Les virophages sont des petits virus à ADN possédant une capside icosaédrique de 50-60 nm et un génome de 17 à 26 Kb codant potentiellement pour une vingtaine de gènes. Ils ont été découverts associés à des grands virus à ADN appartenant à l’ordre des Megavirales, pour lesquels leur présence serait délétère.Le premier projet du travail de thèse a été de faire le bilan des propriétés connues des virophages au travers d’une revue. La deuxième partie correspond à un bilan des avancées en matière d’isolement de virus géants dans les amibes – hôtes naturels des Mimiviridae –, pouvant être associés aux virophages. La troisième section se focalise sur la réplication des virophages Sputnik avec différents virus parmi les Mimiviridae, ainsi que sur l’isolement d’une nouvelle souche de Sputnik sans son hôte natif par l’utilisation d’un Mimiviridae en tant que virus rapporteur. La dernière partie est enfin basée sur l’identification d’un nouveau virophage – Zamilon – isolé en association avec un Mimiviridae du groupe C, et présentant une spécificité d'hôtes restreinte. Celle-ci est d'ailleurs étudiée.Les résultats présentés dans cette thèse démontrent une certaine complexité des interactions entre les virophages et leurs hôtes. Au sein d’une même famille d’hôtes, certains virophages possèdent un large spectre de spécificité, alors que d’autres ne peuvent se multiplier qu’avec certains d’entre eux, comme cela a déjà été observé chez les bactériophages. Compte-tenu de leur impact potentiel sur les virus géants, ces résultats soutiennent l’hypothèse d’une régulation des populations virales environnementales par les virophages. / Virophages are small DNA viruses with a 50-60 nm width icosahedral capsid encompassing a 17 to 26 Kb genome, putatively coding approximately 20 genes. They have been discovered in association with large DNA virus belonging to the order of the Megavirales, for which they are noxious.The first project of this thesis work was to recapitulate in a review the known features of the virophages. The second part corresponds to a summary of the advances in the field of giant viruses isolation in amoebas – the common hosts of Mimiviridae –. The third section is focused on the replication of the Sputnik virophages with viruses belonging to the Mimiviridae, and on the isolation of a new Sputnik strain with a Mimiviridae reporter instead of with its natural viral host. Finally, the last part is based on the identification of a new virophage – Zamilon – isolated in combination with a group C Mimiviridae, and exhibiting a restricted spectrum of specificity. The latter is herein studied.The results described herein show the complexity of the interactions between virophages and their giant hosts viruses. Within the same host family, some virophages have a broad-range host spectrum whereas others are limited to some viruses, a feature already described for bacteriophages. Regarding the potential impact of the virophages over their host viruses, these results support the hypothesis of a virophages’ major role in a regulation of viral populations in environment.

Reproduction de : Mémoire du DES : Biologie médicale : Nantes : 2008. Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Th.--Pharm.--Paris 5, 1981. N°: 55.

Les amibes sont des protozoaires unicellulaires ubiquitaires dans l'environnement qui se nourrissent des microorganismes qui les entourent. Cependant plusieurs études ont déjà montré que certains de ces microorganismes (bactéries et virus) sont capables d'entrer dans les amibes et de s'y multiplier au lieu d'y être digérés. Cette capacité et l'analogie entre les amibes et les macrophages fait de ces microorganismes de potentiels pathogènes humains. L'utilisation de la technique de coculture sur amibes a donc été développée afin de permettre l'isolement de ces microorganismes. En 2001 elle a permis l'isolement d'un petit coque Gram positif qui sera identifié en 2003 comme étant le premier virus géant isolé : Acanthamoeba polyphaga Mimivirus, pour « mimiking microbe » en référence à sa coloration positive au Gram. La découverte de ce virus associé aux amibes et qualifié de « géant » il y a moins d'une décennie a bouleversé les définitions même de virus. Une taille exceptionnelle de 500 nm, un génome qui dépasse 1 Mb, une particule comportant des ADN et des ARN, autant de caractéristiques originales qui l'ont rendu exceptionnel. Depuis, d'autres virus géants ont été isolés, notamment Marseillevirus, et il est probable que la famille s'étende rapidement maintenant que l'on sait que leur isolement était impossible à cause de leur caractère non filtrable. Des études en métagénomique dans l'environnement ont suggéré une grande ubiquité de ces virus dans l'environnement, notamment hydrique. / Free living amoebas are ubiquitous in the environment and feed on microorganisms. However, several studies have already shown that some of these microorganisms (bacteria and virus) are able to enter the amoeba and multiply within the cell. This capacity and the analogy between amoebas and macrophages allow to think that these microorganisms are potentially human pathogens. The use of the amoeba coculture method was thus developed to allow the isolation of these microorganisms. In 2001 it allow the isolation of a small Gram positive coccus which will be characterized in 2003 as the first isolated giant virus : Acanthamoeba polyphaga Mimivirus. The discovery of this virus less than a decade ago challenged the definition of viruses. An exceptional size of 500 nm, a genome which exceeds 1 Mb, a particle containing DNA and ARN, so many original characteristics which made it exceptional. Since, other giant viruses were isolated, in particular Marseillevirus, and it's likely that the family quickly extends now that we know that their isolation was impossible because of their not filterable character. Environmental metagenomic studies suggested a big ubiquity, particularly into hydric environment. Furthermore the description of virophages, small viruses capable of infecting Mimivirus and behaving towards him as a bacteriophage, contribute to debate on the nature of viruses as well as on their place in the evolution.

Le génome de Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose, code pour une protéine ayant la capacité de se fixer sur la cellulose (Rv1987), une cellulase potentielle (Rv1090), et une cellulase pleinement active (Rv0062). Cette observation est surprenante, car la cellulose est un composant majeur des parois des cellules végétales, tandis que M. tuberculosis est un pathogène humain sans contact connu avec des plantes. Nous avons émis l’hypothèse que ces protéines pourraient jouer un rôle dans les interactions entre les mycobactéries du complexe M. tuberculosis avec les kystes d’amibes libres, dont la paroi contient également de la cellulose. Dans notre travail de thèse, nous avons cherché par une analyse in silico la présence de ces trois gènes chez toutes les bactéries ayant un génome complètement séquencé présentes dans la base de données CAZy (accessible en ligne à l’adresse www.cazy.org). Cette étude a montré que seulement 2,5% des bactéries codent pour les trois gènes simultanément. Parmi ces bacteries, nous avons ensuite confirmé expérimentalement par PCR et séquençage la présence des gènes Rv0062, Rv1090 et Rv1987 chez les mycobactéries du complexe M. tuberculosis. Nous avons ensuite vérifié la transcription de ces trois gènes chez la souche de référence M. tuberculosis H37Rv, puis produit dans Escherichia coli des protéines de fusion Rv1090 et Rv1987 et montré qu'elles étaient capables d'hydrolyser la cellulose (Rv1090) et de s’y fixer (Rv1987). De plus, nous avons mis en place un model expérimental d’interaction entre les mycobactéries du complexe M. tuberculosis et les amibes libres dans le but de comprendre le rôle des gènes Rv0062, Rv1090 et Rv1987. Dans un premier temps nous avons montré que M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium canettii ainsi que Mycobacterium avium utilisé ici comme un controle positif étaient capables de survivre dans le cytoplasme des amibes libres telles que Acanthamoeba polyphaga. Ensuite, nous avons montré que M. tuberculosis et M. bovis mais pas M. canettii étaient capables de survivre à l’intérieur des kystes d’amibes. Enfin nous avons montré que M. tuberculosis, M. bovis et M. canettii étaient capables de survivre dans le sol pendant au moins 6 mois. Les données établies dans cette thèse soutiennent le rôle des cellulases dans la survie environnementale des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, et ouvrent la voie à l’étude de cette phase méconnue dans le cycle de ces organismes / The genome of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, encodes a protein with the ability to bind to cellulose (Rv1987), one potential cellulase (Rv1090), and one fully active cellulase (Rv0062). This observation is puzzling, because cellulose is a major component of plant cell walls, whereas M. tuberculosis is a human pathogen without known contact with plants. We hypothesized that these genes could play a role in the interactions between M. tuberculosis complex organisms and amoebal cysts, whose wall contains cellulose.In our thesis work, we have searched by in silico analysis for the presence of these three genes in all bacteria with complete sequenced genomes present in the CAZy database (available online at www.cazy. org). This study showed that only 2.5% of bacteria encode the three genes simultaneously. Among these bacteria we have confirmed experimentally by PCR and sequencing the presence of Rv0062, Rv1090 and Rv1987 in the M. tuberculosis complex organisms. We have checked the transcript of the three genes in the reference strain M. tuberculosis H37Rv and we subsequently produced Rv1090 and Rv1987 fusion proteins in Escherichia coli and demonstrated that they were indeed able to hydrolyze (Rv1090) and to bind (Rv1987) cellulose. In addition, we have developed an experimental model of interaction between M. tuberculosis organisms and the free-living amoebae in order to understand the role of Rv0062, Rv1090 and Rv1987 genes. Initially we have shown that M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium canettii and Mycobacterium avium used here as a positive control were able to survive in the cytoplasm of the free-living amoeba such as Acanthamoeba polyphaga. We have further shown that M. tuberculosis and M. bovis but not M. canettii were able to survive within the amoebal cysts. Finally we have shown that M. tuberculosis, M. bovis and M. canettii were able to survive in soil for at least 6 months. The data obtained in this thesis support the role of cellulase in the survival of M. tuberculosis complex organisms in the environment and pave the way for the study of this unknown phase in the cycle of these organisms.

L'ulcère de Buruli, maladie négligée, pouvant entraîner déformations et incapacités permanentes, causée par Mycobacterium ulcerans, une mycobactérie associée aux écosystèmes aquatiques. Les sources et réservoirs de M. ulcerans ne sont pas précisément connus limitant la prophylaxie. Ma thèse contribue à démasquer les sources de contamination par M. ulcerans. Ma revue de la littérature répertoriant les sources potentielles, met en exergue les pièces manquantes pour la compréhension de l’épidémiologie de l’ulcère de Buruli. Mon étude de coculture M. ulcerans-Acanthamoeba griffini indique que cette amibe n’est pas un réservoir de M. ulcerans. Ensuite, mon étude du métabolisme des substrats carbonés indique que les bactéries, champignons, algues et mollusques peuvent combiner des sources carbonées au profit de M. ulcerans dans l’environnement. Capitalisant sur ce résultat, mon étude de l’effet des mycolactones secrétées par M. ulcerans sur les champignons, montre une attraction sur Mucor circinelloides. Ces observations démasquent une nouvelle activité de la mycolactone d’attraction d’organismes fungiques. Le mode de transmission de M. ulcerans à l’homme reste également un mystère. Dans ce sens, j’ai détecté des séquences d'ADN spécifiques de M. ulcerans sur la peau saine d’individus asymptomatiques en zones d’endémie. Ces données pourraient aider à promouvoir une prophylaxie fondée sur le port des habits de protection au contact des environnements à risques. En perspective à mon travail de thèse, une collaboration est mise en place avec le PNLUB et l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire pour étudier les réservoirs de M. ulcerans en Côte d'Ivoire. / Buruli ulcer is a dermis, epidermis and sometimes bone infection leading to deformities and permanent disabilities. It is caused by Mycobacterium ulcerans, a mycobacterium associated to the aquatic ecosystems but its sources and reservoirs are not yet defined. Therefore, no prophylaxis is established. This thesis contribute to unmask the sources of contamination of M. ulcerans. My review has identified potential sources of M. ulcerans in the environment and highlighted the missing pieces for understanding the epidemiology of Buruli ulcer. My study on the role of amoeba in the survival of M. ulcerans in the environment, install M. ulcerans as susceptible to amoeba rendering amoeba an unlikely host of M. ulcerans. Hereafter, i studied carbon substrates metabolized by M. ulcerans strains. Literature survey indicated that the environmental sources of carbon substrates metabolized by M. ulcerans were bacteria, fungi, algae and mollusks. I therefore studied the interactions of M. ulcerans with fungi by testing the effect of mycolactones on fungi. Mycolactones showed an attraction effect on Mucor circinelloides. This observation suggest a novel role for mycolactones as chemoatractants to fungi. The mode of transmission of M. ulcerans to humans remains unknown. I showed that M. ulcerans DNA can be detected on the healthy skin of asymptomatic persons, suggesting an asymptomatic carriage. These data could help promote prophylaxis based on wearing protective clothing in contact with risky environments. In perspective to my thesis work, we set up a collaboration with the Buruli Ulcer Program (PNLUB) and Institut Pasteur Côte d'Ivoire to study the reservoirs of M. ulcerans.

Dans un contexte de réchauffement climatique, la fonction puits de carbone des tourbières à sphaignes est susceptible d'être altérée en raison d'une modification des interactions sphaignes-microorganismes, responsables de l'accumulation de carbone. L'objectif de cette thèse a été (1) d'identifier les interactions chimiques entre les polyphénols des sphaignes et les communautés microbiennes des sphaignes et (2) d'évaluer l'impact du réchauffement climatique sur ces relations.Un dispositif expérimental (Open Top Chambers) simulant in situ une hausse modérée des températures (+ 1°C) a été installé sur la tourbière de Frasne (25). La hausse des températures a provoqué une modification du réseau alimentaire microbien avec l'augmentation de la biomasse des bactéries et une baisse importante (-70%) de la biomasse des prédateurs (amibes à thèque). Le réchauffement climatique a également induit une baisse de la production de polyphénols, diminuant ainsi leur effet inhibiteur sur les microorganismes. En parallèle à cette baisse, une hausse des activités enzymatiques phénoloxydases a également été enregistrée. Le réchauffement a ainsi modifié les relations polyphénols - phénoloxydases, deux éléments essentiels du cycle du carbone des tourbières.Les différents changements induits par le réchauffement climatique (polyphénols, phénoloxydases, réseau trophique microbien) ont aussi conduit à une modification des relations " sphaignes-microorganismes " via une accélération potentielle du recyclage des nutriments, ce qui pourrait influencer sur le long terme le fonctionnement de l'écosystème tourbière.

En faisant le parallèle avec les selles modernes, les coprolithes peuvent être appropriés à l'étude des habitudes alimentaires, de la flore intestinale et des maladies, des animaux et des hommes ayant vécu il y a des siècles. Dans le travail de thèse ici présenté, un coprolithe datant des 14-15ième siècles, provenant de Namur en Belgique, a été étudié. Dans un premier temps l'ensemble de la communauté microbienne associée au coprolithe été characteriser. Les résultats ont montré qu'une partie du microbiote est similaire à l'environnement et l’autre la flore intestinale, des parasites intestinaux et des pathogènes systémiques ont été aussi trouvés. Un second projet a visé à la purification de particules virales à partir du coprolithe et leur analyse par microscopie électronique et métagénomique virale. Des particules virales sphériques, ainsi que des bactériophages, ont ainsi été observés. Les virus associés au coprolithe correspondent à des virus d'eucaryotes, de procaryotes et d'archaea. La communauté virale était dominée par des bactériophages détectés dans le sol et les selles. Parmi les fonctions métaboliques détectées, une correspond d'ailleurs à des résistances aux antibiotiques. Dans un troisième projet, des cultures et des identifications moléculaires ont été réalisées sur des kystes d'amibes observés dans le coprolithe. Les amibes isolées appartiennent au genre Acanthamoeba et pourraient avoir été conservées sous forme de kystes pendant des siècles dans le coprolithe. Les co-cultures d'amibes ont mené à l'isolement d'une nouvelle bactérie bi-flagellée résistante aux amibes, proche des Rickettsiales. / By drawing parallels to modern stools, coprolites can be suitable specimen to study diet habits, gut microbiota and diseases of animals and humans that have lived centuries ago. During this thesis work, a 14-15th century coprolite specimen from Namur, Belgium was analyzed. At the initiation of this thesis work, it was aimed to characterize the entire microbial communities associated to the coprolite and to identify ancient pathogens. Results indicated that parts of the microbiota are similar to those coming from environment and the gut microbiota inhabitants. Further intestinal parasites and systemic pathogens – still relevant nowadays – were also found. In a second work, viral particles were purified from the Namur coprolite and analyzed by electron microscopic and viral metagenomic. Viral particles associated to spherical virions and bacteriophages were observable. Viruses infecting eukaryotes, bacteria and archaea were associated to the specimen. The viral community was dominated by bacteriophages commonly found in soil and in modern stools and antibiotic resistance was one of the metabolic functions detected. In a third project, culture and molecular identification were performed on amoebal cysts observed within the coprolite. The amoebas isolated belong to the genus Acanthamoeba and might have been conserved in form of cysts inside the Namur coprolite for centuries. Amoeba-co culturing leaded to the isolation and identification of a new bi-flagellar amoeba-resistant bacterium closely related to Rickettsiales.

Legionella pneumophila est une bactérie intracellulaire facultative retrouvée aussi bien dans les environnements aqueux naturels qu'artificiels. Cette bactérie est l'agent de la légionellose, une pneumopathie sévère. Les milieux aqueux sont colonisés par des biofilms, une association de micro-organismes enveloppés d'une matrice exopolymérique. Les légionelles sont capables de coloniser et de survivre au sein de ces biofilms. Dans les réseaux d'eaux, les biofilms sont la cible de la prédation des amibes qui se retrouvent ensuite parasités par les légionelles et favorisent ainsi leur multiplication. Nous avons étudié l'impact de l'origine de la multiplication des légionelles sur la colonisation et la formation de biofilms. Notre étude a démontré que dans tous les cas les légionelles sont présentes à la surface de biofilms préformés. Notre étude a mis en évidence que les légionelles issues de la multiplication au sein d'amibes sont capables de former des agrégats compacts empaquetés dans une matrice exopolysaccharidique. Ce phénotype « biofilm » se manifeste après induction par une molécule amibienne en cours de caractérisation. De plus, notre étude a mis en évidence l'existence d'un nouveau système de communication de type Quorum Sensing permettant une communication inter et intra-espèce qui permet l'induction de ce phénotype chez les légionelles. / Legionella pneumophila is a facultative intracellular Gram-negative bacterium colonizing freshwater as well as artificial environments. This bacterium is the agent of Legionnaires' disease, a severe pneumonia. Water network are colonized by biofilms, an association of microorganisms embedded in exopolymeric matrix. Legionella are able to colonize and survive within biofilms which are the major source of human infection. In water systems, biofilms are the target of amoeba predation that can be parasitized by Legionella. Amoebae are the major multiplication site of Legionella in the environment.We studied the impact of multiplication origin on colonization and biofilm formation by Legionella. Our study demonstrated that Legionella whatever their origins are present at the surface of pre-formed biofilms. Our study showed that Legionella issued from multiplication within amoebae are able to form compact aggregates packed in an exopolysaccharidic matrix. This "biofilm" phenotype occurs after induction by an amoebic molecule that has to be characterized. In addition, our study revealed the existence of a new QS system for inter and intra-species communication that allows the induction of this biofilm phenotype to other Legionella.

Il est aujourd'hui bien établi que les amibes libres jouent le rôle de vecteurs à la bactérie pathogène Legionella pneumophila favorisant ainsi son développement et sa propagation dans l'environnement. Ainsi, et jusqu'à maintenant, toutes les espèces d'amibes libres étudiées ont démontré une capacité à soutenir et favoriser la croissance de la bactérie responsable des légionelloses. Toutefois, l'ensemble des études a porté sur un nombre restreint d'espèces amibiennes, et leurs capacités relatives à soutenir la croissance bactérienne n'ont que très peu été abordées. Nous avons comparé la capacité de différentes espèces amibiennes à soutenir la prolifération de différentes souches de L. pneumophila du sérogroupe 1. Ces études ont mis en évidence les propriétés particulières d'une souche d'amibe appartenant à l'espèce Willaertia magna. Cette souche présente, au contraire de toutes les autres espèces, la capacité à inhiber et diminuer la prolifération de certaines souches de L. pneumophila. Nous avons par ailleurs pu démontrer l'existence d'une phagocytose interamibienne entre différentes espèces d'amibes, un phénomène jamais mis en évidence à notre connaissance. Les conséquences de cette phagocytose interamibienne sur la croissance et la prolifération de L. pneumophila sont aussi rapportées. La microscopie électronique suggère fortement que la bactérie L. pneumophila ne peut inhiber la fusion phagolysosomale chez W. magna à l'inverse du phénomène observé chez les espèces amibiennes permissives. Ces observations démontrent l'importance de phénomènes membranaires dans la capacité des bactéries à parasiter leur hôte amibien. L'analyse comparée de la composition lipidique des membranes de différentes espèces amibiennes montre chez W. magna une expression élevée de phosphatidylcholine. L'inhibition de la voie de biosynthèse de ce phospholipide par méthylation de phosphatidyléthanolamine résulte en une forte diminution de la croissance amibienne, suggérant que cette voie métabolique joue un rôle important dans les capacités de résistance de W. magna.