En thérapie génique, les virus adéno-associés (AAV) ont prouvé maintes fois qu’ils étaient capables de transférer un gène désiré dans différents types de tissus cibles. La plupart des humains possèdent déjà une pré-immunité existante contre les sérotypes humains d’AAV, ce qui se caractérise par une réponse robuste des anticorps contre la capside virale contenant le transgène avant qu’il n’atteigne sa cible thérapeutique. Dû à ce phénomène, les nouveaux AAV avec une faible séroprévalence sont hautement attractifs comme véhicules de transfert de gènes. Des études ont démontré que les AAV découverts, provenant du porc comme AAVpo1 ou AAVpo2, ne sont pas reconnus par la pré-immunité humaine. Ce mémoire décrit des objectifs primaires de recherche comme l’isolation de nouveaux sérotypes d’AAV provenant des fèces de porc, la production des nouveaux vecteurs viraux et la caractérisation de leur capacité de transduction in vitro. Les résultats ont démontré que les nouveaux vecteurs AAV porcins sont capables de transduire une bonne variété de cellules et de tissus. Aussi, des évidences d’échanges de génome du gène CAP entre 2 AAV ont été trouvées durant le processus de la recherche. Même si les nouveaux vecteurs AAV ont réussi à transduire des lignées cellulaires avec succès, des études plus poussées sur la bio distribution du vecteur chez les souris seront nécessaires pour vérifier la fiabilité de ces nouveaux vecteurs.

Ce travail s'inscrit dans un programme de recherche sur les mécanismes de régulation génique par les hormones glucocorticoïdes. Il rapporte la mise au point d'un système de transfert de gènes et d'analyse transcriptionnelle dans l'oocyte de Xenope, par la micro-injection de plasmides recombinants du gène viral de la thymidine kinase (TK), dont l'un porte une séquence du virus de la tumeur mammaire de souris contenant les sites de réponse aux hormones glucocorticoïdes. Le travail inclut la mise au point des conditions pratiques de micro-manipulation, l'évaluation de diverses méthodes de purification de l'ARN total d'oocyte pour l'analyse transcriptionnelle et la standardisation d'une technique simple de préparation des transcrits par séparation sur coussin de chlorure de cesium, et enfin l'analyse de l'activité transcriptionnelle TK des recombinants micro-injectés. La cartographie à la nucléase S_l montre que la transcription des plasmides modèles est correctement initiée dans le système oocyte. / Montréal Trigonix inc. 2018

Thèse présentée en cotutelle : Doctorat en Bioingénierie (Politecnico di Milano) et Doctorat en génie des matériaux et de la métallurgie (Université Laval) / Les stratégies de livraison de gènes non viraux ont suscité un intérêt manifeste pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ainsi que pour la recherche fondamentale et appliquée in vitro. Par rapport aux vecteurs viraux populaires, la classe des vecteurs non- viraux, comme les lipides (CLs) et les polymères (CPs) cationiques, capables de réagir spontanément avec des acides nucléiques (NAs) chargés négativement pour former des nanoparticules appelées complexes, connaît actuellement un regain d'intérêt au sein de la communauté scientifique. En effet, en plus d'être relativement sécuritaires, rentables, ils peuvent être facilement produits et fonctionnalisés, même à grande échelle. Cependant, leur efficacité est encore trop faible pour surpasser leurs homologues viraux. L'efficacité des vecteurs non viraux est un équilibre entre leur capacité à introduire des NAs dans les cellules, permettant ou inhibant ainsi leur expression, leur toxicité inhérente et leur capacité à délivrer des gènes aux cellules cibles. Ces dernières années, des efforts considérables en recherche ont donc été déployés pour développer de nouveaux moyens d'améliorer l'efficacité de cette classe de systèmes de livraison. Cette thèse de doctorat avait ainsi pour but de développer des stratégies innovantes pour améliorer l'efficacité des vecteurs non viraux. Dans ce contexte, nous avons considéré la problématique de la livraison sous deux perspectives différentes : d'une part, la modulation de la chimie du vecteur a été évaluée comme moyen de développer des transporteurs multifonctionnels avec une meilleure efficacité ; d'autre part, une stratégie de stimuler les interactions cellules-nanoparticules par modulation mécanique du comportement cellulaire sur la capacité de livraison de vecteurs non viraux a été étudiée. La première partie de cette thèse visait donc à mettre en évidence l'importance de la chimie de ces vecteurs, plus particulièrement ceux à base de lipides, sur la relation structure-fonction de ces matériaux et l'impact de la chimie du vecteur sur leur capacité ultime à livrer des gènes. Cette thèse a ensuite exploré de nouvelles façons d'améliorer les performances de la polyéthylèneimine (PEI), à savoir le vecteur polymère de référence, en configuration linéaire (lPEI) et ramifiée (bPEI). Tout d'abord, une étude approfondie de toutes les variables expérimentales qui peuvent influencer les performances des polyplexes à base de PEI, a été réalisée afin de déterminer les meilleures conditions de fonctionnement des vecteurs à base de PEI et d'améliorer la standardisation des protocoles de criblage in vitro. Ensuite, le focus a été fait sur le développement d'une approche vectorielle pour fonctionnaliser le bPEI avec des entités fonctionnelles ciblées afin d'améliorer la sélectivité du vecteur envers un type de cellule spécifique. Ainsi, il a été synthétisé une gamme de bPEI conjugués incorporant des peptides de ciblage pour délivrer sélectivement des gènes aux cellules musculaires lisses vasculaires (vSMCs). De plus, ces vecteurs de ciblage spécifique ont été incorporés dans une matrice afin de permettre leur libération locale et contrôlée pour des approches liées au domaine cardiovasculaire. Grâce à la conjugaison d'une séquence peptidique dérivée de l'élastine à la structure de la bPEI, l'efficacité du polymère sur les vSMCs a été améliorée tout en laissant les cellules non ciblées intactes. Ceci est particulièrement important pour la translation des approches non virales de livraison de gènes vers le in vivo. D'autre part, une nouvelle approche basée sur la régulation de la réponse cellulaire à l'administration de la nanoparticule a été élaborée. En effet, les cellules in vivo sont constamment exposées à différents facteurs environnementaux qui gouvernent certaines fonctions cellulaires essentielles. L'application d'un stimulus mécanique exogène en termes de sollicitation vibratoire sur des cellules en cours de transfection (processus de livraison de NAs par vecteurs non-viraux) a donc été évaluée avec des polyplexes à base de lPEI et bPEI. Étonnamment, l'efficacité des polyplexes à base d'lPEI a été grandement améliorée grâce à l'activation de certaines réponses cellulaires clés. Plus précisément, les stimulations mécaniques appliquées aux cellules ont amélioré l'internalisation des polyplexes en déclenchant l'activation de l'endocytose médiée par la clathrine (CME). Cette stratégie a mis en évidence l'importance des réponses cellulaires aux signaux exogènes sur l'internalisation et l'expression finales d'un gène d'intérêt et a ouvert la voie à une nouvelle façon de traiter la question de la livraison non virale. En conclusion, ce projet de doctorat a clairement mis en évidence la pertinence de ces approches chimiques et cellulaires comme moyens efficaces d'améliorer l'efficacité des vecteurs non viraux. En combinant les stratégies conçues dans le cadre de ce projet, il serait possible de franchir une autre étape en ce qui concerne la recherche sur l'administration de gènes non viraux. En effet, le développement d'approches multidisciplinaires tenant en compte à la fois du vecteur d'administration, de l'environnement dans lequel l'administration des gènes a lieu et de la réponse cellulaire, pourrait ouvrir la voie à des stratégies encore plus efficaces et accélérer le passage du laboratoire au patient pour cette catégorie de matériaux. / Non-viral gene delivery strategies have attracted significant interest in the development of novel therapeutic approaches as well as for basic and applied research in vitro. Compared to popular viral vectors, the class of non-viral carriers, namely cationic lipids (CLs) and polymers (CPs) able to spontaneously interact with negatively charged nucleic acids (NAs) to give nanoparticles called complexes, is now witnessing a surge of interest within the scientific community because they are relatively safe, cost-effective, and they can be easily produced and functionalized even at large scale. However, their efficiency in achieving the delivery tasks is still too low to outperform their viral counterparts. The efficacy of non-viral vectors is a tradeoff between their ability to drive NAs into cells, thus allowing/inhibiting their expression, their inherent toxicity, and their ability to deliver genes to target cells. Extensive research effort has thus been put into developing novel ways to improve the efficiency of such a class of delivery systems. In this context, my Ph.D. aimed at developing innovative strategies to improve non-viral vector effectiveness. To this purpose, we dealt with the delivery issue from two different perspectives: on one hand, the modulation of the vector chemistry was disclosed as a way to develop multifunctional carriers with improved effectiveness; on the other hand, we sought to improve cell-(nano)particles' interactions through the mechanical modulation of the cell behavior in response to the delivery of non-viral vectors. The first part of this thesis was thus aimed at highlighting the importance of vector chemistry on the structure-function relationship of such kinds of materials, with a focus on lipid-based carriers. Furthermore, I dealt with the characterization of a novel class of lipid-based vectors to investigate the interconnection between their structure and ultimate gene transfer ability. This thesis next explored novel ways to improve the performances of polyethyleneimine (PEI), namely the gold standard polymer vector, both in linear (lPEI) and branched (bPEI) topography. First, a thorough investigation of all the experimental variables affecting the performances of PEI-based polyplexes was carried out to disclose the best working conditions of PEI-based carriers and improve the standardization of in vitro screening protocols. Next, I focused on the development of a vector-based approach to functionalize bPEI with targeting moieties to improve the vector's selectivity towards a specific cell type. We thus synthesized a series of bPEI conjugates incorporating targeting peptides to selectively deliver genes to vascular smooth muscle cells (vSMCs). Moreover, the targeting vectors were incorporated into a polyplex releasing matrix to enable their local and controlled release for cardiovascular-related approaches. Through the conjugation of an elastin-derived peptide sequence to the bPEI structure, we were able to improve the polymer's effectiveness on target vSMCs while leaving off-target cells unaffected, a fact that is especially relevant for the translation of non-viral gene delivery approaches in vivo. On the other side, a novel strategy based on the regulation of cell response to the delivery of nanoparticles was devised. Indeed, cells in vivo are constantly subjected to different environmental cues that govern some key cell functions. We thus investigated the application of an exogenous mechanical stimulus in terms of vibrational loading to cells undergoing transfection (i.e., the delivery of NAs utilizing non-viral vectors) using lPEI and bPEI-based polyplexes. Interestingly, mechanical stimuli applied to cells improved polyplex internalization by triggering the activation of clathrin-mediated endocytosis (CME), thus leading to greater transfection outcomes. This strategy outlined the importance of cell responses to exogenous cues on the ultimate internalization and expression of a gene of interest and set the stage for a novel way to deal with the non-viral delivery issue. Overall, the big picture drawn by this Ph.D. project highlighted the suitability of chemical-based approaches and cell-based approaches as promising ways to improve non-viral vector effectiveness. Further improvement in non-viral gene delivery research might be achieved by combining the strategies devised in this project. The development of multidisciplinary approaches taking into account both the delivery vector, the environment in which the delivery of genes takes place, and the cell response may thus pave the way to ever more effective strategies, and expedite the translation from the bench to the bedside of these materials.

Des études récentes ont démontré que les activités des agents de contraste ultrasonoresous l’effet des ultrasons modulent transitoirement la perméabilité de la membraneplasmique des cellules. Ce procédé aussi appelé sonoporation est étudié pour incorporer desmolécules extracellulaires telles que des gènes thérapeutiques. Le but de la thèse fut d’étudierl’effet des paramètres acoustiques et expérimentaux pour une transfection efficace des cellulesin vitro et in vivo. Parallèlement, afin de clarifier le mécanisme de perméabilisation induit lorsde la sonoporation, nous avons, d’une part, étudié l’effet des ultrasons et des microbulles surla libération de molécules intracellulaires et d’autre part, observé en microscopie électroniqueles effets des ultrasons et des microbulles sur la membrane plasmique et sur l’incorporation denanoparticules d’or. / Future applications of ultrasound and microbubbles extend beyond imaging applications.Over the last few years, reports have shown that the activation of contrast microbubblesunder ultrasound waves, transiently modulates the cell membrane permeability. This process,named sonoporation has been studied to incorporate extracellular molecules such as therapeuticgenes. The aim of this work was to study the effect of various interrogation parameters toachieve an efficient cell transfection in vitro as well as in vivo. In parallel, and in order to clarifythe mechanism of permeabilization induced by sonoporation, we investigated the effect ofultrasound and microbubbles on release of intracellular molecules from fluorescent cells. Moreover,using electron microscopy, we examined the effect of the sonoporation process on thecell membrane and on incorporation of gold nanoparticles.

Le potentiel de la thérapie génique pour le traitement de maladies a engendré beaucoup d'espoirs et d'importants efforts ont été réalisés dans ce domaine de recherche. A l'heure actuelle, les vecteurs viraux sont les plus efficaces pour transférer des gènes thérapeutiques dans les cellules humaines. Alors que différents vecteurs viraux sont en développement, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus de la leucémie murine de Moloney (MLV) sont actuellement parmi les vecteurs les plus utilisés dans les essais cliniques. Le premier objectif de ce projet était d'étudier l'efficacité d'un nouveau vecteur d'encapsidation dérivé d'un autre retrovirus, le virus RDI 14. Nous avons démontré pour la première fois que des titres élevés pouvaient être obtenus avec des particules rétrovirales RDI 14. Ces vecteurs ont été aussi efficaces que les vecteurs MLV pour transduire des lymphocytes primaires et des cellules souches humaines CD34+. Par conséquent, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus RDI 14 sont efficaces pour le transfert de gènes et peuvent être une alternative aux vecteurs MLV. La production de vecteurs rétroviraux pour des applications cliniques est difficile, dispendieuse et peu sécuritaire, car les lignées cellulaires qui les produisent poussent de façon adhérentes et en présence de sérum bovin. Le second objectif était de générer des nouvelles lignées d'encapsidation capables de répondre à ces limitations. Dans cette étude, nous rapportons la construction des premières lignées d'encapsidation produisant des vecteurs rétroviraux en suspension et en milieu sans sérum (MSS). Des cellules 293HEK ont été dans un premier temps modifiées pour exprimer des niveaux élevés de protéines gag-pol. Les gènes codant pour les protéines d'enveloppes Ampho, GALV et RDI 14 ont été par la suite utilisés pour générer trois lignées d'encapsidations différentes (293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30). Les titres obtenus avec les clones 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 en suspension et en MSS étaient respectivement de 4 x IO7, IO6 et 5 x IO6 particules virales infectieuses par ml (PVI/mL). La caractérisation des ces lignées a été réalisée par l'étude des dynamiques de croissance cellulaire, de la stabilité de production, de la stabilité des particules virales et de la capacité de transduction. Les résultats ont montré que les lignées 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 ont un bon potentiel pour la production à grande échelle de vecteurs rétroviraux. Ces lignées d'encapsidations devraient améliorer l'efficacité des protocoles cliniques de thérapie génique de dernière phase qui font appel à un nombre élevé de patients.

La thérapie génique est envisagée pour le traitement de nombreuses maladies du <br />système nerveux. Le transfert de gène peut être utilisé pour compenser l'absence ou le <br />dysfonctionnement d'un gène déficient, coder une protéine thérapeutique, ou inhiber un <br />gène par ARN interférence. L'utilisation de vecteurs lentiviraux pour transférer un gène <br />thérapeutique, est une approche prometteuse pour de futures applications thérapeutiques. <br />Cependant, pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs, il est nécessaire de contrôler <br />l'expression des gènes thérapeutiques. Ceci permettra d'adapter le traitement aux besoins <br />du patient ou de l'arrêter en cas de complications graves. Dans ce contexte, mon travail a <br />porté sur la mise au point de systèmes de régulation de l'expression de gènes thérapeutiques <br />inductibles par la tétracycline (Tet-on) au sein d'un seul vecteur lentiviral. <br /><br />Dans une première approche, le système Tet-on a été incorporé au sein d'un vecteur <br />lentiviral unique. Des vecteurs codant la luciférase et la tyrosine hydroxylase (TH) ont été <br />produits et caractérisés in vitro et in vivo. Ces vecteurs ont permis d'exprimer de façon <br />régulée les transgènes avec une expression induite d'un facteur 100 en présence de <br />doxycycline. Le vecteur TH inductible a été par la suite validé dans un modèle de rat de la <br />maladie de Parkinson pour démontrer son efficacité et la possibilité de réguler un gène <br />thérapeutique in vivo. <br /><br />Le deuxième volet de mon travail a porté sur le développement d'un système <br />inductible d'expression des shARN utilisant un nouveau transactivateur dépendant de la <br />doxycycline capable d'induire la transcription de shARN à partir d'un promoteur d'ARN <br />polymérase III minimal. Après intégration dans un vecteur lentiviral, ce système a permis <br />de contrôler efficacement et de manière réversible l'expression de la GFP et de la protéine <br />p53 in vitro. En présence de doxycycline, une extinction de 90 % de l'expression des deux <br />gènes cibles a été obtenue. Cette expression a été réinduite après retrait de la doxycycline. <br />L'efficacité de ce système est dépendante de la dose et du temps de traitement avec la <br />doxycycline. <br /><br />L'intégration de systèmes de régulations efficaces au sein d'un vecteur lentiviral <br />unique constitue une étape cruciale pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en <br />thérapeutique humaine.

Les mitochondries sont les organites qui produisent la quasi-totalité de l'énergie consommée par les cellules animales. Une de leurs particularités est de posséder leur propre génome (ADN mitochondrial ou ADNmt) qui, avec la collaboration indispensable du génome du noyau (ADNnu), code pour les enzymes responsables de la production d'énergie. Pour que ces organites fonctionnent adéquatement, la co-adaptation des génomes nucléaire et mitochondrial a donc été fortement sélectionnée au cours de l'évolution. Chez les animaux, l'ADNmt est, contrairement à l'ADNnu, transmis uniquement par la mère. L'hypothèse principale pour expliquer cette transmission maternelle est qu'en ayant un seul type d'ADNmt, la cellule évite un conflit génomique dans l'association intime entre les protéines codées par l'ADNnu et l'ADNmt. Autrement dit, la sélection naturelle doit nécessairement prévenir toute modification du dialogue entre les mitochondries et le noyau, ce qui risquerait de provoquer l'apparition de phénotypes indésirables. Exceptionnellement, un seul système mitochondrial «défie» les lois naturelles de transmission des mitochondries chez les animaux, soit celui observé chez les moules marines et d'eau douce. Les espèces possédant ce système atypique, qui est désigné sous le nom de double transmission uniparentale (doubly uniparental inheritance ou DUI), sont caractérisées par la présence de 2 ADNmt distincts qui sont hérités de façon maternelle (ADNmt F) ou paternelle (ADNmt M). Généralement, les femelles ne contiennent que le génome F, tandis que les mâles contiennent le génome F dans leurs tissus somatiques et le génome M dans leur gonade. Les divergences observées entre les ADNmt F et M chez les moules peuvent atteindre plus de 20%. Les produits des deux différents ADN mitochondriaux peuvent-ils interagir normalement avec les protéines d'un seul système génétique nucléaire (en raison de la co-adaptation intergénomique), ou certaines fonctions mitochondriales ont-elles été compromises dans une ou l'autre des lignées (c'est-à-dire, lignée paternelle M ou maternelle F)? Le grand attrait du système de double transmission uniparentale est qu'il est le seul modèle animal où deux variantes mitochondriales fortement divergentes coexistent et s'adaptent simultanément à un génome nucléaire. Cette situation se traduit probablement par la conservation d'une intégrité relative de certaines portions du génome mitochondrial afin de maintenir une cohésion fonctionnelle dans les interactions structurales entre les peptides mitochondriaux et nucléaires. L'objectif principal de mon doctorat était d'étudier l'évolution moléculaire des génomes mitochondriaux F et M chez les espèces du genre Mytilus et de vérifier si les gènes nucléaires et les gènes F et M mitochondriaux qui interagissent pour former le système de la phosphorylation oxydative co-évoluent. Spécifiquement, l'objectif premier du chapitre 1 a été d'analyser les ADNmt M et F complets chez trois espèces de moules marines (Mytilus edulis, M trossulus, et M galloprovincialis) afin de vérifier si leur évolution dans un environnement nucléaire commun (ou différent) se traduit par la conservation (ou non) de certaines de leurs portions (c'est-à-dire, évolution congruente des génomes M et F). Pour ce faire, les ADNmt ont été amplifiés par PCR et séquencés à l'aide d'un séquenceur d'ADN automatique. Les principaux résultats ont effectivement démontré que le fait de co-exister dans un même environnement nucléaire contraint les ADNmt F et M à expérimenter des pressions sélectives similaires, ce qui se traduit par une évolution congruente des différentes portions des ADNmt M et F (c'est-à-dire la corrélation positive des patrons de taux de substitution protéiniques). L'objectif du chapitre 2 a été de déterminer, chez les spermatozoïdes, si le remplacement d'un génome M par un génome F avait un effet sur les capacités métaboliques des mitochondries. L'étude visait à déterminer si la co-évolution du génome nucléaire avec deux types d'ADNmt différents avait été favorisée dans une où l'autre des lignées. Pour ce faire, des dosages enzymatiques (activité des complexes mitochondriaux I+Ill, II et IV et de la citrate synthase) ont été réalisés par spectrophotométrie. Les résultats ont démontré que la combinaison «ADNmt récemment-masculinisé -ADNnu» (qui est essentiellement une combinaison ADNmtF -ADNnu) performe mieux au niveau enzymatique que la combinaison «ADNmt M -ADNnu». Le troisième volet a été consacré à l'étude de l'évolution moléculaire des protéines interactives du système énergétique (c'est-à-dire, produits nucléaires et mitochondriaux en contact physique) afin de vérifier si les portions génétiques qui interagissent co-évoluent. Pour ce faire, le gène nucléaire codant pour le transporteur mobile d'électron cytochrome c (CYC) et des gènes mitochondriaux et nucléaires codant pour des sous-unités protéiques des complexes III (ADNmt = CYTB; ADNnu = C3S6) et IV (ADNmt = COX1 et COX2; ADNnu = COX4) du système de la phosphorylation oxydative ont été amplifiés par PCR et séquencés à l'aide d'un séquenceur d'ADN automatique. Les données moléculaires semblent démontrer que la co-évolution entre le génome F et le génome nucléaire est mieux couplée, ce qui vient appuyer les résultats enzymatiques du chapitre 2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ADN mitochondrial, Génomique comparative, ADN nucléaire, Mytilus, Co-évolution intergénomique.

Le transfert de gènes consiste en l’introduction d’acides nucléiques au sein de cellules afin de modifier leur activité dans un but essentiellement thérapeutique. Pour préserver le matériel génétique de toute dégradation, il faut recourir à des vecteurs. Parmi ceux-ci, les polymères cationiques sont très prometteurs, en particulier, la polyéthylènimine, considérée comme le vecteur non-viral de référence. Néanmoins, il présente une cytotoxicité élevée. Ainsi, de nombreuses recherches ont pour but d’identifier et de développer de nouveaux polymères combinant efficacité de transfection et haute viabilité cellulaire. Cette thèse vise le développement de méthodes d’ingénierie macromoléculaire donnant accès à une large gamme de dérivés à base de polyvinylamine et l’évaluation de leurs performances en tant que vecteurs de transfection. Différentes techniques de polymérisation radicalaire conventionnelle et contrôlée ont été mises au point afin de synthétiser des (co)polymères à base de polyvinylamine constitués d’amines primaires et secondaires. L’efficacité du transfert d’ADN plasmidique et la viabilité cellulaire ont été évaluées sur des cellules HeLa. L’influence de différents paramètres macromoléculaires sur les performances de transfection a été investiguée. Cette étude a permis de démontrer que certains dérivés de polyvinylamine possédaient une efficacité de transfection aussi élevée que la PEI tout en étant moins toxique. De manière générale, ce travail rend compte du haut potentiel des (co)polyvinylamines en tant que vecteurs pour le transfert de gènes. / Gene transfection consists in the introduction of genetic materials (DNA or RNA) in cells in order to modulate the cell activity, with therapeutic purposes in most cases. To deliver the genetic materials into cells without degradation, vectors are necessary. Among them, cationic polymers are promising candidates. For instance, polyethylenimine has emerged as a gold standard due to its high transfection ability. Nevertheless, this polymer exhibits high cytotoxicity, and current research aims at identifying and developing new polymers with improved cell viability and high gene transfer efficiency. In this context, the aim of this thesis was to develop efficient macromolecular engineering tools to prepare a library of polyvinylamine-containing (co)polymers and to evaluate their performances as DNA carriers. Consequently, free radical polymerization (FRP) and controlled radical polymerization (CRP) have been explored and a series of (co)polyvinylamines, containing primary and secondary amines, as well as vinylimidazole and guanidine moieties, have been synthesized. The transfection efficiency of plasmid DNA (pDNA) and cell viability were evaluated on HeLa cells. The influence of different macromolecular parameters such as molar mass, molar mass distribution and composition, was also studied. The most promising polymers for pDNA transfection were also tested for siRNA delivery and on other cell lines. Overall, several polymers were competitive with PEI regarding the transfection efficiency but were much less toxic. (Co)polyvinylamines, which have often been disregarded for transfection purposes, should definitely be considered as valuable gene carriers.

La mucoviscidose est une maladie monogénique, caractérisée par des mutations survenant au niveau du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Le clonage en 1989 du gène CFTR a permis d’envisager de traiter cette maladie par thérapie génique. Cela consiste à transférer à l’aide d’un vecteur, une version normale du gène CFTR dans les cellules atteintes des patients. En raison de la gravité des complications pulmonaires, c’est l’épithélium respiratoire qui constitue aujourd’hui le tissu cible pour le transfert de gènes. Le principe de la thérapie génique est évidemment très séduisant et un certain nombre d’essais cliniques ont d’ores et déjà été réalisés. La thérapie génique nécessite des outils de vectorisation efficaces et compatibles avec une utilisation répétée en clinique.Mon sujet de thèse a porté donc sur le développement, la biodistribution et l’optimisation de vecteurs synthétiques (lipides cationiques) pour le transfert de gènes dans l’épithélium respiratoire. Au cours de mes travaux, nous avons donc pu mettre au point des lipophosphoramidates KLN47 fluorescents utiles pour les études de biodistribution in vivo. Comparés au KLN47 non fluorescent, ces nouveaux composés présentent les mêmes propriétés physicochimiques, à savoir une taille relativement petite et un potentiel zêta positif. Sur lignées cellulaires, nous avons montré que les nouvelles formulations étaient aussi efficaces que le KLN47, et pas ou peu toxiques. Ensuite, sur modèle animal, les profils de biodistribution de lipoplexes pégylés et non-pégylés ont été comparés après injection systémique. Les profils de biodistribution des lipoplexes pégylés et non-pégylés étaient similaires, cependant, la pégylation des complexes a conduit à une circulation prolongée dans la circulation sanguine, alors que l’expression du transgène (luciférase) était équivalente dans les deux cas. De plus, l’activité luciférase était similaire à celle obtenue avec le KLN47 non fluorescent. Nous avons ainsi démontré que l’ajout des sondes lipidiques fluorescentes dans la solution liposomale du KLN47, ne modifie pas ses propriétés physicochimiques et transfectantes. L’ensemble des résultats montre que nous disposons d’outils prometteurs pour les études de biodistribution in vivo. D’autres molécules ont également été testées avec succès. / Cystic fibrosis is a monogenic disease characterized by mutations occurring at the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. The clonining in 1989 of the CFTR gene has enabled to consider treating this disease by gene therapy. This consists of transferring a normal version of the CFTR gene in the affected patients’ cells, using a vector. Due to the severity of pulmonary complications, it is obvious that the respiratory epithelium constitutes the target tissue for the gene transfer. The principle of gene therapy is indeed very attractive and a number of clinical trials have already been made. Gene therapy requires vectorization tools that are efficient and compatible with repeated clinical use.My thesis has focused on the development, biodistribution and optimization of synthetic vectors (cationic lipids) for gene transfer in the respiratory epithelium. During my work, we were able to develop useful fluorescent KLN47 lipophosphoramidates for in vivo biodistribution studies. Compared to non fluorescent KLN47, these new compounds exhibit the same physicochemical properties: a relatively small size and a positive zeta potential. On cell lines, we found that the new formulations were as effective as the KLN47, with little or no toxicity. Then, in animal models, the biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were compared after systemic injection. The biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were similar. However, the pegylation of the complex resulted in prolonged circulation in the bloodstream, whereas transgene expression (luciferase) was equivalent in both cases. In addition, luciferase activity was similar to that obtained with the non-fluorescent KLN47. We have demonstrated that the addition of fluorescent lipid probes in the liposomal solution KLN47, does not change its physicochemical and transfectant properties. The overall results show that we have promising tools for in vivo biodistribution studies. Other molecules have also been tested successfully.

L'efficacité du transfert de gènes non viral est limitée par les barrières physiologiques qui entravent le cheminement de l'ADN jusqu'au noyau des cellules cibles. <br />Ce travail a permis de concevoir et d'étudier trois outils visant à améliorer cette efficacité. <br />Un premier volet concerne le ciblage du noyau cellulaire. Une banque de plasmides comportant une séquence aléatoire a été construite dans le but d'identifier une séquence nucléotidique permettant l'interaction du plasmide avec une protéine karyophile qui pourrait l'escorter jusqu'au noyau cellulaire. Le caractère aléatoire de la banque a été validé mais les séquences recherchées n'ont pas pu être identifiées grâce aux tests que nous avons employés.<br />Le peptide de localisation nucléaire IBB de l'importine a été couplé de façon covalente au squelette d'un plasmide dans le but de promouvoir la fixation du plasmide aux protéines récepteurs d'import nucléaire. La spécificité de l'interaction entre ce plasmide-IBB et les récepteurs cellulaires n'a pas pu être démontrée, les tests employés n'ont pas permis de mettre en évidence un import nucléaire accru de ces plasmides. En revanche le peptide IBB compacte l'ADN, améliorant la lipofection par modification des caractéristiques physico-chimiques du lipoplexe.<br />Le deuxième volet de ce travail concerne le ciblage extracellulaire, envisagé dans le système modèle du récepteur aux asialoglycoprotéines des hépatocytes. Des liposomes cationiques à têtes de ciblage galactosylées ont permis de définir les caractéristiques structurales et physico-chimiques les plus favorables pour l'accessibilité de la tête de ciblage. L'intégration d'un espaceur polyéthylèneglycol au lipide galactosylé a permis de limiter l'internalisation non spécifique des lipoplexes dans les cellules non visées, nous n'avons pas observé de ciblage des hépatocytes.