L'émergence de la résistance aux antibiotiques représente un risque grandissant, tant au niveau de la santé animale qu'humaine. Afin de répondre à cette problématique, plusieurs options sont présentement à l'étude par la communauté scientifique, dont l'utilisation de phages comme une alternative ou un complément aux antibiotiques. Avant que ces virus bactériens ne soient une solution viable à long terme, plusieurs défis devront être relevés, dont la production optimale des phages ainsi que leur conservation et distribution. Il est également essentiel de bien comprendre le fonctionnement de ces virus et leurs interactions avec les bactéries afin de limiter l'émergence de bactéries résistantes aux phages. Le phage de Salmonella S16, un phage virulent ayant un large spectre lytique, a été étudié afin de maximiser le rendement lors de sa production. Des titres supérieurs à 1x10¹⁰ UFP/mL ont pu être obtenus de manière constante en variant la charge virale, la charge bactérienne et la multiplicité d'infection. L'atomisation des phages S16 et Felix-O1 a par la suite été réalisée afin d'obtenir une poudre concentrée de phages, facilitant l'entreposage et la distribution de ces derniers. Ensuite, des bactéries résistantes aux phages ont été générées via un cocktail de trois phages virulents (Felix-O1, 16-19 et 9 heidelberg). Les génomes de ces bactéries mutantes ont par la suite été séquencés et analysés dans le but d'identifier le mécanisme utilisé par Salmonella pour se protéger contre l'infection par ces phages. Finalement, une interaction phage-hôte peu connue, la pseudolysogénie, a été observée et analysée chez le phage S16. L'analyse protéomique via la spectrométrie de masse a permis de déterminer trois protéines du phage qui sont surexprimées lors de la pseudolysogénie comparativement à un cycle d'infection normal. Ces protéines phagiques pourraient être reliées à la régulation ou au mécanisme menant à la pseudolysogénie. / The emergence of antibiotic resistance in several pathogenic bacteria is currently a significant risk, both in animal and human health. To manage this issue, several options are currently being explored by the scientific community, including the use of phages as alternatives or complements to antibiotics. Before those bacterial viruses are seen as a long-term viable option, several challenges remain, including the optimization of phage production as well as their conservation and distribution. It is also critical to understand how these viruses work and how they interact with their bacterial hosts to limit the emergence of phage-resistant bacteria. The Salmonella phage S16, a virulent phage with a broad host range, was studied to maximize its yield during production. Titers greater than 1x10¹⁰ PFU/mL were routinely obtained by varying the viral load, the bacterial load, and the multiplicity of infection. Spray drying of phages S16 and Felix-O1 was then carried out to manufacture a concentrated phage powder, facilitating storage and distribution. Then, phage resistant Salmonella bacteria were generated using a cocktail of three virulent phages (Felix-O1, 16-19 and 9 heidelberg). The genome of these bacterial mutants was sequenced and analyzed to better understand the mechanism used by Salmonella to protect itself against phage infection. Finally, a poorly described phage-host interaction phenomenon, the pseudolysogeny, has been observed with phage S16. Proteomic analysis via mass spectrometry identified three phage proteins that are overexpressed during pseudolysogeny compared to a normal lytic cycle. These proteins could be linked to the regulation, or the mechanism involved in pseudolysogeny.

On sait maintenant depuis quelques décennies que seule une petite fraction du génome est constituée de séquences codantes pour des protéines et que la majorité de l'ADN non codant, jadis considéré comme « poubelle », assure d'importantes fonctions biologiques. Avec ce nouveau paradigme, notre perception de l'expression et la régulation génique est passée d'une vision axée sur les protéines à une vision plus centrée sur les ARN, tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. L'avènement des techniques de séquençage à haut débit comme le RNA-Seq (séquençage ARN) a fortement contribué à la démystification de cette partie « non codante » de l'ARN. Outre le triumvirat de gènes d'ARNt, d'ARNr et d'ARNm, les génomes abritent de nombreux loci qui codent pour de petits ARN régulateurs non canoniques repartis dans de nombreuses classes. Les microARN (miARN) et les fragments dérivés des ARNt (tRFs) sont les deux classes de petits ARN non codants (ARNnc) les plus abondants et partageant des similarités dans leurs mécanismes. Bien que souvent éclipsés par les protéines, ils sont au cœur de la régulation post-transcriptionnelle et sont des acteurs émergents de la relation hôte-pathogène. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans ce thème et traitent des relations hôtes-pathogènes sous l'angle des petits ARNnc à travers deux projets (#1 et #2) complémentaires qui ambitionnent d'apporter une lecture et des perspectives nouvelles. Dans le projet #1, nous avons travaillé avec le virus à ARN Ebola (EBOV), un agent pathogène connu pour provoquer une fièvre hémorragique mortelle, qui a été responsable de plusieurs épidémies en Afrique et demeure encore aujourd'hui une menace pour la santé publique mondiale. En combinant RNA-Seq, PCR quantitative et analyses computationnelles, nous avons obtenu le premier transcriptome détaillé des miRNA (miRNome) d'une lignée de cellules hépatiques humaines infectées par l'une des trois souches variantes de EBOV dont Mayinga, Makona et Reston. Lors de l'infection par EBOV, il y'a une expression différentielle de seulement 1/5 du miRNome de l'hôte au cours du temps avec une modulation spécifique des miR-122-5p, miR-148a-3p et miR-21-5p. Les données obtenues mettent en relief, au-delà des manifestations cliniques jusque-là connues, de nouvelles différences substantielles entre les souches vis-à-vis de leur effet sur le miRNome. Dans une seconde phase, avec la même approche, nous avons découvert, caractérisé et validé deux miARN viraux codés par les génomes EBOV (Mayinga et Makona). Ces deux miARN viraux peuvent potentiellement cibler des gènes impliqués dans le phénotype hémorragique, la régulation de la réplication virale et la modulation de la défense immunitaire de l'hôte. Le projet #2 s'inscrit dans un contexte où nous avions découvert fortuitement l'existence d'espèces d'ARN inférieures à 16 nt (appelés ici vsRNA pour very small RNA) qui s'avèrent fonctionnels chez les eucaryotes alors qu'ils étaient souvent retirés des jeux de données de séquençage, car considérés comme étant des « produits de dégradation ». Nous avons étendu notre analyse RNA-Seq aux bactéries pour caractériser les vsRNAs de Escherichia coli K-12 MG1655 et cinq autres souches bactériennes. L'étude est complétée par l'analyse des vésicules dérivées de la membrane externe (Outer Membrane Vesicles ; OMVs) produites par E. coli K-12 MG1655 en raison de leurs rôles déterminants pour améliorer des chances de survie, la régulation des interactions microbiennes et la promotion de la pathogenèse. Les résultats montrent l'existence de vsRNAs variés et très abondants avec les tRFs comme un biotype majeur, notamment ceux dérivés de l'ARNt isoleucine (Ile-tRF). En guise de preuve de concept de la fonctionnalité de ces vsRNAs de type tRFs, nous avons étudié en détail le très abondant et thermodynamiquement stable Ile-tRF. Nos analyses montrent qu'il est modulé sélectivement par le stress environnemental et peut être transféré via les OMVs (où il est particulièrement enrichi) aux cellules humaines HCT116 où il favorise l'expression des ARNm codant pour des membres de la famille des MAP-kinase. Notre étude est la toute première chez E. coli à rapporter l'existence de tRF abondants, trouvés dans des vésicules (OMVs) et assumant des fonctions potentielles chez l'hôte. L'Ile-tRF est également le premier tRF fonctionnel de 13 nt rapporté chez les bactéries. / For several decades now, it has been known that only a small fraction of the genome is made up of protein-coding sequences and that the majority of non-coding DNA, historically considered as "junk", carries out important biological functions. With this new paradigm, our perception of gene expression and regulation has shifted from a protein-centered view to a more RNA-centered view in both prokaryotes and eukaryotes. The advent of high-throughput sequencing techniques such as RNA sequencing (RNA-Seq), has strongly contributed to the demystification of this "non-coding" part of RNA. Besides the triumvirate of tRNA, rRNA, and mRNA genes, genomes harbor numerous loci that encode small non-canonical regulatory RNAs distributed in many classes. MicroRNAs (miRNAs) and tRNA-derived fragments (tRFs) are the two most abundant classes of small non-coding RNAs (ncRNAs) and share similarities in their mechanisms. Although often overshadowed by proteins, they are at the heart of post-transcriptional regulation and are emerging players in the host-pathogen relationship. This thesis addresses the host-pathogen relationship from the perspective of small ncRNAs through two complementary projects (#1 and #2) that aim to provide new insights and perspectives. In project #1, we worked with the Ebola RNA virus (EBOV), a pathogen known to cause a deadly hemorrhagic fever, which has been responsible for several epidemics in Africa and remains a global public health concern to this day. By combining RNA-Seq, quantitative PCR and computational analyses, we obtained the first detailed miRNA transcriptome (miRNome) of a human liver cell line infected with one of the three variant strains of EBOV including Mayinga, Makona and Reston. During EBOV infection, there is a differential expression of only 1/5 of the host miRNome over time with specific modulation of miR-122-5p, miR-148a-3p and miR-21-5p. The data obtained highlight, beyond the previously known clinical manifestations, substantial new differences between the strains with respect to their effect on the miRNome. In a second phase, using the same approach, we discovered, characterized and validated two viral miRNAs encoded by the EBOV genomes (Mayinga and Makona). These two viral miRNAs can potentially target genes involved in the hemorrhagic phenotype, the regulation of viral replication and the modulation of host immune defense. Project #2 was developed in a context where we had fortuitously discovered the existence of RNA species smaller than 16 nt (called here vsRNA for very small RNA) that were functional in eukaryotes but were often removed from sequencing datasets because they were considered as "degradation products". We have extended our RNA-Seq analysis to bacteria in order to characterize vsRNAs from Escherichia coli K-12 MG1655 and five other bacterial strains. The study is completed by the analysis of Outer Membrane Vesicles (OMVs) produced by E. coli K-12 MG1655 because of their critical roles in enhancing survival, regulating microbial interactions and promoting pathogenesis. The results show the existence of diverse and highly abundant vsRNAs with tRFs as a major biotype, especially those derived from isoleucine tRNA (Ile-tRF). As a proof of concept of the functionality of these tRF-like vsRNAs, we have studied in detail the highly abundant and thermodynamically stable Ile-tRF. Our analyses show that it is selectively modulated by environmental stress and can be transferred via OMVs (where it is particularly enriched) to human HCT116 cells where it promotes the expression of mRNAs encoding members of the MAP-kinase family. Our study is the first ever in E. coli to report the existence of abundant tRFs found in vesicles (OMVs) with potential functions in the host. Ile-tRF is also the first functional 13 nt tRF reported in bacteria.

Brevibacterium aurantiacum est l'un des principaux micro-organismes utilisés dans la production de fromages à croûte lavée dans le monde. L’utilisation de cette bactérie est dû à sa richesse métabolique, car elle produit des composés soufrés volatils, des pigments caroténoïdes et des enzymes lipolytiques et protéolytiques, qui sont nécessaires à la maturation d’une variété de fromages. Des souches de cette espèce bactérienne sont inoculées à la surface de fromages au cours de l'affinage et sont sensibles à des infections virales. Les bactériophages (phages), virus qui infectent les bactéries, sont omniprésents dans divers écosystèmes. Dans l'industrie laitière, ils sont reconnus pour perturber les procédés de production lors de l'infection de ferments lactiques, mais leur implication sur des fromages présentant des défauts de couleur et de saveur reste à démontrer. Ces anomalies de maturation de fromages à croûte lavée ont conduit à cette thèse. Le premier objectif de cette thèse de doctorat consistait à analyser le génome de la souche industrielle B. aurantiacum SMQ-1335 et qui est aussi sensible à des phages. Le deuxième objectif de la thèse visait à étudier les phages virulents infectant cette souche. D’ailleurs, cette étude rapporte la première description et caractérisation de phages infectant cette espèce bactérienne. Malgré la similitude entre ces phages, des répétitions en tandem d'ADN ont été identifiées dans des génomes viraux et une analyse approfondie a montré que ces segments d'ADN sont répandus parmi les phages. Le troisième objectif visait à étudier l'interaction phage-hôte via l’analyse du génome de souches mutantes insensibles aux phages. En étudiant ces souches mutantes, des gènes potentiellement nécessaires pour l'infection phagique ont été identifiés. Enfin, le quatrième et dernier objectif visait à évaluer l'impact des phages de B. aurantiacum dans la production de fromages à croûte lavée et ce, à l'aide des caillé modèles. À noter que le reclassement de la souche SMQ-1335, avant identifiée auparavant comme Brevibacterium linens, est décrit en annexe de cette thèse. Malgré des décennies d'études sur les phages laitiers, les phages de B. aurantiacum étaient encore inconnus. Mes travaux auront permis le développement d’un protocole reproductible pour isoler ces phages. Ces travaux ont également apporté de nouvelles connaissances sur les interactions phage-hôte et de leur impact dans les fromages affinés en surface. / Brevibacterium aurantiacum is one of the key players in the production of washed rind cheeses produced worldwide. The importance of this bacterium to the dairy industry is due to its metabolic richness, as it produces volatile sulfur compounds, carotenoid pigments, and lipolytic and proteolytic enzymes, which play roles in the maturation of washed rind cheeses .As strains of this species are regularly inoculated on the cheese surface during ripening, there is a significant risk of viral attacks. Bacteriophage (phages), viruses that infect bacteria, are ubiquitous in the cheese environment. In the dairy industry, virulent phages have long been known to disrupt cheese processes by infecting lactic acid bacteria. The recent observations of color and flavor defects in washed rind cheeses suggested that phages may also infect strains of B. aurantiacum. These observations led to this thesis.The first objective of this PhD dissertation was to study the genomics of B. aurantiacum SMQ-1335, an industrial strain used in the production of washed rind cheeses. The second objective of the thesis was to study the diversity and biology of virulent phages infecting this industrial strain. This study was the first report of phages infecting B. aurantiacum. Despite the low diversity of the isolated B. aurantiacum phages, DNA tandem repeats were found in an intragenic region of the viral genomes and extended analysis showed that these DNA segments are widespread among phages. The third objective was to investigate phage-host interactions through the genome analyses of bacteriophage insensitive mutants, which were selected by challenging SMQ-1335 with phage AGM1. Host genes likely necessary for phage infection were identified and may explain why some of these mutants are phage-resistant. Finally, the fourth objective of this thesis evaluated the impact of virulent phages on the production of washed rind cheeses using model curds. Of note, the reclassification of the strain SMQ-1335, long believed to be Brevibacterium linens, is described in the annex of the thesis. Despite decades of studies on dairy phages, B. aurantiacum phages were still unknown. Here, a reproducible protocol to isolate these phages was developed, which may allow the isolation of new phages. This work also led to increased knowledge on phage-host interactions as well as on and their roles in surface-ripened cheeses.

Les microARN (miARN) sont des acides ribonucléiques (ARN) endogènes, d’environ 19 à 24 nucléotides (nt), produits lors du clivage d’une structure d’ARN en forme de tige-boucle par la ribonucléase III (ARNase III) Dicer. Il a été rapporté que le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), en période de latence dans les lymphocytes T CD4+, produit un court transcrit d’ARN appelé « Trans-Activation Response element » (TAR) et que celui-ci est sujet au clivage par Dicer, ce qui génère deux miARN fonctionnels, soit miR-TAR-5p et miR-TAR-3p. Il a donc été suggéré que les miARN dérivés de TAR pourraient jouer un rôle dans la latence du VIH-1. L’objectif, au cours de ma maîtrise, était de déterminer le rôle potentiel de ces miARN dans la régulation de l’expression des gènes de l’hôte en utilisant les cellules en culture J-lat et Jurkat exprimant miR-TAR-5p et miR-TAR-3p de manière stable. Suite à cela, une analyse protéomique grande échelle iTRAQ a été effectuée pour tenter de faire la lumière sur le rôle potentiel des miARN dérivés de l’ARN TAR du VIH-1. En conclusion, il a été montré que la majorité des protéines d’intérêts sont réfractaires à une régulation génique par les miARN. Par contre, ceci ne supporte pas l’idée que ces miARN ne possèdent aucun rôle, d’où l’importance des résultats protéomiques qui ont montré que plusieurs protéines sont potentiellement régulées par les miARN viraux.

Le parvovirus H-1 (PVH-1) montre plusieurs propriétés anti-cancéreuses. Il se réplique préférentiellement dans les cellules transformées humaines (oncotropisme). Ceci peut mener à la destruction de ces cellules (oncolyse) et à la libération, dans le milieu extracellulaire, de particules virales néo-formées, pouvant à leur tour infecter et détruire les cellules transformées avoisinantes. Ces propriétés observées in vitro sont complétées par des données in vivo, qui montrent que le PVH-1 protège les animaux de laboratoire du développement tumoral (oncosuppression). Toutes ces caractéristiques font du PVH-1 une potentielle alternative thérapeutique aux traitements antimitotiques actuels. L'éventuelle utilisation du PVH-1 en clinique nécessite cependant une connaissance plus approfondie de son mode de fonctionnement. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux problèmes rencontrés avec les traitements actuels, afin de voir si le PVH-1 pouvait y apporter une réponse satisfaisante. La spécificité des molécules actuelles est relativement limitée, et celles-ci peuvent donc porter atteinte aux cellules saines de l'organisme. Dans une cellule humaine non transformée, le PVH-1 ne présente généralement pas d'effet délétère. En effet, le promoteur parvoviral P4 n'y est pas activé, et la protéine NS1, principal acteur de la toxicité induite par le PVH-1, n'est donc pas produite. Nous avons cependant cherché à savoir ce qu'il adviendrait si la protéine NS1 venait à être exprimée dans une cellule normalement insensible à l'infection parvovirale. Pour cela, nous avons utilisé un modèle permettant l'expression ectopique de NS1, contrôlée par un promoteur fort, constitutivement actif, dans un type particulier de cellules embryonnaires humaines, non immortalisées et présentant un phénotype normal, les cellules MRC-5. Nos travaux montrent que, dans ce modèle, l'expression massive de la protéine NS1 induit des modifications importantes du réseau d'actine du cytosquelette et la mort de ces cellules. L'utilisation d'une construction permettant l'expression d'une forme de NS1 mutée au niveau de son résidu de sérine en position 473 empêche à la fois les déformations du cytosquelette et la mort cellulaire. En revanche, alors que les cellules MRC-5 SV2, équivalents transformés des MRC-5, meurent sous l'effet de la surexpression des formes native et mutante de NS1, la mutation de la sérine 473 empêche l'induction de la déformation du cytosquelette. Un autre problème rencontré avec les thérapies oncologiques actuelles est la possibilité de résistance au traitement. De récents travaux démontrent que le PVH-1 peut être efficace contre des tumeurs résistantes à certains traitements classiques, notamment dans le cas de gliomes et de certains cancers du pancréas. Nous nous sommes intéressés à des cellules humaines de cancer du sein présentant un haut risque de formation de métastases, les cellules de la lignée SK-BR-7. Ces cellules montrent une résistance à l'apoptose, par l'intermédiaire d'un système autocrine inhibant l'induction de celle-ci. Nos travaux montrent que ces cellules sont sensibles à l'infection par le PVH-1, qui induit leur lyse. L'infection par le parvovirus H-1 n'induit pas l'expression de la caspase 3 comme le modèle autocrine initial aurait pu le laisser penser. En revanche, il ne nous a pas été possible de déterminer la nature exacte des voies de mort mises en oeuvre par le PVH-1. En effet, après avoir examiné les effets d'un composé non commercial, critique pour l'utilisation du modèle étudié, et dont l'activité inhibitrice du système s'est révélée défaillante, des délais prolongés dans la production de nouvelles doses de ce composé par nos collaborateurs nous ont empêché de formuler des conclusions certaines quant aux résultats obtenus pour ce projet.