Les bactériophages ARN F-spécifiques sont couramment utilisés comme des modèles de virus entériques pathogènes pour l’homme car ils ont une taille (~ 25 nm) et une structure proches. Néanmoins, en dehors de leurs cellules hôtes, les phages, tout comme les virus pathogènes, sont des particules biologiques inertes dont le comportement dépendra directement des propriétés de surface. Paradoxalement, peu de données sont connues dans ce domaine alors que ce sont des aspects incontournables, tant d’un point de vue théorique pour développer de nouvelles approches adaptées aux particules biologiques, que d’un point de vue industriel pour limiter le risque viral. L’objectif de ce travail est de préciser les propriétés interfaciales de bactériophages ARN Fspécifiques (charge, hydrophobicité) en milieu aqueux et en tenant compte des spécificités des particules biologiques notamment de leur perméabilité hydrodynamique. Nous avons également cherché à relier ces propriétés aux capacités d’adhésion-agrégation des particules virales. Deux aspects sont abordés : l’élimination des virus par des procédés de filtration membranaire et l’impact de l’agrégation sur l’estimation du nombre d’unités infectieuses. Dans la première partie, nous avons défini la nature et les caractéristiques de l’interface du phage MS2 et son impact sur les mesures de mobilités électrophorétiques. Pour la première fois, nous décrivons le comportement électrocinétique de particules biologiques sphériques constituées de plusieurs couches molles (génome, génome accolé à la capside, capside protéique) en prenant en compte l’anisotropie chimique et structurale des particules. Il en résulte des mobilités négatives dues à une perméabilité élevée, d’un ordre de grandeur égal à l’épaisseur de la capside protéique ( 2 nm). Cette perméabilité permet au flux électro-osmotique de « sonder » la charge négative du génome du phage MS2 et montre que les virus ne peuvent pas être assimilés à des particules dures non perméables. Le potentiel zêta (?) n’est donc pas adapté à ce type de particule. Comme le génome a un impact sur la charge du virus, nous nous sommes intéressés à quatre phages ARN F-spécifiques ayant des tailles de génome différentes : ~ 3500 nucléotides pour les phages MS2 et GA, ~ 4200 nucléotides pour les phages Qß et SP. En combinant des mesures de tailles et de mobilités pour différentes valeurs de pH (de 1,5 à 7,5) et de forces ioniques (NaNO3, 1 et 100 mM), nous avons défini l’échelle d’hydrophobicité suivante : GA et SP > Qß > MS2. De même, en nous basant sur les mobilités électrophorétiques, il ressort que la charge négative du phage Qß sous forme isolée est plus importante que celle du phage MS2 (perméabilité hydrodynamique supposée comparable à l’état isolé). Le point isoélectrique (pI) de la littérature pour le phage Qß (5,3) a d’ailleurs été remis en cause (entre 1,9 et 2,7 dans cette étude). Les mobilités des phages SP et GA ne peuvent être comparées aux autres car ces phages sont sous forme agrégée et donc présentent une perméabilité hydrodynamique différente. Ces propriétés interfaciales différentes permettent d’expliquer le comportement des phages MS2 et Qß lors d’un traitement par filtration membranaire. Les membranes classiquement utilisées dans le cadre du traitement de l’eau sont hydrophiles et électronégatives. Or, c’est bien le phage Qß qui est toujours moins bien éliminé, quelle que soit la porosité de la membrane (ultrafiltration ou microfiltration). Nous avons par ailleurs démontré que les techniques rapides de RT-PCR en temps réel sont aussi adaptées que la technique de référence par plages de lyse (UFP). Finalement, dans certains cas, l’agrégation virale pourrait expliquer la baisse des unités infectieuses (UFP) du phage MS2 en solution. Cette agrégation peut entraîner une baisse d’UFP de 1 à 3 log10. La congélation cause également une perte d’UFP mais celle-ci est due à la dégradation du virus et non à son agrégation. Ainsi, les méthodes expérimentales et théoriques développées dans cette thèse ont abouti à une meilleure connaissance des propriétés interfaciales des phages ARN F-spécifiques. Les résultats fondamentaux obtenus ont également mené à des avancées méthodologiques pour des applications industrielles. / thesis

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / Bactéries et phages sont en perpétuelle compétition dans l’environnement et évoluent conjointement. Plusieurs mécanismes ont été développés de part et d’autre pour maintenir un état d’équilibre. D’un côté, les phages sont des entités qui se répliquent efficacement et rapidement en parasitant leur bactérie hôte. D’un autre côté, les bactéries ont acquis des mécanismes de résistance aux bactériophages tels que les systèmes d’avortement de l’infection (Abi) pour limiter l’infection et la propagation des phages dans les populations bactériennes. Plus spécifiquement, le système antiphage AbiQ a été isolé de la bactérie Lactococcus lactis. Cette dernière est utilisée pour la production de divers produits laitiers fermentés. Malgré cet environnement contrôlé, des phages peuvent perturber les fermentations s’ils sont présents dans le lait et les usines. Il n’est donc pas surprenant que cette bactérie possède des systèmes contre ces envahisseurs. Le système antiphage AbiQ serait similaire à un mécanisme de type toxine-antitoxine (TA), mais son fonctionnement demeure jusqu’à maintenant inconnu. Au cours de ce projet de doctorat, trois objectifs ont été poursuivis afin de comprendre la relation entre la bactérie Lactococcus lactis et ses phages. Dans un premier temps, le génome du phage 949, un membre d’un groupe rare de lactophages portant son nom, a été séquencé et caractérisé. Une comparaison de tous les génomes de phages infectant L. lactis a été réalisée afin de confirmer la classification actuelle. Dans un deuxième temps, le mode d’action toxine-antitoxine du système AbiQ de L. lactis a été approfondi. Pour ce faire, des expériences ont été réalisées afin de démontrer que ce système est un mécanisme de type TA composé d’une antitoxine d’ARN et d’une toxine protéique avec une activitée ribonucléase. Dans un troisième temps, l’effet d’AbiQ sur la réplication des phages a été évalué. En isolant des phages mutants ayant la capacité de contourner le mécanisme, des cibles phagiques potentielles du système AbiQ ont été identifiées. Comprendre la relation phage-hôte est la clé pour le développement de bactéries résistantes aux phages dans un contexte de production industrielle ou pour limiter l’apparition de résistance aux phages lors du traitement des infections bactériennes par la thérapie phagique. / Bacteria and phages are continuously challenging each other and evolve in most ecosystems. Many strategies have been adapted by both of them to reach an equilibrium state. On one side, phages can infect efficiently and rapidly their bacterial host. On the other side, bacteria have acquired antiphage mechanisms to resist phage infection and limit their propagation such as abortive infection mechanisms (Abi). Specifically, the AbiQ antiphage system was isolated from Lactococcus lactis. This bacterium is used to produce an array of fermented dairy products. Even if this environment is tightly controlled, phages are ubiquitous in milk and in factories, and they can affect fermentations. The AbiQ antiphage system ressembles to a toxin-antitoxin (TA) system, but its mode of action is still unknown. In this study, three objectives were persued in order to better understand the relationship between Lactococcus lactis and its phages. First, the phage 949 genome, a member of a rare lactophage group that bears its name, was sequenced and characterized. A genome comparison of all lactococcal phages sequenced to date was done to confirm the current phage classification. In the second objective, we have confirmed that AbiQ is indeed a toxin-antitoxin system. Experiments were performed to demonstrate that this TA mechanism is composed of a RNA antitoxin and a protein toxin with ribonuclease activity. In the third objective, the effect of AbiQ on the phage replication was evaluated. By isolating phage mutants able to escape the mechanism, different phage targets were identified. Understanding the phage-host relationships is the key to develop efficient tools to reduce phage infection in industrial settings or to limit the development of phage resistance in other applications such as in phage therapy.

L’utilisation de mécanismes anti-phages est l’une des stratégies pour prévenir et contrôler la contamination par les bactériophages qui peuvent causer des pertes importantes pour l’industrie de la transformation laitière. AbiQ est un mécanisme d’avortement de l’infection phagique de type toxine-antitoxine (type III) isolé d’une souche de Lactococcus lactis. Des études précédentes ont démontrées que la toxine ABIQ (protéine) coupe son antitoxine (ARN non codant) in vivo, et que la protéine virale ORF38 du lactophage P008 joue un rôle essentiel dans l’activité anti-phage. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés au mode d’action d’AbiQ via trois objectifs spécifiques : caractériser l’effet de différentes mutations de l’antitoxine, analyser le comportement viral et cellulaire en présence d’AbiQ et définir le rôle de la cible/activateur viral ORF38. Nos résultats démontrent qu’il est possible d’optimiser l’efficacité anti-phage par modification de l’antitoxine et suggèrent que l’ORF38 interagit avec l’ARN antitoxine permettant la libération de la toxine. / Antiphage mechanisms represent one of the strategies available to prevent or control contamination by virulent phages, which are a major risk of fermentation failure in the dairy industry. The lactococcal phage abortive infection system AbiQ belongs to type III toxin-antitoxin system. It has been previously demonstrated that the toxin ABIQ (protein) cleaves his antitoxin (non-coding RNA) in vivo, while the protein ORF38 from phage P008 plays an essential role in the antiphage activity. In this study, we investigated the mode of action of AbiQ through three specific objectives: describe the effect of specific modifications in the antitoxin, analyse the viral and cellular behaviours in presence of AbiQ and determine the role of the phage P008 target/activator ORF38. Our results show that we can optimise the antiphage activity of AbiQ through mutation in the antitoxin and suggest that ORF38 can bind the antitoxin RNA to favour the release of the toxin.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Plus d'un siècle s'est écoulé depuis le premier signalement de la furonculose, une maladie affectant les salmonidés. Au Québec, la furonculose représente environ 25 à 50 % des maladies diagnostiquées chez les salmonidés chaque année. Les options thérapeutiques contre la furonculose se limitent pour la plupart aux vaccins et aux antibiotiques. L'utilisation de vaccins chez les poissons est lourde, coûteuse et peu disponible au Québec. Les antibiotiques constituent le traitement le plus commun. L'utilisation excessive d'antibiotiques augmente le risque de développement de souches résistantes aux antibiotiques. *Aeromonas salmonicida* subsp. *salmonicida*, l'agent causal de la furonculose, a été identifié comme une source importante de gènes de résistance aux antibiotiques, et on sait maintenant que cette bactérie peut transférer ou acquérir des éléments génétiques mobiles même à partir d'autres espèces bactériennes dans les milieux aquatiques. Il est donc impératif d'introduire des traitements alternatifs plus durables. La phagothérapie a retenu l'attention en raison de ses nombreux avantages par rapport aux options thérapeutiques potentielles. L'utilisation de phages individuels, sous forme de cocktail ou même comme adjuvant aux antibiotiques, peut constituer une option thérapeutique prometteuse contre l'infection par la furonculose. Les objectifs de la présente thèse de doctorat étaient: (1) l'étude de la dynamique des cocktails de phages et des interactions bactériennes en milieu liquide; (2) l'isolement de nouveaux phages pour augmenter l'efficacité du futur cocktail qui sera utilisé dans les fermes piscicoles du Québec; (3) le développement d'une métrique fiable pour une interprétation plus facile des courbes de croissance bactérienne traitées avec des phages afin de faciliter la comparaison de plusieurs courbes prenant en compte des profils de croissance de tout type. Avant de réaliser des tests *in vivo*, il était crucial de rationaliser le processus de sélection des phages grâce à des mesures de densité optique de la croissance bactérienne influencée par les phages. Ce travail d'optimisation a confirmé qu'un cocktail de quatre phages à multiplicité d'infection (MOI) de 1 présente la plus grande efficacité lytique contre une bactérie modèle. Cependant, l'utilisation du même cocktail à une MOI identique contre des souches porteuses du Prophage 3 a conduit à un phénomène de résistance qui n'a été observé qu'en milieu liquide. Le phénomène de résistance a été confirmé en testant le même cocktail sur des souches sensibles lysogénéisées par le Prophage 3. Afin de contourner la résistance aux phages observée, et d'augmenter le potentiel lytique du futur cocktail contre la furonculose, une solution consistait à isoler de nouveaux phages en utilisant des souches résistantes comme hôte bactérien. Par conséquent, MQM1, un podophage virulent, a été isolé du mucus de poissons probablement morts à cause de la furonculose. Il a été confirmé que ce phage est dépourvu d'enzymes associées au cycle lysogène et de facteurs de virulence, ce qui indique qu'il pourrait être utilisé en phagothérapie. De plus, en plus de présenter un fort phénotype bactéricide perceptible au moins 24 heures après l'infection chez 87 % des souches porteuses de Prophage 3 trouvées dans la collection *A. salmonicida* subsp. *salmonicida*, MQM1 présentait un taux d'adsorption élevé sur l'hôte bactérien. Dans le cadre de cette thèse, une nouvelle métrique permettant de mesurer quantitativement et de manière fiable l'efficacité lytique des phages contre des hôtes bactériens a été décrite. Cette métrique vise à rationaliser les comparaisons entre les courbes de densité optique non canoniques des bactéries affectées par les phages. Dans le dernier chapitre de cette thèse, les résultats préliminaires des tests *in vivo* menés au LARSEM sont présentés. L'objectif principal de ce premier test *in vivo* était d'évaluer l'impact de la présence de phages sur la santé des poissons et d'évaluer la persistance des phages dans l'eau des poissons en l'absence d'hôte bactérien. Le phage Riv-10 a montré une plus grande persistance dans l'aquarium après 22 jours, mais en général, le titre des phages a considérablement diminué en raison de l'absence d'hôte bactérien. De plus, aucune mortalité ou retard de croissance n'ont été observés chez les poissons suite à l'ajout de phages. Au final, cette thèse de doctorat a montré que pour disposer d'une phagothérapie efficace en aquaculture, il est important d'enrichir constamment le cocktail de phages prêt à l'emploi, par une enquête perpétuelle de l'interaction phage-bactérie, et d'adapter les procédures nécessaires en conséquence. / Over a century has passed since the initial report of the disease "furunculosis" affecting brown trout. Yet, it remains a significant challenge in ensuring the sustainability of the aquaculture industry. In Quebec, furunculosis accounts for approximately 25% to 50% of diagnosed diseases in salmonids. The treatment options for furunculosis are mostly limited to vaccines and antibiotics. The use of vaccines in fish is cumbersome, expensive, and not quite being used in Quebec, and the antibiotics are the prominent treatment currently available. The excessive antibiotics utilization increases the risk of development of antibiotic resistant strains. *Aeromonas salmonicida* subsp. *salmonicida*, the causal agent of furunculosis, has been identified as a significant source of antibiotic-resistant genes, and it is now known that it could transfer/acquire mobile genetic elements both between species and within the same species in aquatic environments. Therefore, it is imperative to introduce alternative treatments that are more sustainable. Phage therapy has garnered attention due to its numerous advantages over potential treatment options. Thus, using phages individually, in a form of cocktail, or even as adjuvant to antibiotics may provide a promising treatment opportunity against furunculosis infection. The objectives of the present doctoral thesis were as follows: (1) to investigate the dynamics of phage cocktails and bacteria interaction in liquid assay; (2) to isolate new phages to increase the efficiency of the future « prêt-à-porter » phage cocktail which will be used in Quebec fish farms; (3) to develop a trustable quantitative metric for easier interpretation of phage-treated bacterial growth curves to facilitate the comparison of multiple curves taking into account growth profiles of all types. To adhere to the 3R rule (Replacement, Reduction, & Refinement) before conducting *in vivo* tests involving various combinations of phages, it was crucial to streamline the selection process through optical density measurements of bacterial growth when mixed with phages Additionally, the optical density measurements could help to better understand the dynamics of phage-bacteria interactions. A four-phage cocktail at multiplicity of infection (MOI) of 1 was confirmed to provide the highest lytic efficiency against a model bacterium. However, using the same cocktail at the same MOI against strains bearing Prophage 3 led to a resistance phenomenon which was only observed in liquid media. The resistance phenomenon was confirmed by testing the same cocktail on sensitive strains which were lysogenized by Prophage 3. In order to bypass the observed phage resistance, and to increase the lytic potential of the future phage cocktail against furunculosis, one solution was to isolate new phages by using resistant strains as the bacterial host. Consequently, MQM1, a virulent podophage, was isolated from the mucus of deceased fish suspected of having furunculosis. This phage was confirmed to lack enzymes associated with the lysogenic cycle and virulence, indicating that it may be useful in phage therapy. Additionally, apart from displaying a strong bactericidal phenotype that was noticeable at least 24 hours after infection in 87% of the Prophage 3-bearing strains found in the *Aeromonas* collection, MQM1 exhibited a high adsorption rate on the bacterial host. As part of this thesis, the development of a novel metric for quantitatively and reliably measuring the lytic efficiency of phages against bacterial hosts was introduced. This metric aims to streamline comparisons among non-canonical optical density curves of bacteria challenged with phages. In the final chapter of this thesis, the preliminary results of *in vivo* tests conducted at the LARSEM facility are presented. The primary objective of this initial *in vivo* test was to assess the impact of phages on fish health and to evaluate the persistence of phages in fish water in the absence of a bacterial host. Phage Riv-10 displayed greater persistence in the fish tank after 22 days, but in general, phage titers dramatically decreased due to the absence of a bacterial host. Also, no mortality was seen in fish as a result of phage addition. At the end, this doctoral thesis showed that to have an efficient phage therapy strategy in aquaculture, it is important to constantly enrich the ready-to-use phage cocktail, by perpetual investigation of phage-bacteria interactions, and adapt the necessary procedures accordingly.

Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène des animaux et de l'homme causant plusieurs symptômes chez ceux-ci. De plus, elle est responsable d'intoxications alimentaires liées à l'ingestion de nourritures contaminées par des entérotoxines staphylococciques. Avec l'émergence de souches staphylococciques résistantes aux .antibiotiques, l'utilisation de phages virulents est maintenant envisagée comme alternative pour lutter contre les souches pathogènes de S. aureus. Au cours de ce projet, un nouveau phage virulent (LH1) a été isolé à partir d'échantillons de lait cru. L'utilisation de ce dernier et du phage K dans du lait UHT a montré qu'ils sont capables d'éliminer les souches de S. aureus mais que leur activité lytique est inhibée dans le lait cru par un composé encore inconnu. La présence de deux gènes codant pour la toxine leucocidine de Panton-Valentin dans le génome du phage LH1 compromet son utilisation comme agent de biocontrôle dans les applications alimentaires et médicales. Finalement, un arbre phylogénétique a été créé en comparant et regroupant 54 génomes de phages différents de S. aureus disponibles dans GenBank en plus de deux nouveaux phages isolés incluant LH1. L'avancement des connaissances sur des phages de S. aureus pourrait favoriser leur utilisation dans la prévention ou le contrôle des intoxications alimentaires.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Lactococcus lactis transforme le lait en produits fermentes, mais parfois des bactériophages virulents peuvent altérer ce processus. Les phages de l'espèce 936 de L. lactis sont principalement retrouvés dans l'industrie de la transformation du lait. Une meilleure compréhension de leurs mécanismes évolutifs pourrait permettre un meilleur contrôle de cette espèce de phages. Dans ce travail, l'analyse de six phages de l'espèce 936 infectant la même souche industrielle de L. lactis et isolés dans la même fromagerie québécoise a été effectuée. Le séquençage complet de leur génome à ADN, une identification des protéines structurales ainsi que des hybridations de type ADN-ADN ont été réalisées. Après analyses comparatives, deux phages se sont révélés à 100% identiques et ce, même s'ils ont été isolés à 14 mois d'intervalle. De plus, aucun ADN des phages à l'étude n'a été retrouvé dans le génome des bactéries hôtes. Ces résultats suggèrent que ces phages sont capables de persister dans une usine et de s'échanger du matériel génétique entre eux.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Lactococcus lactis est une bactérie largement utilisée par l'industrie laitière et sa sensibilité à des bactériophages virulents a une importance économique considérable. La caractérisation de ces phages est donc essentielle pour mieux comprendre leur fonctionnement afin de les contrôler. À ce jour, aucune technique fiable pour modifier génétiquement des lactophages virulents n’est disponible. Une des avenues possibles est l’utilisation d’une approche de génie génétique faisant appel à des recombinases de phages, le recombineering. Ce projet de maîtrise visait le développement d’un système de recombineering pour les lactophages virulents. Les expériences in vivo chez L. lactis ont montré que les recombinases Sak et Sak3 n’étaient pas appropriées pour faire du recombineering. Curieusement, quelques recombinants ont été obtenus indépendamment des recombinases, probablement par un processus encore mal compris appelé oligo-recombinaison. Ce mécanisme n’avait pas encore été observé chez une bactérie à Gram positif et a aussi été efficace pour construire des lactophages mutants. / Lactococcus lactis is a widely used bacterium by the dairy industry and its sensitivity to virulent bacteriophages has an important economic relevance. Thus, the characterization of these phages is needed to better understand their mecanism of infection and to control them. Currently, no reliable tool is available to genetically modify virulent lactococcal phages. A possible approach is a genetic engineering method called recombineering which relies on the use of phage recombinases. The aim of this M. Sc. Project was to develop a recombineering system for virulent phages infecting L. lactis. In vivo experiments have shown that recombinases Sak and Sak3 were not efficient for recombineering. Interestingly, a few recombinants were obtained independantly of these recombinases, probably by the uncharacterized process named oligo-recombination. This mechanism had not been observed yet in a Gram-positive bacterium, and it has also been efficient to produce lactococcal phage mutants.

Lactococcus lactis est une bactérie lactique très utilisée pour la fabrication de divers fromages. Cependant, cette bactérie est susceptible aux bactériophages qui peuvent causer sporadiquement des problèmes de fermentation. À cause de ces problèmes, les phages de L. lactis sont les plus étudiés après les entérophages. Néanmoins, bien des notions restent vagues au sujet de l’évolution et la biologie de ceux-ci, et ceci est particulièrement saillant pour les systèmes anti-phages. Au cours de ce projet, trois différents aspects de la biologie ces phages ont été abordés : leur diversité génétique, leur évolution, et les mécanismes anti-phages. Le séquençage du génome du phage P335 a permis de démontrer l’hétérogénéité des membres du groupe du même nom ainsi que de détecter l’émergence de sous-groupes à l’intérieur de celui-ci. De plus, un module de gènes morons a été identifié. Ces gènes possèdent de l’homologie avec des séquences provenant de prophages appartenant à d’autres taxons. Le second objectif a démontré la plasticité génétique des phages du groupe P335 et leur évolution en présence de deux mécanismes de résistance aux phages de type Abi. Un phage du groupe P335 a échangé jusqu’à 79% de son génome pour devenir résistant aux systèmes antiphages AbiK et AbiT. Les phages mutants ont acquis des nouveaux modules d’ADN provenant d’au moins deux prophages retrouvés dans le génome de leur hôte. Finalement, le mode d’action du mécanisme AbiT a été étudié. Plusieurs phages résistants à AbiT ont été isolés et caractérisés. Trois cibles ou activateurs d’AbiT ont été identifiés. Deux sont des gènes précoces dont la fonction est inconnue. Le troisième gène fait partie du module de morphogénèse et encode la protéine majeure de la capside. Lactococcus lactis et ses phages sont un modèle important pour la compréhension des interactions phage/hôte chez les bactéries lactiques. Ce projet a permis d’acquérir des connaissances sur la diversité génétique et l’évolution des phages du groupe P335. Ces phages possèdent une impressionnante plasticité génétique et leurs populations évoluent rapidement en présence d’une pression sélective, tels les systèmes anti-phages. Il s’est aussi avéré que le mode d’action mécanisme anti-phages AbiT est beaucoup plus complexe qu’initialement anticipé puisqu’il cible trois différentes composantes phagiques. / Lactococcus lactis is a lactic acid bacterium widely used for production of diverse cheeses. Nonetheless, this bacterium is susceptible to bacteriophages that are sporadically causing fermentation problems. The phages of L. lactis are among the most studied. However, many notions remain vague about their evolution and biology, and this is especially notable in response to anti-phage systems. Three different aspects of L. lactis phage biology were studied in this thesis: their genetic diversity, their evolution and the anti-phage mechanisms. The genome of the phage P335 was sequenced and analyzed revealing the heterogeneity of the groups bearing the same name and it was also possible to point out the emergence of sub-groups within this group. A module of moron genes possessing homology with prophages from other taxons was identified in the phage P335 illustrating the genomic plasticity of these phages. The second objective of this project was to demonstrate the genetic plasticity of the group P335 and their evolution when challenged with Abi phage resistance mechanisms. Phage mutants were isolated and characterized. One of the phage mutants had exchanged as much as 79% of its genome to acquire resistance to both AbiK and AbiT. The phage mutants have exchange genetic module from at least two different prophages within their host genome. Finally, AbiT mode of action was studied. Many phage mutants resistant to AbiT were isolated and characterized. Three AbiT targets/activators were identified. Two are early genes of unknown function. The third target is a late gene found in the morphogenesis module and is coding for the major capsid protein. Lactococcus lactis and their bacteriophages are an important model for the understanding of lactic acid bacteria phage/host interaction. This project increases our knowledge on the evolution of P335 phages and their genetic diversity. The amazing genetic plasticity of these phages allows their populations to rapidly evolve when confronted to a selective force such as anti-phage systems. Moreover, the mode of action of AbiT is more complex that initially estimated since it targets three phage components in different functional modules.

Streptococcus pneumoniae est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste chez l’humain. Elle est responsable de nombreuses infections telles que la pneumonie, la méningite, l’otite moyenne et la sinusite. En maladie infectieuse, S. pneumoniae occupe une place importante en tant que l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Elle est dotée de plusieurs capacités fascinantes, comme la compétence naturelle pour l’aider à résister aux antibiotiques et la grande diversité des sérotypes capsulaires pour contourner la vaccination. Puisque la résistance aux antibiotiques ne cesse de menacer l’efficacité des thérapies standards, la thérapie par phage est maintenant reconsidérée comme une des alternatives thérapeutiques. La réévaluation des phages fait renaitre l’espoir thérapeutique, mais sans élucider leur mécanisme d’interaction et décortiquer leur mystère cet espoir restera modeste. Ce projet de doctorat consiste à mieux comprendre les phages infectant S. pneumoniae et les interactions phage-hôte. Dans un premier temps, le potentiel des pneumophages à infecter Streptococcus mitis, une espèce phylogénétiquement proche de S. pneumoniae, a été mis en évidence. Deux pneumophages se sont avérés les premiers phages virulents capables d’infecter S. mitis, bactérie pathogène responsable d’endocardite. Les deux phages pouvaient non seulement se répliquer dans S. mitis mais également produisent des plages de lyses plus visibles. Ensuite, la comparaison du génome des phages a confirmé que le changement de l’hôte n’induit aucune variation aux génomes des phages testés. Cependant, plusieurs mutations ont été observées dans la séquence génomique du podophage sauvage et il a fait ensuite l’objet d’une nouvelle annotation. Dans un deuxième temps, l’étude des interactions phage-hôte chez S. pneumoniae a été approfondie. Pour ce faire, l’implication de plusieurs facteurs de l’hôte dans la réplication des pneumophages a été étudiée. Plusieurs gènes pneumococciques se sont avérés nécessaires ou impliqués pour assurer l'efficacité de la réplication des phages seuls ou en cocktail. D’un autre côté, en étudiant ces facteurs de l’hôte, des gènes/ protéines potentiellement essentiels à la viabilité de S. pneumoniae ont été identifiés. Cette étude a aussi permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et donne un nouvel aperçu du réseau complexe des interactions phage-hôte. / Streptococcus pneumoniae is a commensal and opportunistic pathogen bacterium, exclusively found in humans. It is the main agent of many infections such as pneumonia, meningitis, otitis media and sinusitis. S. pneumoniae infections are a major cause of morbidity and mortality worldwide. S. pneumoniae has several fascinating abilities, such as natural competence to facilitate the acquisition of antibiotic resistance genes and diversity of capsular serotypes to circumvent the vaccination. The rise of antibiotic resistant bacteria continues to threaten the effectiveness of standard therapies and as such phage therapy is now reconsidered as a therapeutic alternative. The reevaluation of phages as therapeutic agents must go through a better understanding of phage-bacterium interactions. This PhD thesis aims to better understand S. pneumoniae virulent phages and phage-host interactions. First, the ability of pneumophages to infect Streptococcus mitis, a species phylogenetically related to S. pneumoniae, was demonstrated. The pneumophages are the first two virulent phages able to infect this pathogenic bacterium, the common cause of bacterial endocarditis. Both pneumophages could not only replicate in S. mitis but also produced more visible plaques on this host. The comparison of the genomes of each phage grown on both hosts produced identical nucleotide sequences, confirming that S. mitis as a host does not induce any nucleotide variation. However, the genomic sequence of wild-type podophage was different than the previously reported sequence and it was the subject of a new annotation. In addition, S. pneumoniae phage-host interactions were investigated. The involvement of several host factors in replication of both pneumophages was observed. Indeed, several pneumococcal genes were found to be necessary or involved to ensure efficient phage replication. Moreover, the study of these host factors has led to the identification of new genes that appear to be essential for viability and normal growth of S. pneumoniae. This project led to identify new potential therapeutic targets and provided new insight into the complex network of phage-host interactions.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 mai 2023) / La métagénomique virale a permis l'identification de milliers de nouvelles séquences de phages dans une variété d'écosystèmes. Leur caractérisation est limitée par leur grande diversité, puisque la majorité des nouvelles séquences virales ne ressemble à aucun phage connu et répertorié. Pour faire face à ce défi, de nouveaux outils de la bio-informatique doivent être développés permettant de mieux comprendre les interactions phages-bactéries et ainsi élucider le rôle des phages dans leur écosystème. Une approche pour étudier les interactions phages-bactéries repose sur l'exploitation des systèmes CRISPR-Cas. Chez les bactéries et les archées, ces systèmes servent de mécanismes de défense contre le matériel génétique envahisseur comme le génome des phages. Grâce à de courtes séquences appelées espaceurs, incorporées dans leur locus CRISPR, les bactéries qui portent ce système peuvent reconnaître rapidement un génome de phage, le couper et ainsi bloquer l'infection. Les espaceurs sont archivés et continuent d'être ajoutés au fil des infections, rendant le locus CRISPR très dynamique. Pour les analyses bio-informatiques, les espaceurs ont plusieurs utilités, notamment pour le typage de souches bactériennes et pour la prédiction des hôtes bactériens de séquences virales. Cependant, les quelques outils existants ont été développés avant l'accélération massive dans la découverte de nouvelles séquences de phages offerte par la métagénomique virale. Ainsi, beaucoup de travail répétitif, manuel et non standardisé était requis pour utiliser les espaceurs CRISPR dans le contexte d'études de métagénomique. Les deux premiers chapitres de cette thèse sont dédiés au développement d'outils bio-informatiques exploitant les loci CRISPR. Dans un premier temps, le logiciel CRISPRStudio a été développé pour automatiser la création de figures représentant les loci CRISPR. Ce logiciel offre une grande polyvalence, tout en accélérant la production de figures. Dans un deuxième temps, un second logiciel a été créé pour prédire les hôtes bactériens des phages. Celui-ci s'appuie sur une base de données d'espaceurs de plus de 11 millions de séquences et d'une série de critères fondés sur la biologie des systèmes CRISPR-Cas pour sélectionner l'hôte bactérien le plus probable d'un phage. Cet outil a permis d'améliorer les performances, la standardisation et la facilité d'utilisation des approches de prédiction de l'hôte utilisant les espaceurs CRISPR. Puis, les deux outils ont été mis à profit dans le troisième chapitre pour l'étude spécifique des interactions phages-bactéries entre Escherichia coli et ses phages, dans le contexte du microbiote intestinal. La caractérisation des loci CRISPR a permis d'élucider le rôle probable du système CRISPR-Cas chez cette espèce, soit un mécanisme anti-prophages. À ma connaissance, il s'agit également de la première étude identifiant une aussi grande proportion des cibles des espaceurs, en trouvant l'origine de 60 % des proto-espaceurs. / Viral metagenomics has allowed the identification of thousands of new phage sequences in various ecosystems. Yet, their characterization is still limited by their great diversity, as the majority of new viral sequences resembles no known phages in reference databases. To tackle this challenge, new bioinformatic tools are needed to better understand phage-bacteria interactions and to elucidate the role of phages in their ecosystem. One approach to study phage-bacteria interactions consists in taking advantage of CRISPR-Cas systems. In bacteria and archaea, these systems act as defense mechanisms against invading genetic material, such as phage genomes. Thanks to short sequences called spacers incorporated in their CRISPR locus, bacteria that carry this system can rapidly recognize a phage genome and block its infection, analogous to an adaptive immune system. Spacers are archived and continue to be added upon phage infection, which makes the CRISPR locus highly dynamic. In bioinformatics analyses, spacers can be utilized to perform strain typing and to predict the bacterial hosts of phages. However, the few existing tools were developed before the metagenomics era and the massive discovery of new phage sequences. Thus, exploiting CRISPR loci for viral metagenomics projects requires repetitive, manual, and non-standardized work. The first two chapters of this thesis are dedicated to developing bioinformatics tools exploiting CRISPR loci. First, a software was developed to automatize the creation of figures representing CRISPR loci. CRISPRStudio offers versatility, is user-friendly and accelerates the figure production. Second, another software was created to predict the bacterial hosts of phages. It relies on a spacer database containing more than 11 million sequences and on a set of criteria inspired by CRISPR-Cas biology to select the most likely bacterial host for a phage genome. This tool improved the performances, the standardization, and the ease of use of host prediction approaches using CRISPR spacers. In the third chapter, the two tools were used to specifically study phage-bacteria interactions between Escherichia coli and its phages, present in the gut microbiota. CRISPR characterization allowed us to uncover the probable role of the CRISPR-Cas system in this species, being an anti-prophage mechanism. To my knowledge, this is the first study that identified a large proportion of spacer targets, by finding the origin of 60% of the protospacers.