1-methyl-11-hydroxylumichrome, being this last one unprecedented. From M. indicus cultures were obtained compounds from two classes: azaphilone and chromene. In this thesis we report the derivatives eugenitin, 6-methoxyeugenin and 9-hydroxyeugenin, which have been isolated from a wide variety of plants and fungi. Azaphilones are a class of structurally diverse fungal metabolites, known pigments with pyran-quinone structure and contains a highly oxygenated bicyclic core and a chiral quaternary center. Then, we obtained two known azaphilones: austdiol and austdiol diacetate (product of acetylation), and three unprecedent azaphilones: austdiol dimer, austdiol dihydroisocoumarin and austdiol chromen. The three new azaphilones from M. indicus have an unusual pattern of connection between two aromatic polyketides, a methylene bridge. The isolation of these molecules reinforces the hypothesis that the biosynthesis occurs with the participation of one formaldehyde molecule. The purified compounds were submitted to biological assays. In the cytotoxic assay the azaphilones austdiol and austdiol diacetate, and the pyridone pyridovericin displayed activity against tumor cell lines, although at higher concentrations than the standard compounds used. Moreover, there was some degree of selectivity, since the assayed compounds were not toxic to human lymphocytes. Also in leishmanicidal assays, austdiol, austdiol diacetate and pyridovericin displayed activity, although at levels lower than leishmanicidal standards. Thereby, it can be considered that azaphilone and pyridone compounds are good leader compounds to search for cytotoxic and leishmanicidal agents, since these classes of compounds have biological dynamicity. Finally, the isolation and elucidation of new metabolites belonging to azaphilone and pyridone classes contribute to the enrichment of these important fungal metabolites and, likewise, this study demonstrates the importance of endophytic and entomopathogenic fungi in natural products chemistry.