Développé dans le contexte mondial de lutte aux souches microbiennes résistantes aux antibiotiques, ce projet de maîtrise a pour but d’isoler et de caractériser un opéron de synthèse d’une molécule naturelle potentiellement bioactive, un tétramate polycyclique macrolactame (PTM), provenant d’une souche de streptomycète peu caractérisée mais dont le génome a été récemment séquencé. L’objectif principal est de transférer l’opéron dans une souche spécialisée de Escherichia coli pour son expression et sa caractérisation. Nous avons observé que la souche d’intérêt, Streptomyces fulvissimus ATCC27431 / DSM40593, produisait effectivement une molécule capable d’inhiber la croissance d’une levure. Nous n’avons cependant pas été en mesure de réaliser l’isolation et le transfert hétérologue de l’opéron, malgré l’utilisation de trois approches différentes. La première approche consistait à obtenir directement les gènes de l’opéron via une amplification PCR à partir d’ADN génomique de S. fulvissimus. La seconde approche comportait l’assemblage de gènes synthétisés chimiquement pour reconstituer l’opéron sur deux plasmides. La dernière approche impliquait la création puis le criblage d’une librairie d’ADN génomique de S.fulvissimus basée sur le fosmide pCC1FOS dans l’hôte E. coli. Les résultats inattendus issus du séquençage de quelques fosmides ont justifié le séquençage complet de l’ADN génomique de la souche ATCC 27431 / DSM 40593. Les contigs obtenus montrent que notre souche diffère de la souche de S. fulvissimus dont le génome a été publié, ce qui suggère que le génome publié a été incorrectement associé à cette souche. Nos résultats montrent également que l’opéron de biosynthèse du PTM n’est pas présent, en tout ou en partie, dans ces contigs et que ces derniers ne s’alignent pas parfaitement avec l’ADN d’aucune souche connue de streptomycète, ce qui implique que nous avons séquencé, pour la première fois, l’ADN de cette souche de S. fulvissimus. L’analyse bio-informatique des contigs nous a permis de mettre en évidence chez cette bactérie des voies de biosynthèse de molécules naturelles potentiellement bioactives qui pourraient être d’intérêt pour des études futures. / In the context of the worldwide fight against drug-resistant microbes, this project aims to isolate and characterize a putative gene cluster for the synthesis of a bioactive molecule, a polycyclic tetramate macrolactam (PTM), from a poorly characterized but recently sequenced strain of Streptomyces1 . The main goal is to transfer the gene cluster in a specialised strain of Escherichia coli for its expression and characterization. We observed that the strain of interest, identified as Streptomyces fulvissimus DSM 40593 / ATCC 27431, indeed synthesized a molecule capable of inhibiting the growth of yeast. However, we have not been able to isolate or transfer the gene cluster even though we employed three different strategies. The first strategy involved PCR amplification of the gene cluster directly from S. fulvissimus’ genomic DNA. The second strategy involved the chemical synthesis and enzymatic assembly of the gene cluster on two plasmids. The final strategy involved the construction and screening of a S. fulvissimus genomic DNA library with the pCC1FOS fosmid in the E. coli host. DNA sequencing of a few fosmids generated unexpected results and justified the sequencing of the complete genome of Streptomyces fulvissimus ATCC 27431 / DSM 40593. The assembled DNA contigs differed from the sequence of the Streptomyces strain whose genome was previously published and suggest that the latter was probably mislabeled. Our contigs show that the PTM biosynthetic gene cluster is absent from our strain’s genome, and they do not align perfectly with the sequence of any published genome, which suggests that we sequenced the genome of the S. fulvimissus strain ATCC 27431 / DSM 40593 for the first time. Bioinformatics analysis allowed the detection of genes potentially involved in the biosynthesis of bioactive molecules that could be of interest in future studies.

Brevibacterium aurantiacum est une actinobactérie qui confère des propriétés organoleptiques clés aux fromages à croûte lavée lors de l’affinage. Malgré son importance industrielle, il n’existe aucun outil génétique disponible pour la modification génétique de cette espèce et seulement deux génomes complets sont disponibles à l’heure actuelle. L’acquisition de connaissances fondamentales sur le répertoire des gènes de cette espèce et sur leurs fonctions est primordiale pour comprendre son rôle dans l’affinage des fromages à croûte lavée. Lors de ce projet de maîtrise, 12 plasmides et quatre vecteurs synthétiques ont été utilisés pour transformer six souches laitières de B. aurantiacum et une souche de B. linens dans le but d’adapter l’outil génétique CRISPR-Cas9 pour ces actinobactéries. Différents protocoles de préparation de cellules électrocompétentes et de transformation par électroporation ont été testés, mais il a été impossible de transformer les souches bactériennes à l’étude. Les actinobactéries du genre Brevibacterium sont donc récalcitrantes à la transformation génétique Dans un second temps, nous avons séquencé six génomes additionnels de Brevibacterium et nous avons effectué des analyses génomiques comparatives avec les génomes publics. Nos analyses phylogénétiques ont révélé que les souches laitières précédemment considérées comme membres de l’espèce B. linens appartiennent en fait à l’espèce B. aurantiacum, mettant en évidence l’importance de cette espèce dans la production fromagère. Les génomes de B. aurantiacum sont composés de 2612 gènes de coeur et possèdent un pangénome ouvert atteignant jusqu’à 6259 gènes. Les génomes étudiés sont riches en éléments d’ADN mobiles et des transferts horizontaux de gènes (HGT) entre diverses actinobactéries d’affinage des fromages ont été observés chez tous les génomes de B. aurantiacum. Nos analyses génomiques comparatives apportent de nouvelles informations sur l’évolution et l’adaptation de B. aurantiacum à l’écosystème des fromages. / Brevibacterium aurantiacum is an orange-pigmented actinobacterium that confers key organoleptic properties to washed-rind cheeses during surface ripening. To date, only two complete and assembled genomes of B. aurantiacum are available and there is currently no genetic tool available to study this industrially relevant species. The acquisition of fundamental knowledge on the gene repertoire of this species and their functions is essential to understand its evolution and its role in cheese ripening In this study, 12 plasmids and 4 synthetic vectors were used to transform 6 B. aurantiacum dairy strains and one B. linens strain in the aim of adapting CRISPR-Cas9 tool for these bacterial species. Different electrocompetent cell preparation and electroporation methods were tested to transform various Brevibacterium strains, but no transformants were recovered with all the experiments. Therefore, it seems that Brevibacterium strains are recalcitrant to genetic transformation We sequenced six additional genomes of Brevibacterium and performed phylogenetic and pan-genome analyses. Our phylogenetic analysis revealed that cheese isolates, previously identified as B. linens, belong to the B. aurantiacum species, making this species a key player in cheese production. B. aurantiacum genomes are composed of 2612 core genes with an open pan-genome reaching now 6259 genes. Horizontal gene transfers (HGT) between cheese actinobacteria were observed in all B. aurantiacum genomes. HGT regions involved in iron acquisition were found in five B. aurantiacum genomes, which suggests cooperative evolution between smear-ripened cheese actinobacteria. Our comparative genomic analysis provides novel insights into the evolution and the adaptation of B. aurantiacum to the cheese ecosystem.

Brevibacterium aurantiacum est l'un des principaux micro-organismes utilisés dans la production de fromages à croûte lavée dans le monde. L’utilisation de cette bactérie est dû à sa richesse métabolique, car elle produit des composés soufrés volatils, des pigments caroténoïdes et des enzymes lipolytiques et protéolytiques, qui sont nécessaires à la maturation d’une variété de fromages. Des souches de cette espèce bactérienne sont inoculées à la surface de fromages au cours de l'affinage et sont sensibles à des infections virales. Les bactériophages (phages), virus qui infectent les bactéries, sont omniprésents dans divers écosystèmes. Dans l'industrie laitière, ils sont reconnus pour perturber les procédés de production lors de l'infection de ferments lactiques, mais leur implication sur des fromages présentant des défauts de couleur et de saveur reste à démontrer. Ces anomalies de maturation de fromages à croûte lavée ont conduit à cette thèse. Le premier objectif de cette thèse de doctorat consistait à analyser le génome de la souche industrielle B. aurantiacum SMQ-1335 et qui est aussi sensible à des phages. Le deuxième objectif de la thèse visait à étudier les phages virulents infectant cette souche. D’ailleurs, cette étude rapporte la première description et caractérisation de phages infectant cette espèce bactérienne. Malgré la similitude entre ces phages, des répétitions en tandem d'ADN ont été identifiées dans des génomes viraux et une analyse approfondie a montré que ces segments d'ADN sont répandus parmi les phages. Le troisième objectif visait à étudier l'interaction phage-hôte via l’analyse du génome de souches mutantes insensibles aux phages. En étudiant ces souches mutantes, des gènes potentiellement nécessaires pour l'infection phagique ont été identifiés. Enfin, le quatrième et dernier objectif visait à évaluer l'impact des phages de B. aurantiacum dans la production de fromages à croûte lavée et ce, à l'aide des caillé modèles. À noter que le reclassement de la souche SMQ-1335, avant identifiée auparavant comme Brevibacterium linens, est décrit en annexe de cette thèse. Malgré des décennies d'études sur les phages laitiers, les phages de B. aurantiacum étaient encore inconnus. Mes travaux auront permis le développement d’un protocole reproductible pour isoler ces phages. Ces travaux ont également apporté de nouvelles connaissances sur les interactions phage-hôte et de leur impact dans les fromages affinés en surface. / Brevibacterium aurantiacum is one of the key players in the production of washed rind cheeses produced worldwide. The importance of this bacterium to the dairy industry is due to its metabolic richness, as it produces volatile sulfur compounds, carotenoid pigments, and lipolytic and proteolytic enzymes, which play roles in the maturation of washed rind cheeses .As strains of this species are regularly inoculated on the cheese surface during ripening, there is a significant risk of viral attacks. Bacteriophage (phages), viruses that infect bacteria, are ubiquitous in the cheese environment. In the dairy industry, virulent phages have long been known to disrupt cheese processes by infecting lactic acid bacteria. The recent observations of color and flavor defects in washed rind cheeses suggested that phages may also infect strains of B. aurantiacum. These observations led to this thesis.The first objective of this PhD dissertation was to study the genomics of B. aurantiacum SMQ-1335, an industrial strain used in the production of washed rind cheeses. The second objective of the thesis was to study the diversity and biology of virulent phages infecting this industrial strain. This study was the first report of phages infecting B. aurantiacum. Despite the low diversity of the isolated B. aurantiacum phages, DNA tandem repeats were found in an intragenic region of the viral genomes and extended analysis showed that these DNA segments are widespread among phages. The third objective was to investigate phage-host interactions through the genome analyses of bacteriophage insensitive mutants, which were selected by challenging SMQ-1335 with phage AGM1. Host genes likely necessary for phage infection were identified and may explain why some of these mutants are phage-resistant. Finally, the fourth objective of this thesis evaluated the impact of virulent phages on the production of washed rind cheeses using model curds. Of note, the reclassification of the strain SMQ-1335, long believed to be Brevibacterium linens, is described in the annex of the thesis. Despite decades of studies on dairy phages, B. aurantiacum phages were still unknown. Here, a reproducible protocol to isolate these phages was developed, which may allow the isolation of new phages. This work also led to increased knowledge on phage-host interactions as well as on and their roles in surface-ripened cheeses.

Les génomes bactériens contiennent de nombreuses séquences répétées qui ont un rôle majeur dans la plasticité et l'évolution des génomes. Parmi elles, les séquences REP sont de courtes séquences d'ADN, trouvées en grand nombre dans des régions intergéniques de plusieurs espèces bactériennes. Ces séquences ont la particularité de présenter des structures en tige boucle précédées par un tétranucléotide conservé. Elles peuvent exister seules mais sont majoritairement groupées dans des clusters consécutifs appelés BIME. De nombreux rôles ont été attribués aux REP/BIME dans la physiologie de la cellule : elles sont notamment impliquées dans la régulation de l'expression des gènes et elles constituent des sites de fixation pour plusieurs protéines de l'hôte. Toutefois, leur origine et le mécanisme de leur dissémination dans les génomes ne sont pas connus. Récemment, un gène codant une protéine (TnpAREP) apparentée aux transposases de la famille des séquences d'insertions IS200/IS605 a été identifiée en association avec des REP/BIME au sein de structures appelées REPtron. Il a été alors proposé que les REP/BIME pourraient être des éléments transposables non-autonomes mobilisables par la protéine TnpAREP. Cette protéine fait partie de la superfamille des enzymes HuH comprenant des Relaxases, des protéines Rep des phages/plasmides à réplication en cercle roulant et certaines transposases. Elles utilisent le motif HuH (Histidine - résidu hydrophobe - Histidine) pour coordonner des cofacteurs métalliques ainsi que des résidus tyrosines pour leur activité catalytique. Comme pour les transposases HuH de la famille IS200/IS605, TnpAREP reconnait spécifiquement des substrats ADN simple brin. Elle est active in vitro sur des séquences structurées contenant des REP/BIME sous forme simple brin et celle-ci clive au niveau d'un dinucléotide spécifique. Des données cristallographiques suggèrent que TnpAREP serait monomérique, contrairement aux transposases d'IS200/IS605 qui sont des dimères obligatoires. Cela pose de nombreuses questions sur le site catalytique de l'enzyme ainsi que sur le mécanisme de prolifération des REP/BIME dans les génomes bactériens, d'autant plus qu'aucune activité de TnpAREP n'a été décrite in vivo. Mes premiers résultats portent sur la caractérisation du site catalytique de TnpAREP d'E. coli et ont permis d'exclure la possibilité d'un site catalytique hybride comme dans le cas des protéines Rep de certains plasmides. J'ai pu mettre en évidence une activité in vivo de TnpAREP : son expression sous contrôle d'un promoteur inductible à un effet toxique et induit la réponse SOS chez E. coli. J'ai également développé un test pour cartographier des sites de clivage de TnpAREP in vivo et montré que l'enzyme est capable de cliver les deux brins des plasmides et de l'ADN chromosomique. De plus, une excision d'un BIME a pu être observée dans ces conditions. J'ai aussi construit des souches bactériennes permettant d'étudier l'évolution expérimentale des REP/BIME in vivo dont les résultats sont en cours d'analyse. Enfin, nous avons élargi notre étude à un sous-groupe de TnpAREP associées à un autre type de REP/BIME. Cette analyse comparative nous a permis non seulement de généraliser des propriétés observées avec TnpAREP d'E. coli, mais aussi de révéler des caractéristiques spécifiques de ce sous-groupe. / In spite of their compact size, bacterial genomes carry many repetitive sequences, often important for genome function and evolution. Among them, REPs are short DNA found at high copy number in intergenic regions in many bacterial species. These sequences can form stem-loop structures preceded by a conserved tetranucleotide. They can exist as individual units but also as complex consecutive clusters called BIMEs. REP/BIMEs are known to interact with different proteins and several important roles have been attributed to these sequences in cell physiology. However, their origin and dissemination mechanisms are poorly understood. Recently, a first example of prokaryotic domesticated transposases (TnpAREP) was found associated with REP/BIME sequences in structure called REPtron. REP/BIMEs might represent a special type of non-autonomous transposable element mobilizable by TnpAREP. TnpAREP is member of the HuH enzymes superfamily including Relaxases, Rep proteins of RCR plasmids/ss phages and some transposases. These transposases are fundamentally different from classical transposases. They use HuH motif (Histidine-hydrophobe-Histidine) to coordinate metal cofactor and tyrosine residues (Y) as nucleophile for catalysis. TnpAREP shares certain similarities to Y1 HuH transposases encoded by the IS200/IS605 family which processes only ssDNA substrates. Analysis of E. coli TnpAREP activity in vitro also shown the strict requirement of structured single stranded REP/BIME DNA substrates. Cleavage in vitro occurs at a specific dinucleotide. In contrast to Y1 HuH transposases which are obligatory dimers, E. coli TnpAREP is a monomer as shown by structural studies. Furthermore, TnpAREP activities have never been described in vivo. This raises questions about its catalytic sites and also the way by which it promotes REP/BIME proliferation within their host genomes. The first objective of my PhD was to characterize the TnpAREP catalytic site. My results exclude the possibility of a second catalytic site as observed for REP protein of some plasmid families. Here I show that in vivo, expression of TnpAREP under control of an inducible external promoter is toxic to E. coli cells and induces SOS response, the effect depending on catalytic activity of the protein. I have developed an assay to map TnpAREP cleavage sites in vivo and show that it can cleave both DNA strands on plasmid and bacterial chromosome. In these conditions, an excision of BIME could be observed. I also constructed bacterial strains to perform REP/BIME experimental evolution, results are under analysis. Finally, we are extending our analysis to a subgroup of TnpAREP that are associated with another type of REP/BIME. This comparative analysis not only permitted to generalize some properties observed with E. coli TnpAREP but also revealed some interesting distinct characteristics of this subgroup.

La mucoviscidose est une maladie génétique autosomique causée par une mutation dans le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Mon travail s’est décomposé en deux parties principales : d’une part j’ai réalisé une revue de la littérature sur l’analyse des génomes bactériens isolés de patients mucoviscidosiques comparativement aux génomes des mêmes espèces isolées dans d’autrescontextes et d’autre part j’ai analysé les génomes de trois espèces bactériennes (Microbacterium yannicii, Chryseobacterium oranimense et Haemophilus parahaemolyticus). L’analyse exhaustive des génomes bactériens issus de patients atteints de mucoviscidose a révélé une extraordinaire évolution de ces génomes en fonction du temps et des traitements reçus par ces patients qui témoigne de la capacité qu’ont ces bactéries à s’adapter à leur écosystème notamment par l’acquisition de nouveaux gènes par transfert latéral de gènes. Ce travail montre l’extraordinaire plasticité des génomes bactériens dans un milieu donné et à ce titre le poumon de patients atteints de mucoviscidose représente un modèle unique pour comprendre l’évolution des génomes bactériens. De plus, notre travail a permis d’identifier leurs mécanismes moléculaires de résistance aux antibiotiques. Les travaux à venir sur l’étude des métagénomes de prélèvements chez ces patients pourrait permettre de répondre à ces questions dans le futur. La découverte de nouvelles espèces et / ou émergentes va nous permettre d’avoir une image plus complète de la mucoviscidose qui pourrait conduire à une meilleure connaissance de la maladie et donc à une meilleure prise en charge thérapeutique. / Cystic fibrosis is an autosomal genetic disorder caused by a mutation in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. Pulmonary infection is the major problem faced by patients with cystic fibrosis. My work is divided into two main parts: first I made a review of the literature on the analysis of bacterial genomes isolated from CF patients compared to the genomes of the same species isolated in autrescontextes and other part I analyzed the genomes of three species of bacteria (Microbacterium yannicii, Chryseobacterium oranimense and Haemophilus parahaemolyticus). The comprehensive analysis of bacterial genomes from cystic fibrosis patients revealed an extraordinary evolution of these genomes with time and treatment received by these patients reflects the ability of these bacteria to adapt to their particular ecosystem the acquisition of new genes by lateral gene transfer. This work shows the extraordinary plasticity of bacterial genomes in a given environment and as the lungs of patients with cystic fibrosis represents a unique model for understanding the evolution of bacterial genomes. In addition, our work has identified their molecular mechanisms of resistance to antibiotics. Future work on the study of metagenomes sampling in these patients could help to answer these questions in the future. The discovery of new species and / or emerging will allow us to have a more complete picture of cystic fibrosis which could lead to a better understanding of the disease and thus a better therapeutic management.

Les systèmes toxine-antitoxine sont divisés en trois classes suivant la nature et le mode d’action de l’antitoxine. Ils sont fortement représentés au sein du règne bactérien et se trouvent sur des éléments génétiques mobiles qu’ils stabilisent dans la population bactérienne, mais aussi sur les chromosomes bactériens où leur fonction n’a pas encore été établie avec certitude. Au cours de ce travail, nous avons étudié les systèmes toxine-antitoxine bactériens de classe II, qui sont généralement composés de deux gènes organisés en opéron. Le premier gène code pour une antitoxine qui antagonise l’activité de la toxine, le produit du second gène. L’antitoxine, en complexe avec la toxine, est également capable de réguler l’expression de l’opéron en se fixant au promoteur de l’opéron. Lors du commencement de cette étude, les systèmes toxine-antitoxine étaient divisés en 10 familles sur base des similarités de séquences partagées par les toxines. A chaque famille de toxine était associée une famille d’antitoxine. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont très répandus au sein des génomes bactériens. Ces opérons bicistroniques de petite taille ont été découverts sur des plasmides à bas nombre de copies. Dans ce contexte génétique, les systèmes TA confèrent un avantage sélectif à leurs molécules-hôtes en tuant les bactéries-filles qui ne les ont pas héritées par le mécanisme de tuerie post-ségrégationnelle (PSK, post-segregational killing). Ces systèmes génétiques sont également appelés modules d’addiction étant donné qu’ils rendent la descendance des bactéries qui les contiennent dépendantes de leur présence. Alors que leur rôle dans les molécules d’ADN épisomiques est relativement bien établi, le sens biologique de la présence d’homologues à ces systèmes épisomiques au sein des chromosomes bactériens est sujet à d’intenses débats. L’idée que les systèmes TA chromosomiques confèrent un avantage sélectif a été mise en évidence dans plusieurs modèles. Selon ces modèles, les systèmes TA permettent aux bactéries de mieux faire face à des conditions environnementales stressantes. <p>Entre-temps, la compréhension de l’évolution des génomes bactériens a connu des avancées significatives. L’impressionnante capacité d’adaptation des bactéries est aujourd’hui majoritairement attribuée au transfert horizontal de gènes (THG) provoqué par les éléments génétiques mobiles (phages, plasmides, transposons…). Dans le débat du rôle des systèmes TA chromosomiques, très peu d’attention a été accordée aux relations phylogénétiques et interactions entre systèmes plasmidiques et chromosomiques co-existant au sein d’un même hôte ainsi qu’à l’impact du THG sur leur évolution. Notre travail de thèse vise à mieux comprendre la biologie des systèmes TA en tenant compte de ces paramètres. Nous nous sommes intéressés à des systèmes homologues au système plasmidique ccdF. Nous avons étudié expérimentalement les 4 systèmes ccd (ccd1, ccd2, ccd3 et ccd4) qui co-habitent au sein du chromosome d’Erwinia chrysanthemi 3937 (une bactérie phytopathogène), leurs interactions intragénomiques et les interactions de ces systèmes avec le système plasmidique ccdF. Ce cadre expérimental a mené à la construction du modèle d’anti-addiction. Ce modèle propose que certains systèmes chromosomiques puissent conférer un avantage sélectif à leurs hôtes bactériens en interférant avec le PSK médié par leurs homologues plasmidiques. Cet avantage sélectif pourrait permettre la fixation de systèmes TA latéralement acquis au sein des populations bactériennes. Nous avons également recherché de nouveaux systèmes ccd au sein des génomes bactériens afin d’avoir un aperçu de leur distribution, des contextes génétiques dans lesquels ils existent et de l’implication du THG dans leur dispersion. Les réflexions qui ont accompagné notre recherche nous ont mené à proposer une synthèse sur le rôle des systèmes TA (plasmidiques et chromosomiques). Celle-ci se nourrit des avancées qui ont été effectuées, ces dernières années, dans la compréhension de l’évolution des génomes bactériens, de la théorie hiérarchique de la sélection naturelle et des processus non-adaptatifs et contingents qui pourraient expliquer la présence et la propagation des systèmes TA au sein des génomes bactériens sans que ceux-ci en soient les agents causaux. <p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxines (TA) sont abondants dans la majorité des génomes bactériens séquencés à ce jour. Ces systèmes codent une toxine stable qui inhibe soit la transcription, soit la traduction, et une antitoxine qui contrecarre l’effet de la toxine par formation d’un complexe avec celle-ci. L’antitoxine est instable suite à sa dégradation continue par les protéases ATP-dépendantes. Afin de maintenir un ratio antitoxine :toxine constant en condition normale de croissance, l’expression des systèmes TA est régulée négativement au niveau transcriptionnel par le complexe toxine-antitoxine.<p><p>Au début de notre travail, cinq systèmes TA étaient identifiés dans le chromosome d’E. coli. Il avait été montré par notre laboratoire que parmi ces systèmes, seul yefM-yoeB était activé en condition de surproduction de la protéase ATP-dépendante Lon. Ce résultat était surprenant puisque Lon était connue pour dégrader également l’antitoxine RelB du système chromosomique relBE. Un des objectifs de notre travail était de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette spécificité. Nous avons montré que l’antitoxine YefM était dégradée à la fois par Lon et les protéases ClpAP et ClpXP. Nous avons également montré qu’en condition de surproduction de Lon, YefM était fortement instable (t1/2~ 10 min. vs 60 min en condition normale). Cette instabilité accrue permet donc l’activation du système yefM-yoeB, c’est-à-dire la libération de la toxine YoeB du complexe qu’elle forme avec YefM. Nous avons également avons montré que le t1/2 de RelB n’était pas affecté par la surproduction de Lon, ce qui explique pourquoi le système relBE n’est pas activé dans ces conditions. Notre hypothèse était qu’un cofacteur soit nécessaire à la dégradation de RelB par Lon et que celui-ci serait limitant dans nos conditions expérimentales. Le crible génétique que nous avons réalisé n’a cependant pas permis d’identifier de cofacteur de dégradation ni de régulateur transcriptionnel en trans du système relBE. <p><p>Un deuxième volet de notre travail de thèse a consisté en l’étude de la fonction des systèmes TA chromosomiques. L’hypothèse prévalente au début de notre travail était que les systèmes TA soient intégrés dans les voies adaptatives de réponses au stress. Cependant, le résultat de leur activation était controversé. L’hypothèse du groupe de Gerdes était que leur activation mène à un état bactériostatique réversible alors que le groupe d’Engelberg-Kulka montrait que le système mazEF était un système de mort programmée. Afin d’éclaircir le rôle des cinq systèmes TA dans la physiologie d’E. coli, nous avons testé l’effet de nombreux stress sur la croissance et la viabilité de souches sauvages et de souches délétées de ces systèmes. Aucune des conditions que nous avons testées n’a entraîné une diminution de la viabilité excluant de manière définitive l’hypothèse de la mort programmée. De plus, l’inhibition de croissance causée par ces différents stress s’est avérée être indépendante des cinq systèmes, de même que la phase de récupération suivant les différents stress. Enfin, nos expériences de compétition ont clairement démontré que les cinq systèmes ne procuraient aucun avantage sélectif aux bactéries dans des conditions de compétition en carence nutritive. Les systèmes TA étudiés dans ce travail ne jouent donc aucun rôle dans l’adaptation aux stress que nous avons testé puisqu’ils n’améliorent ni l’aptitude (fitness), ni la compétitivité des bactéries dans ces conditions. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Mieux comprendre les mécanismes de la résistance aux antibiotique est un enjeu important dans la lutte contre les maladies infectieuses, qui fait face à la propagation de bactéries multi-résistantes. Les études d'association à l'échelle des génomes sont des outils puissants pour explorer les polymorphismes liés aux variations phénotypiques dans une population. Leur cadre méthodologique est très documenté pour les eucaryotes, mais leur application aux bactéries est très récente. Durant cette thèse, j'ai cherché à rendre ces outils mieux adaptés aux génomes plastiques des bactéries, principalement en travaillant sur la représentation des variations génétiques. En effet, parce que les bactéries ont la capacité à échanger du matériel génétique avec leur environnement, leurs génomes peuvent être trop différents au sein d'une espèce pour être alignés contre une référence. La description des variations par des fragments de séquence de longueur k, les k-mers, offre la flexibilité nécessaire mais ne permet pas une interprétation directe des résultats obtenus. La méthode mise au point teste l'association de ces k-mers avec le phénotype, et s'appuie sur un graphe de De Bruijn pour permettre la visualisation du contexte génomique des k-mers identifiés par le test, sous forme de graphes. Cette vue synthétique renseigne sur la nature de la séquence identifiée: il peut par exemple s'agir de polymorphisme local dans un gène ou de l'acquisition d'un gène dans un plasmide. Le type de variant représenté dans un graphe peut être prédit avec une bonne performance à partir de descripteurs du graphe, rendant plus opérationnelles les approches par k-mers pour l'étude des génomes bactériens / The emergence and spread of multi-drug resistance has become a major worldwide public health concern, calling for better understanding of the underlying resistance mechanisms. Genome-wide association studies are powerful tools to finely map the genetic polymorphism linked to the phenotypic variability observed in a population. However well documented for eukaryotic genome analysis, these studies were only recently applied to prokaryota.Through this PhD project, I searched how to better adapt these tools to the highly plastic bacterial genomes, mainly by working on the representation of the genetic variations in these genomes. Indeed, because the bacteria have the faculty to acquire genetic material by a means other than direct inheritance from a parent cell, their genomes can differ too much within a species to be aligned against a reference. A representation using sequence fragments of length k - the so-called k-mers - offers the required flexibility but generates redundancy and does not allow for a direct interpretation of the identified associations. The method we set up tests the association of these k-mers with the phenotype, and takes advantage of a De Bruijn graph (DBG) built over all genomes to remove the local redundancy of k-mers, and offer a visualisation of the genomic context of the k-mers identified by the test. This synthetic view as DBG subgraphs informs on the nature of the identified sequence: e.g. local polymorphism in a gene or gene acquired through a plasmid. The type of variant can be predicted correctly in 96% of the cases from descriptors of the subgraphs, providing a tractable framework for k-mer-based association studies

Les éléments génétiques mobiles contribuent grandement à la diversité et à l’évolution des génomes bactériens par le biais du transfert horizontal. Parmi eux, les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) codent leur propre excision, leur transfert par conjugaison et leur intégration. En revanche, les éléments intégratifs et mobilisables (IME) ne sont autonomes que pour leur excision et intégration et ne codent seulement que certaines des protéines/fonctions (oriT) dont ils ont besoin pour leur transfert conjugatif. Par conséquent, les IME ont besoin d’un élément conjugatif « helper » pour se transférer. Malgré leur impact sur le flux des gènes et l’évolution des génomes, la prévalence des ICE reste peu étudiée et seulement très peu d’IME avaient été identifiés au début de cette étude. De plus, bien que plusieurs méthodes de détection des ilots génomiques existent, aucune d’elles n’est dédiée aux ICE ou aux IME. Ce qui ne facilite pas l’analyse exhaustive de ces éléments. Le genre Streptococcus appartient au phylum des firmicutes. La quasi-totalité des streptocoques sont des bactéries commensales ou pathogènes de l’homme et d’autres animaux. Aussi, 2 espèces de streptocoques sont utilisées en tant que ferments lactiques lors la production de laits fermentés et divers fromages. Globalement, le genre streptocoques représente un groupe d’intérêt pour l’homme, l’étude du flux de gènes au sein de ces organismes et l’impact qu’il peut avoir sur leur mode vie est primordiale. Au cours de cette thèse, nous avons recherché les ICE et les IME dans 124 souches de streptocoques appartenant à 27 espèces en utilisant une base de données de référence comportant des protéines dites « signatures » d’IME et d’ICE (de leurs modules de conjugaison/mobilisation et d’integration/excision). Cette analyse exhaustive a permis l’identification et la délimitation de 131 ICE ou ICE légèrement dégénérés et 144 IME. Tous ces éléments ont été délimités, ce qui nous a permis de déterminer leur spécificité d’intégration dans les génomes. Au total, 17 spécificités d’intégration ont été identifiées pour les ICE dont 8 encore jamais décrites (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC) et 18 spécificités pour les IME dont seulement 5 étaient connues chez les firmicutes. Les modules d’intégration des ICE codent soit une intégrase à tyrosine pouvant avoir une faible spécificité (1 famille d’intégrase) ou une forte spécificité (13 spécificités différentes), soit des intégrases à sérine seule ou en triplet (4 spécificités différentes), soit une transposase à DDE. Les IME codent soit des intégrases à tyrosine (10 spécificités différentes) soit des intégrases à serine seule (8 spécificités différentes). Les ICE ont été groupés en 7 familles distinctes selon les protéines codées par leur module de conjugaison. Les IME présentaient une très forte diversité au sein de leur module de mobilisation, empêchant ainsi leur regroupement en famille selon les gènes portés par ce module. Les analyses phylogénétiques des protéines signature codées par tous les ICE et les IME ont montré des échanges de modules d’intégration entre les ICE et les IME et de nombreux échanges entre les modules de mobilisation des IME. L’ensemble de ces résultats révèle la forte prévalence et l’extrême diversité des ICE et des IME au sein des génomes de streptocoques. Une meilleure connaissance et compréhension de ces éléments nous a incité à construire un outil informatique semi-automatisé de détection des ICE et des IME de Streptocoques ainsi que leurs sites d’insertion / Mobile genetic elements largely contribute to the evolution and diversity of bacterial genomes through horizontal gene transfer. Among them, the integrative and conjugative elements (ICEs) encode their own excision, conjugative transfer and integration. On the other hand, integrative mobilizable elements (IMEs) are autonomous for excision and integration but encode only some of the proteins needed for their conjugative transfer. IMEs therefore need a “helper” conjugative element to transfer. Despite their impact on gene flow and genome dynamics, the prevalence of ICEs remains largely underscored and very few IMEs were identified at the beginning of this study. Furthermore, although several in silico methods exist to detect genomic islands, none are dedicated to ICEs or IMEs, thus complicating exhaustive examination of these mobile elements. The Streptococcus genus belongs to the firmicutes’ phylum. Almost all streptococci are commensal bacteria or pathogenes to men and animals. Two species of Streptococcus are also used in the dairy industry as lactic ferments in order to produce fermented milk and different types of cheese. Studying the gene flux of the Steptococci genus and the impact it can have on the lifestyle of these organisms is essential, as it has a lot of interest for human health and activities. In this work, we searched for ICEs and IMEs in 124 strains of streptococci belonging to 27 species using a reference database of ICE and IME signature proteins (from their conjugation, mobilization and integration/excision modules). This exhaustive analysis led to the identification and delimitation of 131 ICEs or slightly decayed ICEs and 144 IMEs. All these elements were delimited, which allowed us to identify their integration specificities in the genomes. In total, 17 ICE integration specificities were identified. Among them, 8 had never been described before (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC). 18 specificities were also identified for IMEs, among which only 5 were known for the firmicutes. ICEs encode high or low-specificity tyrosine integrases (13 different specificities), single serine intégrases (1 specificity), triplet of serine integrases (3 different specificities), or DDE transposases while IMEs encode either tyrosine integrases (10 different specificities) or single serine integrases (8 different specificities). ICE were grouped in 7 distinct families according to the proteins encoded by their conjugation module whereas the mobilization modules of IMEs were highly diverse, preventing them from grouping into families according to their mobilization modules. The phylogenetic analysis of the signature proteins encoded by all ICEs and IMEs showed integration module exchanges between ICEs and IMEs and several mobilization module exchanges between IMEs. The overall results reveal a strong prevalence and extreme diversity of these elements among Streptococci genomes. Better understanding and knowledge of ICEs and IMEs prompted us to build a semi-automated command-line tool to identify streptococcal ICEs and IMEs as well as to determine their insertion site