Le risque de contamination des réseaux par les légionelles est aujourd'hui bien connu. Ces bactéries sont naturellement résistantes à un certain nombre de stress, elles peuvent survivre de façon prolongée dans les biofilms et proliférer de façon très importante via une croissance intracellulaire dans les amibes. Les amibes peuvent elles-mêmes présenter une résistance élevée aux traitements de décontamination usuels et offrent donc une protection supplémentaire aux légionelles. Si l'association amibes-légionelles dans les réseaux a été largement étudiée, il n'en est pas de même pour un certain nombre d'autres associations existant entre les amibes et des micro-organismes pathogènes avérés ou pathogènes émergents. Parmi les agents pathogènes émergents associés aux amibes, de nouvelles espèces bactériennes apparentées aux Chlamydia pourraient être responsables de pneumonies et d'avortements à répétition chez l'Homme et l'animal. Ces nouvelles espèces de Chlamydia présentent de nombreuses particularités, dont une survie à l'état libre dans l'environnement beaucoup plus importante que celles des Chlamydia " classiques " et une résistance importante aux températures élevées. De nouveaux virus " géants " associés aux amibes ont aussi été récemment décrits. Ils présentent de nombreuses particularités biologiques par rapport aux virus plus classiques et, bien que les preuves formelles de leur pathogénicité restent à apporter, certains de ces virus pourraient être responsables de pneumonies. Enfin, l'association amibes libres - mycobactéries soulève des questions importantes. Des travaux récents démontrent que des mycobactéries atypiques résistantes à certains traitements de décontamination (glutaraldéhyde notamment) sont aussi plus résistantes à certains traitements antibiotiques et plus à même de survivre dans les amibes. Par ailleurs la plupart des espèces de mycobactéries présentent la capacité de survivre dans les kystes amibiens, eux-mêmes très résistants à la plupart des traitements de décontamination. Les travaux de recherche présentés dans ce mémoire portent sur l'étude de l'écologie des amibes libres de l'environnement ainsi que sur l'étude de leur résistance à différents types de traitements biocides. Le rôle des amibes en tant que lieu d'échange de matériel génétique entre micro-organismes est abordé, ainsi que l'interaction des amibes avec les légionelles, les espèces apparentées aux Chlamydia, les virus d'amibes et les mycobactéries.

Des souches de Vibrio appartenant au clade Splendidus sont retrouvées de manière récurrente lors des mortalités estivales d’huîtres juvéniles. La souche V. tasmaniensis LGP32 est un pathogène intracellulaire facultatif des hémocytes d’huître, dont elle altère les fonctions de défense. Nous nous intéressons ici aux interactions entre les phagocytes et V. tasmaniensis LGP32, à diverses échelles (moléculaire, cellulaire et environnementale). Dans une première partie, nous avons découvert un mécanisme antimicrobien, encore inconnu chez C. gigas : la formation de pièges d'ADN extracellulaire (ETs). Ces ETs sont associés à des histones antimicrobiennes et sont capables de piéger des bactéries. Comme chez les vertébrés, la formation de ces ETs est dépendante de la production d'espèces réactives de l'oxygène. De plus, la présence de ces ETs a été confirmée in vivo et a été associée à une accumulation d'histones antimicrobiennes dans les tissus, suite à une blessure ou à une infection. Dans une seconde partie,nous avons étudié les interactions entre V. tasmaniensis LGP32 et des protistes hétérotrophes présents dans l’environnement des huîtres, tels que les amibes et les ciliés, qui se nourrissent de micro-organismes par phagocytose. Un résultat important de cette thèse a été de montrer que V. tasmaniensis LGP32 résiste également à la phagocytose des protistes hétérotrophes environnementaux, de manière intracellulaire. C'est à notre connaissance la première fois que les mécanismes d’interaction entre des bactéries pathogènes d'origine marine et des amibes marines sont décrits. Les amibes que nous avons isolées étant présentes dans l'environnement direct des huîtres, nous pouvons donc supposer que la pression de sélection exercée par les phagocytes environnementaux pourrait favoriser l’émergence de traits de virulence et/ou de résistance à la phagocytose parmi les bactéries marines, comme c’est le cas pour V. tasmaniensis LGP32. / Vibrio strains belonging to the Splendidus clade have been repeatedly found in juvenile diseased oysters affected by summer mortalities. V. tasmaniensis LGP32 is an intracellular pathogen of oyster hemocytes which has been reported to alter the oxidative burst and inhibit phagosome maturation.We here focus on the interactions between phagocytes and V. tasmaniensis LGP32, at molecular, cellular and environmental scales. In the first part of this work, we uncover anunknown antimicrobial mechanism of C. gigas hemocytes: the formation of DNA extracellular traps (ETs). These ETs are associated with antimicrobial histones and are able to entrap bacteria. As in vertebrates, ETs formation depends on reactive oxygen species production. In addition, the presence of ETs was confirmed in vivo and has been associated with antimicrobial histones accumulation in tissues, in response to injury or infection. In the second part of this work, we studied the interactions between V. tasmaniensis LGP32 and heterotrophic protists found in the oyster’s environment, such as amoebae and ciliates, which feed on microorganisms by phagocytosis. An important result of this workwas that V. tasmaniensis LGP32 resists to phagocytosis by environmental heterotrophic protists, as well as to oyster hemocytes. To our knowledge, this is the first mechanical description of an interaction between marine amoebae and marine pathogenic bacteria. As the amoebae were isolated from the direct environment of oysters, we can presume that the selective pressure exerted by environmental phagocytes could select for virulence and/or phagocytosis resistance traits in marine bacteria as in the case of V. tasmaniensis LGP32.

Il est aujourd’hui bien établi que les amibes libres jouent le rôle de vecteurs à la bactérie pathogène Legionella pneumophila favorisant ainsi son développement et sa propagation dans l’environnement. Ainsi, et jusqu’à maintenant, toutes les espèces d’amibes libres étudiées ont démontré une capacité à soutenir et favoriser la croissance de la bactérie responsable des légionelloses. Toutefois, l’ensemble des études a porté sur un nombre restreint d’espèces amibiennes, et leurs capacités relatives à soutenir la croissance bactérienne n’ont que très peu été abordées. Nous avons comparé la capacité de différentes espèces amibiennes à soutenir la prolifération de différentes souches de L. pneumophila du sérogroupe 1. Ces études ont mis en évidence les propriétés particulières d’une souche d’amibe appartenant à l’espèce Willaertia magna. Cette souche présente, au contraire de toutes les autres espèces, la capacité à inhiber et diminuer la prolifération de certaines souches de L. pneumophila. Nous avons par ailleurs pu démontrer l’existence d’une phagocytose interamibienne entre différentes espèces d’amibes, un phénomène jamais mis en évidence à notre connaissance. Les conséquences de cette phagocytose interamibienne sur la croissance et la prolifération de L. pneumophila sont aussi rapportées. La microscopie électronique suggère fortement que la bactérie L. pneumophila ne peut inhiber la fusion phagolysosomale chez W. magna à l’inverse du phénomène observé chez les espèces amibiennes permissives. Ces observations démontrent l’importance de phénomènes membranaires dans la capacité des bactéries à parasiter leur hôte amibien. L’analyse comparée de la composition lipidique des membranes de différentes espèces amibiennes montre chez W. magna une expression élevée de phosphatidylcholine. L’inhibition de la voie de biosynthèse de ce phospholipide par méthylation de phosphatidyléthanolamine résulte en une forte diminution de la croissance amibienne, suggérant que cette voie métabolique joue un rôle important dans les capacités de résistance de W. magna / Free living amoeba is a known vector of L. pneumophila in the environment and it has been shown to favour bacterial growth. Until now, all studied amoeba species showed a capacity to support the growth of the bacterium responsible for the Legionnaire’s disorder. However, these studies were related to a restricted number of amoebic species, and their relative capacity to support the bacterial growth. We compared the capacity of various amoebic species to support the proliferation of various strains of L. pneumophila. These studies highlighted the particular properties of a strain belonging to the Willaertia magna species. This amoeba has, contrary to all the other species, the capacity to inhibit and decrease L. pneumophila proliferation. We also demonstrate the existence of an inter-amoebic phagocytosis between various species of amoebas, a phenomenon never studied to our knowledge. The consequences of this inter-amoebic phagocytosis on the growth and proliferation of L. pneumophila are also reported. Electron microscopy strongly suggests that the bacterium cannot inhibit the phagolysosomal fusion in W. magna contrary to permissive amoebic species. These observations suggest the importance of membrane phenomena in the capacity of the bacteria to infest their amoebic host. Compared analysis of the lipidic composition of various amoebic species shows in W. magna a high expression of phosphatidylcholine the major phospholipid. The inhibition of the PE N-methyltransferase biosynthesis pathway of this phospholipid results in a strong reduction of the amoebic growth, suggesting that this metabolic pathway plays an important role in the resistance capacity of W. magna to L.pneumophila.

Dans un contexte de réchauffement climatique, la fonction puits de carbone des tourbières à sphaignes est susceptible d’être altérée en raison d’une modification des interactions sphaignes-microorganismes, responsables de l’accumulation de carbone. L’objectif de cette thèse a été (1) d’identifier les interactions chimiques entre les polyphénols des sphaignes et les communautés microbiennes des sphaignes et (2) d’évaluer l’impact du réchauffement climatique sur ces relations.Un dispositif expérimental (Open Top Chambers) simulant in situ une hausse modérée des températures (+ 1°C) a été installé sur la tourbière de Frasne (25). La hausse des températures a provoqué une modification du réseau alimentaire microbien avec l’augmentation de la biomasse des bactéries et une baisse importante (-70%) de la biomasse des prédateurs (amibes à thèque). Le réchauffement climatique a également induit une baisse de la production de polyphénols, diminuant ainsi leur effet inhibiteur sur les microorganismes. En parallèle à cette baisse, une hausse des activités enzymatiques phénoloxydases a également été enregistrée. Le réchauffement a ainsi modifié les relations polyphénols – phénoloxydases, deux éléments essentiels du cycle du carbone des tourbières.Les différents changements induits par le réchauffement climatique (polyphénols, phénoloxydases, réseau trophique microbien) ont aussi conduit à une modification des relations « sphaignes-microorganismes » via une accélération potentielle du recyclage des nutriments, ce qui pourrait influencer sur le long terme le fonctionnement de l’écosystème tourbière. / Carbon stocks of Sphagnum-peatlands are likely to be altered by climate warming due to important changes in “Sphagnum-microorganisms” relationships which are responsible for carbon sequestration. The objectives of the thesis are (1) to identify the chemical interactions between Sphagnum-polyphenols and Sphagnum associated microbial communities and (2) to understand the impact of warming on these relationships.An experimental design using Open-Top-Chambers (OTC) was used to simulate an increase of air temperatures (+1°C) on a peatland situated in Jura Mountains (Frasne, 25). Temperature increase induced a modification of the microbial food web with an increase of the biomass of bacteria and a strong decrease of the biomass of top-predators (-70%), i.e. testate amoebae. Warming also induced a decrease of Sphagnum-polyphenols, diminishing their inhibitory effect on microbial communities. In parallel, an increase of phenoloxidase enzymatic activities was recorded in OTC. Climate warming thus modified polyphenol-phenoloxidase interplay, two crucial components of carbon cycle in peatlands. Warming effects on the different components – i.e. polyphenols, phenoloxidases, microbial food web – induced a modification of Sphagnum-microbial communities interplay, favoring carbon and nutrient recycling, which could alter peatland functioning in long-term.

Depuis son isolement en 1977, les épidémies de pneumopathies à Legionella pneumophila (Lp) sont en constante progression. La contamination se fait essentiellement par inhalation d'aérosols contaminés, générés à partir de l'eau des réseaux de distribution. L'écologie de Lp est complexe, faisant intervenir des protozoaires dans lesquels elle se multiplie et des biofilms dans lesquels elle persiste à l'état viable mais non cultivable.<br />L'objectif de ce travail était de mieux comprendre cette écologie. Des incubateurs permettant le prélèvement de biofilm ont été installés in situ dans un réseau, la colonisation en eau froide et en eau chaude a été suivie pendant 1 an. Par ailleurs, un pilote reproduisant un réseau intérieur permis de comparer l'efficacité de différents traitements de désinfection. Enfin, la recherche de molécules auto-inductrices qui pourraient expliquer l'exacerbation de la virulence lors de la multiplication intra-cellulaire a été menée dans différentes conditions.<br />Les incubateurs ont permis l'amplification de la quantité de légionelles, rendant possible la détection par culture en eau froide et entraînant une stabilisation de la population en eau chaude. L'utilisation de sondes spécifiques n'a pas permis d'améliorer la détection dans les biofilms.<br />Lors des essais sur pilote, les populations des biofilms ont été analysées grâce à des méthodes moléculaires (FISH, marquage de vitalité) et par culture. Le classement des traitements par ordre d'efficacité décroissante est le suivant : dioxyde de chlore > chlore > ozone > monochloramine > cuivre-argent. Seul le dioxyde de chlore montre une activité résiduelle dans les bras morts rincés quotidiennement avec de l'eau traitée. Les amibes résistent aux traitements, et Lp retrouve son niveau de population initial quelques jours seulement après leur interruption.<br /> Enfin, aucune sécrétion d'auto-inducteur n'a été mise en évidence, et l'incubation de Lp avec ces molécules ne semble pas modifier l'invasion des amibes.

Les amibes sont des organismes unicellulaires eucaryotes, de 10 à 300 µm, pouvant vivre sous forme parasite ou évoluer librement dans les sols et les milieux aquatiques ou encore adopter l’une ou l’autre forme en fonction de l’environnement. Certaines amibes libres sont hautement pathogènes pour les animaux et l’homme, en particulier Naegleria fowleri qui se développe dans les eaux naturellement chaudes à des températures comprises entre 27 et 45°C. Cette espèce est responsable d'une encéphalite généralement mortelle, la méningo-encéphalite amibienne primitive (MEAP), dont un cas a été recensé en Guadeloupe en 2008. Un enfant de 9 ans ayant contracté la maladie est décédé quelques jours après un bain dans les eaux chaudes de Dolé, sur la commune de Gourbeyre. Notre travail de Thèse à l’Institut Pasteur, en collaboration avec l’ARS, a permis d’initier un programme de recherche sur ces amibes pathogènes très peu connues sur notre territoire, afin de mieux évaluer le risque lié aux baignades dans les sources géothermales de la Guadeloupe. Nous avons développé et mis au point une méthode de détection et de dénombrement des amibes faisant appel à la biologie moléculaire qui est aujourd’hui appliquée en routine au sein de notre laboratoire. Depuis Janvier 2011, un suivi mensuel a révélé la présence des amibes thermophiles et de l’amibe pathogène dans presque tous les sites analysés (Ravine Chaude, Bains de La Lise et Bain du Curé à Pigeon, Bains Jaunes, Bain de Dolé, Bain de Capes, Bain des Amours, Bain de la rivière Grosse-Corde, Chute du Carbet, Bain de Morphy et Bain chaud de Matouba), à l’exception des eaux chaudes soufrées et/ou salées de Sofaïa et de l’Anse Thomas à Bouillante. Le séquençage des produits de PCR obtenus et déposés dans Genbank nous a permis de confirmer l’appartenance de cette souche de N. fowleri, au type 3 Euro-américain, identique à celui détecté lors de l’accident de 2008 (Moussa et al. 2013). Le nombre d’amibes pathogènes retrouvées varie de 2 à 30 amibes/litre selon les bains, sans dépasser la limite de 100 amibes/litre recommandée par les autorités sanitaires. En dépit de ces faibles concentrations, une surveillance régulière des bassins est nécessaire. Sur l’ensemble de l’année 2011-2012, l’espèce pathogène N. fowleri a été la plus fréquemment rencontrée par rapport aux espèces non pathogènes N. lovaniensis et Hartmanella sp. Ces données de surveillance ont amené l’ARS et les communes concernées à organiser une campagne de sensibilisation à destination des populations locales et touristiques, reposant sur l’installation de panneaux de prévention à proximité des principaux sites où N. fowleri a été retrouvée.La présence régulière de N. fowleri tout au long de l’année dans la plupart des bains chauds et notamment dans les bains les plus fréquentés, a orienté notre travail sur la recherche de l’origine de leur contamination. Nous avons découvert que les sources géothermales ne sont pas contaminées à leur émergence, mais que les amibes proviennent de la terre en amont des bassins. Ce résultat qui montre que le sol est le réservoir naturel des amibes, nous a permis de proposer aux collectivités un moyen de lutte efficace en canalisant l’eau depuis l’émergence jusqu’au bassin, sans passer par le sol. / Amoebas are eukaryotic unicellular organisms, measuring from 10 to 300 µm, being able to live under a parasite form or to evolve freely in soils and aquatic media. They can even adopt either form depending of the environment. Some free living amoebas are highly pathogenic for animals and humans, especially Naegleria fowleri which develops in naturally hot waters at temperatures between 27 and 45°C. This species is responsible for an encephalitis generally lethal, the primary amoebic meningoencephalitis (PAM), a case of which occured in Guadeloupe in 2008. A 9-year-old child having contracted the disease, died a few days after a bath in the hot waters of Dolé, in Gourbeyre. Our Thesis at the Institut Pasteur of Guadeloupe, in association with the ARS, initiated a research program on these pathogenic amoebas poorly known in our territory, to better estimate the risk to contract the disease while bathing in geothermal recreational waters of Guadeloupe. We developed and worked out a method of detection and enumeration of amoebas using the molecular biology, which is currently applied in routine in our laboratory. Since January, 2011, a monthly monitoring of the baths revealed the presence of thermophilic free living amoebas and pathogenic amoeba in almost all the analyzed sites (Ravine Chaude, La Lise, Bain du Curé à Pigeon, Bains Jaunes, Bain de Dolé, Bain de Capès, Bain des Amours, Bain de la rivière Grosse-Corde, Chutes du Carbet, Morphy and the hot bath of Matouba), with the exception of sulphurated and/or salty hot waters of Sofaïa and the Anse-Thomas in Bouillante. The sequencing of the PCR products obtained were deposited in Genbank and confirmed that the Guadeloupean N. fowleri belonged to the Type-3 Euro-American, identical to that detected in the patient in 2008 (Moussa et al. 2013). The number of pathogenic amoebas varied from 2 to 30 amoebas / liter according to the baths, without exceeding the limit of 100 amoebas / liter recommended by the health authorities. In spite of this rather low concentration the baths require a regular surveillance. On the full year 2011-2012, the pathogenic species N. fowleri was the most frequently encountered species followed by N. lovaniensis and Hartmanella sp. These data of the surveillance led the ARS and the municipalities concerned to organize an awareness campaign destinated to the local and tourist population, based on the installation of prevention panels near the main sites where N. fowleri was found. The regular presence of N. fowleri during the year in most of the hot baths, especially the most frequented ones, leads us to look for the origin of their contamination. We discovered that geothermal springs are not contaminated at their emergence, but that amoebas come from the soil upstream the baths. This result which shows that soil is the natural reservoir of amoebas, allowed us to propose to the authorities effective means of prevention by installing pipes to carry the water from the emergence to the bath, without touching the soil.

Legionella est une bactérie pathogène, ubiquitaire des environnements aqueux. L'utilisation des eaux de surface, par les centrales nucléaires, provoque un réchauffement de ces eaux, qui associé aux conditions de fonctionnement peut entraîner sa prolifération. Afin de limiter le développement de cette bactérie, en deçà des seuils réglementaires, EDF met en œuvre un traitement à la monochloramine dans ses circuits. Notre étude a eu pour but d’améliorer les connaissances sur les associations entre les légionelles et leur principal hôte : les amibes, et sur les facteurs susceptibles d’influencer leur sensibilité au traitement biocide. Nous avons, tout d’abord, mis en évidence la permissivité de 12 souches d’amibes à 2 souches de L. pneumophila. La température est apparue comme le paramètre le plus influant, la prolifération de Legionella semble favorisée à 40°C. Puis, nous avons cherché à développer un protocole pour séparer Legionella selon son état d’association. Ce protocole n’est pas abouti à l’heure actuelle. Finalement, nous avons comparé la sensibilité, de Legionella, dans différents états physiologiques et étudié l’impact de la qualité de l’eau et des MES. Les cellules post-amibes et dans une moindre mesure, les cellules en phases stationnaires sont les moins sensibles. L’effet de la matrice a été mis en évidence pour l’eau de Vienne, par contre la sensibilité n’a pas été modifiée suite à l’élimination ou l’enrichissement en MES. Cette étude constitue une base de connaissances nouvelles pour orienter les choix de gestion du traitement anti-Legionella à la monochloramine et d’exploitation des circuits. / Legionella is a pathogenic gram negative bacterium, ubiquitously found in waterborne environment. The use of surface water, in open recirculating cooling circuits of nuclear power plants, causes a warming of these waters, which may cause proliferation of Legionella. To limit the development of this bacterium, under the legal thresholds, EDF implements a monochloramine treatment. The aim of our study was to improve the knowledge on the association between Legionella and their main host : amoebae, and on the factors that may influence their susceptibility to biocide treatment. We first showed the permissiveness of 12 strains of amoebae to 2 strains of L. pneumophila. Temperature is appeared as the most influential parameter, the proliferation of Legionella seems favored at 40°C. Then, we searched to develop a protocol to quantify Legionella according to its state of association. This protocol is not operational, yet. Finally, we compared the sensitivity of Legionella, under different physiological states and studied the impact of water quality and suspended matter. Post-amoeba cells and at a lesser extent, stationary cells, are the less sensitive. The effect of the matrix was demonstrated for the Vienne river water, on the other side the elimination or enrichment in suspended matter has not modified the sensitivity. This study provides a basis for a better knowledge to manage monochloramine treatment against Legionella, and for operating cooling systems.

Les amibes libres sont des microorganismes unicellulaires eucaryotes dont l'écologie au sein des réseaux d'eau potable est mal connue. Les amibes libres représentent un enjeu de santé publique, du fait de leur capacité à favoriser la présence de bactéries potentiellement pathogènes, parmi lesquelles des mycobactéries.Une campagne de prélèvement menée sur le réseau d'eau potable de Paris a permis d'évaluer la diversité des amibes libres et de leur microbiome bactérien, par pyroséquençage ciblant les gènes ribosomaux (16S et 18S). Ces analyses ont suggéré la prédominance des genres Acanthamoeba, Vermamoeba, Echinamoeba et Protacanthamoeba. Le microbiome des amibes a révélé une grande diversité bactérienne, dominée par Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bradyrhizobium, Sphingomonas et Pseudoxanthomonas. L'intégration des paramètres physicochimiques a permis de suggérer l'importance de l'origine de l'eau, la température, le pH et la concentration en chlore dans la dynamique des populations amibiennes. Une endosymbiose originale entre V. vermiformis et des bactéries du phylum TM6 a également été mise en évidence.Les amibes ont été fréquemment co-isolées avec des mycobactéries dans le réseau, principalement les espèces M. llatzerense et M. chelonae. Des expériences d'infection chez A. castellanii ont permis d'observer la capacité de ces mycobactéries à survivre et croitre en présence d'amibes. Par génomique comparative et analyses transcriptomiques, plusieurs facteurs de virulence, conservés entre M. llatzerense, M. chelonae et M. tuberculosis, ont été identifiés et sont surexprimés au cours de l'infection. Ces données suggérent leur implication dans la résistance à la prédation amibienne.L'ensemble de ces travaux a permis d'améliorer la connaissance des populations amibiennes et de leur microbiome au sein du réseau d'eau potable, apportant des éléments supplémentaires concernant leur implication dans la survie et la persistance des mycobactéries. / Free-living amoebae are unicellular eukaryotes whose ecology in drinking water networks remains poorly understood. They may represent a public health concern, because of their ability to favour the presence of potentially pathogenic bacteria, among which are mycobacteria.A sampling scheme based on Paris drinking water network allowed identifying the diversity of both freeliving amoebae and their bacterial microbiome, using ribosomal RNA targeted pyrosequencing. These analyses indicated the major presence of Acanthamoeba, Vermamoeba, Echinamoeba and Protacanthamoeba genera. The microbiome was highly diverse and dominated by Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bradyrhizobium, Sphingomonas and Pseudoxanthomonas. The coupling of physicochemical parameters to this analysis allowed underlining the importance of water origin, temperature, pH and chlorine concentration in shaping amoebal populations. Also an original endosymbiosis between V. vermiformis and a bacterium of the TM6 phylum was described. Free-living amoebae were frequently co-isolated with mycobacteria in the water network, mainly M. llatzerense and M. chelonae species. Infection experiments on A. castellanii illustrated the capacity of these species to resist and grow in presence of amoebae. Through genomics and transcriptomics approaches, several virulence factors, conserved between M. llatzerense, M. chelonae and M. tuberculosis were identified, and found to be upregulated during infection experiments. These results suggest their involvement in mycobacterial resistance to amoebal predation.Altogether, this work helped to better understand the ecology of free-living amoebae and their microbiome in drinking water networks, as well as the role of free-living amoebae in the survival and persistence of mycobacteria in such environments.

La contamination microbienne des units de soins dentaires (USD) est connue depuis les années 60. L'eau circule à l'intérieur des USD dans des conditions favorables au développement d'un biofilm (faible débit, nature des surfaces, stagnation). Ce biofilm, réservoir de micro-organismes potentiellement pathogènes, peut représenter un risque infectieux pour les patients et le personnel dentaire exposés à l'eau et aux aérosols générés lors des soins dentaires, en particulier s'ils sont immunodéprimés.Des micro-organismes provenant de l'eau, tels que les amibes libres, peuvent être retrouvés dans ce biofilm. Des protozoaires ubiquitaires de l'environnement du genre Acanthamoeba ou Hartmannella, connus comme pathogènes opportunistes chez l'Homme (kératites, méningo-encéphalites) et ayant la capacité de servir d'hôte pour le développement intracellulaire de certains microorganismes pathogènes (ex : Legionella pneumophila), ont en effet été isolés dans l'eau des USD.D'autre part, des micro-organismes provenant de la cavité buccale d'un patient peuvent également se retrouver dans le système d'eau des USD, en même temps que des traces de salive et/ou de sang, suite à un dysfonctionnement ou un mauvais entretien des valves anti-reflux des porte-instruments rotatifs. Les levures du genre Candida sont des commensaux du tube digestif humain, pathogènes opportunistes notamment responsables d'infections oro-pharyngées, et parfois retrouvées dans les USD.Ce travail a consisté d'une part en l'étude de la capacité de deux amibes libres : A. castellanii et H. vermiformis, ainsi que de trois espèces de Candida : C. albicans, C. glabrata et C. parapsilosis, à survivre dans l'eau, en présence ou non de salive. Les résultats montrent une influence dose-dépendante et espèce-dépendante de la salive sur la survie des trois levures, et aucun effet sur la viabilité des amibes. Des interactions ont pu être mises en évidence entre amibes libres et levures : A. castellanii est capable d'internaliser puis de digérer les trois espèces de levures, induisant leur élimination rapide, indépendamment de la présence de salive. En revanche, H. vermiformis permet la survie et la prolifération de Candida spp. dans l'eau, même en l'absence de salive.Enfin, dans une démarche de prévention et de lutte contre le risque infectieux lié à l'eau des USD, l'efficacité de différents traitements chimiques communément utilisés : le chlore (NaOCl), le peroxyde d'hydrogène (H2O2) et l'Oxygenal 6©, a été étudiée sur les différentes espèces de Candida et d'amibes libres. Ces traitements montrent une efficacité variable : le chlore requiert l'utilisation de concentrations élevées (>26 ppm) et peu compatibles avec l'usage courant des USD. Le H2O2 ne présente pas d'activité significative dans les conditions testées (de 0.07% à 0.9% v/v). En revanche, l'Oxygenal 6© apparaît le plus efficace pour l'éradication des levures du genre Candida et des amibes libres dans l'eau (dès 0.05%). / Microbial contamination of dental unit waterlines (DUW) is known since the 60's. Water circulates throughout DUW with environmental conditions encouraging biofilm development (low flow, surface material, stagnation). This biofilm, which is a reservoir of potentially pathogenic micro-organisms, may represent an infectious risk for patients and dental staff exposed to water and aerosols generated during dental cares, in particular for immunocompromised persons. Micro-organisms coming from water, such as free-living amoebae (FLA), may be isolated in this biofilm. Protozoa belonging to Acanthamoeba or Hartmannella genera are ubiquitous in the environment; they are known to be opportunistic pathogens for Human (keratitis, meningo-encephalitis), to encourage intracellular development of some pathogenic micro-organisms (for example: Legionella pneumophila), and they have already been isolated in DUW.On the other hand, micro-organisms coming from the oral cavity of an infected patient may also be isolated in DUW water, mixed with saliva traces and/or blood, mainly because of the dysfunction or the poor maintenance of anti-retraction valves. Candida yeasts colonize human's oral cavity and digestive tract as commensals or opportunistic pathogens, thus implicated in oro-pharyngeal infections; they are sometimes isolated in DUW.This work focused first on the study of the survival capacity of two species of FLA: A. castellanii and H. vermiformis, and three species of yeasts: C. albicans, C. glabrata and C. parapsilosis, in water, with or without saliva. Results showed that the addition of saliva permitted both survival and proliferation of all three tested Candida species whereas no effect was observed on FLA growth. Then, interactions have been demonstrated between FLA and yeasts: A. castellanii were able to internalize and then digest the three tested yeasts species, inducing their rapid degradation, independently of saliva presence. Conversely, H. vermiformis were able to promote Candida survival and proliferation in water, with or without saliva.Finally, in order to prevent and fight against infectious risk associated with DUW water, the efficacy of commonly used chemical treatments: chlorine (NaOCl), hydrogen peroxide (H2O2) and Oxygenal 6©, was studied against the three species of Candida and the two species of FLA. These treatments showed a variable efficacy: chlorine was effective only using the highest tested concentrations (> 14 ppm), which are not compatibles with DUW use. H2O2 displayed no significant activity in the experimental conditions (0.07% to 0.9% v/v). Oxygenal 6© seemed to be the more effective for eradication of Candida yeasts and FLA, in water (even with 0.05% v/v).

Cette thèse présente nouveaux organismes trouvés dans d'échantillons d'eaux usées proviennent la zone sud de Jeddah, en Arabie Saoudite. Legionella saoudiensis, Kaumoebavirus, moumouvirus saoudien (SDMV), Yasminevirus et Bunga messiliensis qui sont isolés par une méthode de co-culture amibienne d'infection par Dictyostelium discoideum ATCC 44841, Vermamoeba vermiformis CDC-19, Acanthamoeba polyphaga Linc AP-1 , et Acanthamoeba griffinii, respectivement. Legionella saoudiensis, une souche bactérienne Gram-négative, en forme de bacille, LS-1T appartient au genre Legionella de la famille des Legionellaceae, basée sur des séquences de gène 16S rRNA et d'autres 4 gènes (mip, rpoB, rnpB et 23S-5S). D'une part, le KAUmoebavirus a des capsides icosaédriques de ~ 250 nm-large, un génome d'ADN de 350 731 pb, et une densité de codage de 86%, correspondant à 465 gènes. La plupart de ces gènes (59%) sont étroitement liés aux gènes de Faustoviruses (43%) et Asfarviruses (23%). D'autre part, le moumouvirus saoudien est un nouveau virus géant appartenant à la lignée Mimivirus B, de l'hôpital universitaire King Abdulaziz à Djeddah, et a présenté des particules icosaédriques de 500 nm avec un génome de 1 046 087 pb, plus grand que les génomes moumouvirus qui ont été décrites dans le passé. Il a été prédit que son génome code pour 868 ORF, dont la taille varie de 54 à 2 914 acides aminés. En outre, il code pour 40 nouveaux gènes (ORFans) sans similitude avec d'autres séquences. Ces résultats montrent que la dispositiond’une carte élargie des protistes conduit à découvrir de nouveaux virus géants. / This thesis displays novel organisms that are found in sewage water samples from southern area of Jeddah, Saudi Arabia. These organisms are Legionella saoudiensis, Kaumoebavirus, Saudi moumouvirus (SDMV), Yasminevirus, and Bung messiliensis that are isolated by amoebal co-culture method of infection with Dictyostelium discoideum ATCC 44841, Vermamoeba vermiformis CDC-19, Acanthamoeba polyphaga Linc AP-1, and Acanthamoeba griffinii, respectively. Legionella saoudiensis, a Gram-negative, bacilli shaped bacterial strain, LS-1T belongs to the genus Legionella in the family Legionellaceae based on 16S rRNA gene sequences and other 4 genes (mip, rpoB, rnpB, and 23S-5S). On one hand, KAUmoebavirus has ~250-nm-large icosahedral capsids, a 350,731 bp DNA genome, and a coding density of 86%, corresponding to 465 genes. Most of these genes (59%) are closely related to genes from Faustoviruses (43%) and Asfarviruses (23%). On the other hand, Saudi moumouvirus is a new giant virus belonging to Mimivirus lineage B, from the King Abdulaziz University hospital in Jeddah, and presented 500 nm icosahedral particles with a 1,046,087 bp genome, which is larger than moumouvirus-like genomes which have been described in the past. Its genome was predicted to encode 868 ORFs, ranging in size from 54 to 2,914 amino acids. Furthermore, this genome was predicted to encode 40 new genes (ORFans) without similarity with other sequences. These findings show that the widen chart of protists apply lead to discover new giant viruses.