Le sujet de cette thèse concerne l'élaboration de vecteurs fonctionnels de transfert de gènes destinés à la thérapie génique de tumeurs.<br />Deux familles de vecteurs synthétiques fonctionnels ont été synthétisées afin d'améliorer d'une part la biodisponibilité des vecteurs dans les applications in vivo et d'autre part leur spécificité de ciblage des tissus tumoraux. <br />La première famille de composés est constituée de télomères et de cotélomères « furtifs » issus des réactions de (co)télomérisation. Le design des télomères est basé sur un squelette « diblock » composé d'une partie polyaminée de degré de télomérisation aléatoire et d'une partie hydrophile (polyéthylène glycol). Le design des cotélomères est basé sur un squelette aléatoire de motifs aminés et de structures hydrophiles (tétraéthylène glycol et trishydroxyméthyl). La deuxième famille de vecteurs synthétiques est issue de la synthèse de lipides et polymères cationiques conjugués à un ligand dérivé de l'antagoniste des récepteurs à chimiokines CXCR-4, l'AMD3100 ou bicyclame.<br />Le potentiel des (co)télomères « furtifs » en tant qu'agents de condensation et de transfert de gènes a été évalué in vitro sur des cellules de carcinome pulmonaire humain A549.<br />Le potentiel des conjugués ciblés lipidiques et polymériques à compacter l'ADN et à transfecter de manière spécifique des cellules par la voie récepteur médiée a été évalué à la fois sur des cellules n'exprimant pas le récepteur CXCR-4 (A549, T98G) et sur des cellules l'exprimant (Jurkat).<br />Certains des (co)télomères « furtifs » testés (PEG2000-[NH2]n) ont démontré des efficacités de transfection comparables à des formulations lipidiques de référence (pcTG90/DOPE) tout en étant moins toxiques. Parmi les conjugués ciblés, le cotélomère iBu-[NH]80-[AMD]4 s'est révélé être un agent de transfert de gènes spécifique sur les cellules Jurkat sous certaines conditions de formulations, par rapport aux lipides et polymères conventionnels.<br />Mots clés : thérapie génique, transfert de gènes, lipoplexes, polyplexes, polyéthylène glycol, biodisponibilité, AMD-3100, ciblage, transfection.<br />Discipline : Chimie.

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n'ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d'Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l'enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d'une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l'ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d'ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L'un d'eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d'adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l'apparition des virus.En plus d'être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces " thermococcines " nécessitent d'être caractérisées, il s'agit de la première mise en évidence d'une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales.

La mucoviscidose est une maladie génétique grave et évolutive dont les atteintes pulmonaires sont, aujourd’hui, les causes principales de décès des patients. Du fait de l’absence ou du dysfonctionnement du canal chlore CFTR, les patients atteints de mucoviscidose présentent un mucus hypervisqueux notamment au niveau des voies respiratoires. Ce mucus est un environnement favorable à la colonisation par des bactéries opportunistes telles que le Staphylococcus aureus ou le Pseudomonas aeruginosa. La chronicité des infections couplées avec une inflammation importante conduisent à la dégradation progressive des fonctions respiratoires. Actuellement, hormis la greffe coeur/poumon, aucun traitement curatif n’est encore accessible pour l’ensemble des patients. L’approche par thérapie génique apparait être une bonne stratégie pour tenter de guérir tous les patients indépendamment du type de mutations dont ils sont porteurs. Il s’agit d’apporter une copie saine du gène CFTR à l’intérieur des cellules afin que celles-ci expriment une protéine fonctionnelle. Pour ce faire, de nombreuses barrières sont à franchir. Parmi elles, la présence de bactéries dans l’environnement cellulaire est un frein s’opposant au transfert de gènes notamment par vecteurs. Il semble pertinent de développer une formulation multifonctionnelle permettant d’une part d’éliminer les bactéries en surface et d’autre part, de transfecter les cellules cibles. Cette formulation doit rester efficace après qu’elle ait été aérosolisée. Au cours de ce travail, plusieurs formulations, incorporant des lipides cationiques et des composés argent, ont été mises au point. / Cystic fibrosis is a genetic disease with lung damages as the current main causes of death. Due to the absence or dysfunction of the CFTR chloride channel, CF patients have hyper-viscous mucus, particularly in the respiratory tract. This mucus is an environment favorable to infection development by opportunistic bacteria such as Staphylococcus aureus or Pseudomonas aeruginosa. The chronicity of infections coupled with significant inflammation leads to the progressive degradation of respiratory functions. Currently, apart from the heart-lung transplantation, no cure is still available for all patients.The approach by gene therapy appears to be a good strategy to cure all patients regardless of the type of mutations they have. It is a matter of bringing a healthy copy of the CFTR gene into the cells so that they express a functional protein. To do this, many barriers must be overcome. Among them, the presence of bacteria in the cellular environment is a brake against the transfer of genes in particular by vectors. It seems pertinent to develop a multifunctional formulation that on the one hand eliminates surface bacteria and on the other hand transfect the target cells. This formulation must remain effective after it has been aerosolized. During this work, several formulations, incorporating cationic lipids and silver compounds, have been developed.

La compréhension de l'évolution des génomes est un des enjeux clé de la biologie actuelle. Nous avons rédigé une revue littéraire consacrée à la contribution de la génomique dans la compréhension de la diversité, de l'évolution et des phénotypes d'un super-phylum bactérien, le super-phylum PVC (Planctomycetes, Verrucomicrobiae et Chlamydiae). Ces bactéries proviennent d'environnements variés et présentent des caractéristiques phénotypiques intéressantes. Les analyses génomiques ont révélé la grande diversité de ces espèces, mais ont aussi permis de reconstruire l'évolution de leurs génomes et d'expliquer l'apparition de certains phénotypes particuliers. Une partie de notre travail était consacré à l'étude de l'évolution et de l'impact de la présence d'un plan cellulaire particulier chez les bactéries PVC. Ce plan cellulaire est sujet a différentes interprétations et induirait la compartimentation des cellules en deux régions distinctes. Les résultats obtenus semblent indiquer que cette caractéristique n'induit pas une protection des génomes bactériens vis à vis des transferts de gènes horizontaux, comme on pourrait le supposer. En revanche les observations microscopiques réalisées sur deux espèces ont permis de mieux appréhender l'évolution de ce plan cellulaire. Nous avons, de plus, détecté une contribution de l'environnement concernant la sélection des gènes transférés. Il semblerait que les gènes transférés soient en effet sélectionnés selon leurs fonctions par les différents environnements.Nos travaux ont donc permis d'améliorer la compréhension des relations entre l'évolution, les phénotypes et l'environnement, en particulier chez les bactéries du super-phylum PVC. / The comprehension of genomes evolution is a key issue of modern biology.We wrote a review dedicated to the genomic contribution in comprehension of diversity, evolution and phenotypes, in a bacterial super-phylum named PVC (for Planctomycetes, Verrucomicrobiae and Chlamydiae). These bacteria are distributed in varied environments and present specific phenotypic characteristics. Genomic analyzes revealed the important diversity of these species and allow also to reconstruct the genomes evolution and, in some cases, to explain the presence of specific phenotypes. One part of our work was dedicated to the study of evolution and impact of one of this phenotype, the special cell plan detected in PVC bacteria. This original cell plan is subject to different interpretations and induces the compartmentalization of cells in two different regions, whom one containing the nucleoid. Our results indicate that this feature has probably no role in the protection of bacterial genomes against horizontal genes transfers, so, its function is still unknown. Microscopic observations of two species from PVC super-phylum permit to better understand the evolution of the special cell plan. The environment seems to contribute in the genomes evolution, by selection of genes transferred. Genes transferred are probably selected according to their functions by the different environments.Our works allowed to improve the knowledge about relations between evolution, genomes, phenotypes and environment, especially in bacteria from PVC super-phylum.

A ce jour, un certain nombre d'adénomes hypophysaires somatotropes échappent encore au contrôle de la maladie. Il reste nécessaire d'étudier plus finement les différentes voies de contrôle de la sécrétion hormonale et de la prolifération tumorale afin d'identifier des traitements alternatifs susceptibles de contrôler ces symptômes tumoraux. De même, un certain nombre de patients porteurs de prolactinomes (environ 10%), à l'origine de dysfonctionnement gonadique et sexuels, échappent au contrôle de l'hypersécrétion de prolactine par les traitements actuels. Pour ces deux types de tumeurs, s'ajoutent des complications neurologiques consécutives à l'accroissement des volumes tumoraux. Dans une perspective de contrôle de l'hypersécrétion tumorale nous nous sommes intéressés à deux stratégies faisant intervenir un transfert de gènes dans les cellules. POU1F1 est un facteur de transcription crucial pour le développement et le maintien des lignages somatotrope, lactotrope et thyréotrope et son expression est retrouvée dans les adénomes hypophysaires. De plus, des mutations de ce gène, notamment le mutant dominant négatif R271W, ont été identifiés chez des patients présentant des déficits hypophysaires combinés en GH, en PRL et en TSH. Une première partie de ma thèse a donc porté sur l'étude du transfert du mutant dominant négatif de POU1F1 par un vecteur lentiviral dans les tumeurs hypophysaires somatotropes et lactotropes afin d'évaluer son impact sur la sécrétion hormonale et sur la viabilité cellulaire. Nous avons montré que l'inactivation de ce facteur de transcription entrainait une diminution de la viabilité cellulaire et de la sécrétion de toutes les tumeurs testées. / To this date, some somatotroph adenomas do not respond to the current treatment of pituitary tumors. It still necessary to study the different ways to control the hormonal secretion and the tumor progression to identify alternate therapy capable to manage these symptoms. Likewise, some patient with prolactinomas (about 10%) responsible of gonad and sexual dysfunction do not respond to the control of prolactin hypersecretion. In addition, some neurological complications are finding due to the neighboring structures compression for both of these tumors. To better control the hormonal secretion we investigate two different strategies involving a gene transfer in the cells. POU1F1 is a major transcription factor involved in the pituitary development and the management of somatotroph, thyreotroph and lactotroph cell lines. Its expression is found in pituitary adenomas belonging of these 3 cell lines. Moreover some mutations like the R271W mutant are identified in patients with combined pituitary hormonal deficiency (CPHD). In the first part of my thesis we transfer this dominant negative mutant via a lentiviral transfer in the somatotroph and lactotroph adenomas to evaluate its impact on hormonal secretion and cell viability. We show an inhibitory effect of the POU1F1 inactivation on the secretion and the cell viability of all our tumors. Somatostatin analogs are the major medical therapy for somatotroph adenomas and control GH secretion in 60% of these patients. Octreotide resistance is highly correlated to a low expression of the sst2 receptor.

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n’ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d’Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l’enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d’une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l’ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d’ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L’un d’eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d’adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l’apparition des virus.En plus d’être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces « thermococcines » nécessitent d’être caractérisées, il s’agit de la première mise en évidence d’une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales. / Secretion of membrane vesicles (MVs) is an important physiological process that has been extensively studied in Bacteria and Eukarya. The recent discovery that Archaea produce MVs shows that this process is universal and suggests that the Last Universal Common Ancestor, LUCA, certainly produced MVs. As these archaeal MVs have been only studied in some Crenarchaeota (ex: G/ Sulfolobus), we started characterizing MVs produced by Thermococcales, a group of hyperthermophilic anaerobic Euryarchaeota.In the first part of this study we examined the mechanism of production as well as the protein and lipid composition of MVs produced by three strains of Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans and Thermocococus sp. 5-4. We observed that MVs are released by a budding process from the cell envelope that is similar to ectosome formation in eukaryotic cells. Moreover, clusters of MVs often form filamentous structures and protuberances on cell surfaces, resembling recently described bacterial nanopods. Differences in structure are observable between MVs of the three species, as well as in their protein composition. However, MVs and cell membranes from the same species have a quite similar protein and lipid composition, confirming that MVs are produced from cell membranes. A major protein present in cell membranes and MVs from the three strains is the oligopeptide-binding proteins (OppA), which has homologues in MVs from Sulfolobus species. Thermococcales MVs harbor DNA and protect this DNA against thermodegradation. Here, we show that T. kodakaraensis cells transformed with the shuttle plasmid pLC70 release MVs harboring this plasmid. Interestingly, these MVs can be used to transfer pLC70 into plasmid-free cells, suggesting that MVs could be involved in DNA transfer between cells at high temperature. In the second part of this study, we were specially interested in the strain Thermococcus nautilus, a Thermococcale that produces MVs selectively enriched in two plasmids from the cell. Notably, one of them corresponds to the genome of a defective virus from PRD1-adenovirus lineage. This indicates that MVs can be used as vehicles for the transport of viral genomes and suggests that production of MVs by ancestral cells could have played a role in the origin of viruses.In addition to be involved in transport of plasmids/viruses, MVs from T. nautilus display a toxic effect on some strains of Thermococcales, maybe due to the delivery of toxins. Even if these “thermococcins” remain to be characterized, this is the first time that a toxic activity associated with MVs has been shown in Thermococcales.

Les uvéites non infectieuses sont considérées actuellement comme une des plus importantes cause de déficience visuelle dans la population des jeunes adultes. Les uvéites non infectieuses sont des atteintes inflammatoires de la rétine et de l’uvée et sont généralement considérées comme autoimmunes et initiées par la perte de la tolérance immune aux protéines rétiniennes. Elles sont orchestrées d’une part, systémiquement par deux sous populations lymphocytaires dont la signature cytokinique est l’IFNγ (Th1) et l’IL-17 (Th17) et d’autre part, localement, par l’activation du tissu rétinien. Néanmoins, la vision systémique actuelle est plus complexe et fait intervenir une activation pathologique de l’immunité innée, donnant une composante d’autoinflammation aux uvéites non infectieuses. En plus de ce volet systémique, de nombreux travaux attestent de l’importance de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéites non infectieuses. Loin de jouer un rôle passif durant la maladie, elles vont être stimulées par une série de molécules pro-inflammatoires et ainsi permettre le recrutement et l’activation de cellules immunocompétentes. <p>Notre travail de thèse s’inscrit précisément dans ce contexte du rôle de l’activation des cellules rétiniennes et plus spécifiquement de celles de la barrière hémato rétinienne (BHR) dans le développement d’uvéite non infectieuses.<p>Lors de ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé in vivo, dans deux modèles expérimentaux, l’expression de la molécule d’adhésion VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule) sur les cellules de la BHR. VCAM-1 est une molécule d’adhésion qui facilite l’extravasation des leucocytes du sang vers les tissus. Nous avons montré que VCAM-1 n’est pas exprimé dans l’œil sain mais est induit progressivement lors de la maladie et que l’intensité et l’extension de son expression étaient dépendantes de la sévérité de la maladie. Par ailleurs, nous avons montré que VCAM-1 pouvait être induit sur l’ensemble des cellules de la BHR. <p>Nous avons ensuite analysé in vitro, sur les cellules de l’EPR (Epithélium Pigmentaire Rétinien) qui forment la partie externe de la BHR, les effets antagonistes du TNFα sur l’induction des molécules de CMH de classe II par l’IFNγ. Durant le processus inflammatoire, l’EPR est la cible d’un ensemble de cytokines secrétées par les cellules inflammatoires. Il a été donc intéressant d’étudier les effets d’autres cytokines présentes lors de l’inflammation sur l’induction du CMHII par l’IFNγ au niveau de l’EPR. Nous avons démontré que le TNFα inhibe l’expression du CMH II induit par l’IFNγ sur les ARPE par régulation négative du CIITA (Class II Transactivator). Comme l’activation des lymphocytes T par les cellules de l’EPR dépend de leur niveau d’expression du CMH II, notre étude soutient l’idée que le TNFα possède des propriétés immunomodulatrices sur l’activation de ces cellules, et participe ainsi à la phase de résolution de l’inflammation.<p>Enfin, nous avons étudié les effets du blocage de l’activation des cellules rétiniennes par l’IFNγ en surexprimant le gène SOCS1 (Suppressor Of Cytokine Signaling) in vivo et in vitro.<p>Nous avons surexprimé le gène SOCS1 au niveau rétinien et étudier l’effet de cette surexpression sur le développement de l’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas montré de différence significative entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP contrôle. Afin de normaliser par rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous avons calculé pour chaque souris un ratio des grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non-injecté. L’analyse de la moyenne de ces ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le groupe SOCS1 et le groupe EGFP en terme de grades cliniques. La différence devient par contre significative lorsque l’analyse de ces ratios est faite sur les grades histologiques. Nos expériences mènent donc plutôt à la conclusion que l’expression de SOCS1, médié par injection intravitréenne de l’AAV2 ne protège globalement pas les yeux du développement d’une UAE.<p>Cette absence d’effet peut avoir comme explication que l’injection intravitréenne conduit à une infection relativement limitée des cellules rétiniennes impliquées dans le développement de l’UAE. Il se pourrait également que le niveau d’expression de la protéine SOCS1 soit trop faible pour obtenir un effet protecteur ou que la surexpression de SOCS1 affecte uniquement l’activation des cellules de la rétine par l’IFNγ mais pas par d’autres cytokines telles le TNFα, l’IL-17, ou l’IL-22 qui jouent aussi un rôle important dans le développement d’UAE. C’est cette dernière hypothèse que nous avons choisi d’investiguer in vitro. Nos résultats montrent que la surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα.<p>Ce travail met tout d’abord en évidence l’importante expression, in vivo, de VCAM1 par les cellules de la BHR lors d’UAE et in vitro les effets antagonistes du TNFα et de l’IFNγ sur la régulation de l’expression de molécules du CMHII à la surface de l’EPR. Nos expériences démontrent que la surexpression du gène SOCS1 après injection intravitréenne du vecteur AAV-CAG-SOCS1 n’a que peu d’effet sur le développement de la maladie. Par ailleurs, la surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα et l’IL-17.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont très répandus au sein des génomes bactériens. Ces opérons bicistroniques de petite taille ont été découverts sur des plasmides à bas nombre de copies. Dans ce contexte génétique, les systèmes TA confèrent un avantage sélectif à leurs molécules-hôtes en tuant les bactéries-filles qui ne les ont pas héritées par le mécanisme de tuerie post-ségrégationnelle (PSK, post-segregational killing). Ces systèmes génétiques sont également appelés modules d’addiction étant donné qu’ils rendent la descendance des bactéries qui les contiennent dépendantes de leur présence. Alors que leur rôle dans les molécules d’ADN épisomiques est relativement bien établi, le sens biologique de la présence d’homologues à ces systèmes épisomiques au sein des chromosomes bactériens est sujet à d’intenses débats. L’idée que les systèmes TA chromosomiques confèrent un avantage sélectif a été mise en évidence dans plusieurs modèles. Selon ces modèles, les systèmes TA permettent aux bactéries de mieux faire face à des conditions environnementales stressantes. <p>Entre-temps, la compréhension de l’évolution des génomes bactériens a connu des avancées significatives. L’impressionnante capacité d’adaptation des bactéries est aujourd’hui majoritairement attribuée au transfert horizontal de gènes (THG) provoqué par les éléments génétiques mobiles (phages, plasmides, transposons…). Dans le débat du rôle des systèmes TA chromosomiques, très peu d’attention a été accordée aux relations phylogénétiques et interactions entre systèmes plasmidiques et chromosomiques co-existant au sein d’un même hôte ainsi qu’à l’impact du THG sur leur évolution. Notre travail de thèse vise à mieux comprendre la biologie des systèmes TA en tenant compte de ces paramètres. Nous nous sommes intéressés à des systèmes homologues au système plasmidique ccdF. Nous avons étudié expérimentalement les 4 systèmes ccd (ccd1, ccd2, ccd3 et ccd4) qui co-habitent au sein du chromosome d’Erwinia chrysanthemi 3937 (une bactérie phytopathogène), leurs interactions intragénomiques et les interactions de ces systèmes avec le système plasmidique ccdF. Ce cadre expérimental a mené à la construction du modèle d’anti-addiction. Ce modèle propose que certains systèmes chromosomiques puissent conférer un avantage sélectif à leurs hôtes bactériens en interférant avec le PSK médié par leurs homologues plasmidiques. Cet avantage sélectif pourrait permettre la fixation de systèmes TA latéralement acquis au sein des populations bactériennes. Nous avons également recherché de nouveaux systèmes ccd au sein des génomes bactériens afin d’avoir un aperçu de leur distribution, des contextes génétiques dans lesquels ils existent et de l’implication du THG dans leur dispersion. Les réflexions qui ont accompagné notre recherche nous ont mené à proposer une synthèse sur le rôle des systèmes TA (plasmidiques et chromosomiques). Celle-ci se nourrit des avancées qui ont été effectuées, ces dernières années, dans la compréhension de l’évolution des génomes bactériens, de la théorie hiérarchique de la sélection naturelle et des processus non-adaptatifs et contingents qui pourraient expliquer la présence et la propagation des systèmes TA au sein des génomes bactériens sans que ceux-ci en soient les agents causaux. <p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mycobactéries sont classées parmi les bactéries contenant des acides mycoliques dans leur paroi et un haut GC% dans leur génome. Elles peuvent être isolées à partir du sol ou d'environnement d'eau douce où vivent aussi les protozoaires libres. Plusieurs études ont montré une possibilité de co-isolement des mycobactéries et des amibes à partir de ces sources environnementales. Il a été montré également que la plupart des mycobactéries de l'environnement ont la capacité à survivre dans les trophozoites et les kystes d'amibes et dans certaines cellules eucaryotes, y compris les macrophages. Les manipulations génétiques des mycobactéries en général et des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis en particulier sont compliquées et aucune étude de modification génétique des mycobactéries (pathogènes ou non pathogènes) n'avait été réalisée dans notre laboratoire avant notre travail de thèse. Dans notre travail de thèse, nous avons montré que les amibes ou d'autres organismes phagocytaires peuvent servir comme sources et lieu de transfert des gènes chez les mycobactéries. Ce transfert des gènes peut avoir contribué à l'adaptation des mycobactéries à un mode de vie intracellulaire. Nous avons développé ensuite deux systèmes de coculture: Mycobacterium smegmatis-Acanthamoeba polyphaga et Mycobacterium gilvum-A. polyphaga et nous avons clarifié le spectre des interactions des mycobactéries à croissance rapide avec les amibes. Ce modèle d'interaction mycobactéries-amibes a été utilisé pour tester l'hypothèse contraire au paradigme dominant que l'addition des gènes réduit la virulence des bactéries. / Mycobacteria are mycolic-acid containing, high GC% bacterial organisms which can be recovered from soil and fresh water environments where free-living protozoa also live. Co-isolation of mycobacteria and amoeba collected from such environmental sources has been reported. Several experiments further demonstrated the ability of most environmental mycobacteria to survive in the amoebal trophozoites and cysts and in some eukaryotic cells including macrophages. Genetic modification of mycobacteria in general and mycobacteria belonging to Mycobacterium tuberculosis complex in particular are complicated and no studies using genetic modification of mycobacteria (pathogenic or non-pathogenic) had been performed in our laboratory prior to our work. In our thesis work, we showed that amoebae or other phagocytic organisms can serve as sources and places for gene transfers in mycobacteria. Gene transfers may have contributed to the adaptation of mycobacteria to an intracellular lifestyle. In addition, we developed two co-culture systems: Mycobacterium smegmatis-Acanthamoeba polyphaga and Mycobacterium gilvum-A. polyphaga and we clarified the spectrum of rapid-growing mycobacteria and amoeba interactions. This model of mycobacteria-amoeba interactions was then used to test another hypothesis according to which unlike the prevailing paradigm, the addition of genes does not reduce the virulence of bacteria. For the first time in our laboratory we modified two species of the M. tuberculosis complex, M. tuberculosis H37Rv and Mycobacterium bovis BCG to observe the effect of these changes on their pathogenicity and survival.

La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action. / The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways.