Les virophages sont des petits virus à ADN possédant une capside icosaédrique de 50-60 nm et un génome de 17 à 26 Kb codant potentiellement pour une vingtaine de gènes. Ils ont été découverts associés à des grands virus à ADN appartenant à l’ordre des Megavirales, pour lesquels leur présence serait délétère.Le premier projet du travail de thèse a été de faire le bilan des propriétés connues des virophages au travers d’une revue. La deuxième partie correspond à un bilan des avancées en matière d’isolement de virus géants dans les amibes – hôtes naturels des Mimiviridae –, pouvant être associés aux virophages. La troisième section se focalise sur la réplication des virophages Sputnik avec différents virus parmi les Mimiviridae, ainsi que sur l’isolement d’une nouvelle souche de Sputnik sans son hôte natif par l’utilisation d’un Mimiviridae en tant que virus rapporteur. La dernière partie est enfin basée sur l’identification d’un nouveau virophage – Zamilon – isolé en association avec un Mimiviridae du groupe C, et présentant une spécificité d'hôtes restreinte. Celle-ci est d'ailleurs étudiée.Les résultats présentés dans cette thèse démontrent une certaine complexité des interactions entre les virophages et leurs hôtes. Au sein d’une même famille d’hôtes, certains virophages possèdent un large spectre de spécificité, alors que d’autres ne peuvent se multiplier qu’avec certains d’entre eux, comme cela a déjà été observé chez les bactériophages. Compte-tenu de leur impact potentiel sur les virus géants, ces résultats soutiennent l’hypothèse d’une régulation des populations virales environnementales par les virophages. / Virophages are small DNA viruses with a 50-60 nm width icosahedral capsid encompassing a 17 to 26 Kb genome, putatively coding approximately 20 genes. They have been discovered in association with large DNA virus belonging to the order of the Megavirales, for which they are noxious.The first project of this thesis work was to recapitulate in a review the known features of the virophages. The second part corresponds to a summary of the advances in the field of giant viruses isolation in amoebas – the common hosts of Mimiviridae –. The third section is focused on the replication of the Sputnik virophages with viruses belonging to the Mimiviridae, and on the isolation of a new Sputnik strain with a Mimiviridae reporter instead of with its natural viral host. Finally, the last part is based on the identification of a new virophage – Zamilon – isolated in combination with a group C Mimiviridae, and exhibiting a restricted spectrum of specificity. The latter is herein studied.The results described herein show the complexity of the interactions between virophages and their giant hosts viruses. Within the same host family, some virophages have a broad-range host spectrum whereas others are limited to some viruses, a feature already described for bacteriophages. Regarding the potential impact of the virophages over their host viruses, these results support the hypothesis of a virophages’ major role in a regulation of viral populations in environment.

Mimivirus est le 1er virus géant découvert. Quelques années plus tard une nouvelle entité́ biologique a été décrite, les virophages. Si leurs principales caractéristiques sont maintenant bien définies et acceptées, leur position dans le monde viral ainsi que les interactions qu’ils pourraient avoir avec leur virus-hôte sont encore discutées. La famille des virophages s’élargit. Dans cette optique, le premier objectif de thèse a été de faire un bilan des propriétés connues des virophages au travers d’une revue de la littérature scientifique. La deuxième section repose sur l’analyse des bases de données métagénomiques à la recherche de séquences de virophages et de Megavirales. En criblant le métagénome Bioreactor, nous avons détecté des séquences étroitement liées au virophage Zamilon. Le génome de ce dernier a été décrit et partiellement assemblé. La troisième partie du travail est basée sur l’étude des interactions entre les Mimiviridae et les virophages. Nous avons observé́ qu’un groupe de mimivirus a développé́ une résistance contre l’infection par le virophage Zamilon. C’est en essayant de comprendre ce mécanisme de résistance jusque-là inconnu dans le monde viral que nous avons décrit pour la première fois un système de défense appelé MIMIVIRE. Enfin, la dernière partie est centrée sur l’étude d’une protéine impliquée dans la traduction chez les mimivirus. Les résultats de ce travail suggèrent que cette protéine régule l'expression d’autres protéines virales. Les éléments inédits présentés dans cette thèse contribuent à soutenir l’idée de l’existence d’une quatrième branche du vivant, distincte des 3 domaines connus. / Mimivirus is the first largest virus described. Some years later, virophage, a new biological entity has been discovered. Virophage is a small virus able to infect other giant viruses for which the presence can be deleterious. If their main features have been widely accepted, their position in the viral world and their interactions with host’s viruses are still discussed. The family of virophages is expanding. The first objective of this thesis work was to summarize the known proprieties and features of virophages through a review paper. The second part refers to the analysis of metagenomic databases in search of virophage and Megavirales sequences. By screening the Bioreactor metagenome, we detected sequences closely related to Zamilon virophage.The genome has been described and partially assembled. The third part was based on the study of the interactions between giant viruses and virophages. We observed that some mimiviruses have developed a resistance against the infection by Zamilon virophage. To understand this mechanism of resistance, we described for the first time a viral defense system called MIMIVIRE. Finally, the last part was focused on the study of a protein involved in the translation apparatus of mimivirus. The results of this study suggest for the first time that a translational protein in mimivirus regulates the expression of their proteins.The results described herein show the potential impact of virophages on their viral hosts and also the complexity of the genetic content of giant viruses. Considering all these elements, we can support the hypothesis that giant viruses belong to a new domain of life, in complement to eukaryotes, bacteria and algae.

Les virus sont ubiquitaires et abondants dans l’environnement. Ils influent fondamentalement sur l’écologie de l’ensemble des écosystèmes et du microbiote humain. Dès 2002, avec la découverte de virus géants d’amibes, la virologie s’est complexifiée. Les Megavirales (nouvel ordre au sein des grands virus nucléocytoplasmiques) ont 10% de gènes homologues aux cellules eucaryotes, et ont la caractéristique singulière d’être infectés par des virophages.Avec l’avènement de la métagénomique, le nombre de métagénomes produits ne cesse de croître de manière exponentielle. C’est ainsi que la virologie a connu un nouvel essor et a pu mieux être étudiée en s’affranchissant des difficultés de culture et d’isolement des virus dans les conditions artificielles de laboratoire. La métagénomique permet d’étudier les communautés microbiennes mais également de découvrir de nouveaux microbes. La bioinformatique est devenue incontournable dans le domaine de la biologie et essentielle pour les biologistes afin de traiter les masses de données et en extraire toute la richesse de l’information biologique nécessaire. La première partie de cette thèse consiste en une revue de la littérature décrivant la bioinformatique au service de la métagénomique virale. La deuxième partie présente la création d’un nouvel outil « MG-Digger » dédié à l’analyse rapide et automatisée de séquences d’intérêts spécifiques dans les métagénomes. La dernière partie se concentre sur l’utilisation de cet outil sur des données issues de projets métagénomiques afin de répondre à des questions biologiques précises, notamment sur les données de l’expédition scientifique TARA à travers les océans. / Viruses are ubiquitous and abundant in the environment and can influence all ecosystems ecology and the human microbiota.Since 2002, with the discovery of giant viruses of amoeba, virology has become more complex and the definition of virus has been called into question, not only because of their phenotypic sizes similar to those of bacteria but also their genomic content exceeding thousand genes. Megavirales, also known as nucleocytoplasmic large DNA viruses, have 10% homologous genes to eukaryotic cells and interestingly can be infected by virophages. With the advent of metagenomic, the number of metagenomes produced is exponentially increasing as well as our understanding of virology which has been studied. Metagenomics studies showed an efficient way to study microbial communities and identify novel viruses without the difficulties of culture and isolation of viruses in artificial laboratory conditions.Metagenomic requires considerable computational and storage resources (Big data processing). Therefore, bioinformatics has become an integral part of research and development in the biomedical sciences by providing tools that handle complex datasets and finally giving the necessary biological information. The first part of this thesis consists of an exhaustive review of the literature describing bioinformatics and viral metagenomics. The second part presents a new "MG-Digger" tool dedicated to the rapid and automated analysis of specific interest sequences in metagenomes. The third part focuses on the use of this tool on metagenomic data to answer to specific biological questions, including data from the TARA scientific expedition across the oceans.

La découverte de virus géants avec une taille de génome géante et des caractéristiques génomiques surprenantes soulève différentes questions sur leur origine et leur évolution. De nombreuses études phylogénétiques ont souligné le rôle décisif des HGT et des échanges génétiques sur l'évolution des MV, mais la plupart d'entre eux sont basés sur des familles MV étroitement liées. Pour enquêter sur les événements HGT, nous avons déterminé la distribution des gènes et les phylogénies de gènes pour les 86 ORFomes MV complets classés dans 6 familles définies et 4 putatives, dans le cadre de leurs homologues d'autres domaines de la vie. À l'aide d'un flux de travail phylogénétique automatisé MimiLook, 4577 OG ont été détectés, dont 91% des OG ont été jugés spécifiques à la famille, alors que 9% sont représentés par des protéines de 2 familles MV ou plus. 414 OG ont été détectés comme événement HGT. Nous avons appliqué une procédure similaire aux 7 898 protéines non orthologues pour détecter les événements de transfert et identifié 259 HGT à partir de protéines non orthologues. Les cas de HGT révèlent la spécificité des donneurs. En conclusion, une distinction claire peut être observée dans le mosaïque du génome des familles de Megavirale éloignées, où elles ont évolué par spécificité génomique et acquisitions de gènes spécifiques à la famille de leur créneau écologique respectif. Notre recherche systématique d'événements HGT d'origine non-mégavirale fournit la première estimation de la contribution totale de HGT dans le mosaïque du génome spécifique à la famille des Megavirales éloignés. / Discovery of giant viruses with giant genome size and surprising genomic features raises different question about their origin and evolution. Many phylogenetic studies have pointed out decisive role of HGTs and genetic exchanges on evolution of MVs, but, majority of them are based on closely related MV families. To investigate HGT events, we have determined gene distributions and gene phylogenies for the 86 complete MV ORFomes classified in 6 defined and 4 putative families, in context of their homologs from other domains of life. Using an automated phylogenetic workflow MimiLook, 4577 OGs were detected, out of which, 91% of OGs were found to be family specific, whereas, 9% are represented by proteins from 2 or more MV families. 414 OGs were detected as HGT event. We applied a similar procedure to the 7,898 non-orthologous proteins to detect transfer events and identified 259 HGTs from non-orthologous proteins. Instances of HGT were found to be depicting donor specificity, as viruses of vertebrates/invertebrates acquired genes from donors like Euteleostomii, Eutheria, Baculoviridae and proteobacteria; algal viruses and protozoan viruses were found to be acquiring genes from donors like Dictyostellium, Mammeillales, Firmicutes, Clostridiales. In conclusion, clear distinction can be seen in the genome mosaicism of distantly related Megavirale families, where they evolved via genome specificity and family specific gene acquisitions from their respective ecological niche. Our systematic search for HGT events of non-megavirale origin provides the first estimate of the total contribution of HGT in family specific genome mosaicism of distantly related Megavirales.

Les membres des familles Mimiviridae et Marseilleviridae, qui infectent et se répliquent dans Acanthamoeba spp. et d’autres protistes phagocytaires, ont été découverts au cours de la dernière décennie et rattachés à un groupe monophylétique de virus nommés les grands virus à ADN nucléocytoplasmiques (NCLDVs), qui infectent un large éventail d’eukaryotes y compris différents organismes unicellulaires. Récemment, il a été proposé de reclasser les NCLDVs dans un nouvel ordre viral nommé les Megavirales. Plusieurs dizaines de virus géants des amibes ont été isolés, mais le génome de peu d’entre eux a été étudié de façon approfondie. Nous avons étudié les génomes de ces virus géants d'amibe afin d’acquérir une meilleure compréhension de leur répertoire de gènes et leur importance évolutionnaire. L'analyse phylogénétique des virus géants d'amibe distingue clairement trois lignées, nommées A, B et C. Nous avons étudié en détail le génome de Acanthamoeba polyphaga moumouvirus, le membre fondateur de la lignée B et avons déchiffré son contenu en gènes et sa relation évolutive avec d'autres organismes. Nous avons également étudié les génomes de Terra1 virus et Terra2 virus, qui appartiennent respectivement aux lignées C et A, et ont été isolés à partir d'échantillons de sol alors que les mimivirus décrits aupravant ont été isolés à partir d'eau douce ou de mer. En outre, nous avons décrit le génome du virus Courdo11, qui appartient à la lignée C, et est étroitement lié au premier Mimivirus isolé d'un humain, qui présentait une pneumonie inexpliquée. / The members of families Mimiviridae and Marseilleviridae, which infect and replicate in Acanthamoeba spp. and other phagocytic protists, were discovered during the past decade and linked to a monophyletic group of viruses named the Nucleocytoplasmic Large DNA viruses (NCLDVs), which infect a broad variety of eukaryotes including diverse unicellular organisms. Recently, it has been proposed to reclassify the NCLDVs into a new viral order named the Megavirales. Several dozens of giant viruses of amoeba have been isolated but the genome of very few has been extensively studied. We studied the genomes of these giant viruses of amoeba to gain a better understanding of their gene repertoire and evolutionary importance. The phylogenetic analysis of giant viruses of amoeba clearly distinguished three lineages, named lineages A, B and C. We studied in detail the genome of Acanthamoeba polyphaga moumouvirus, the leader member of lineage B to decipher its gene content and its evolutionary relationship with other organisms. We further studied the genomes of Terra1 virus and Terra2 virus, which belong to lineages C and A, respectively, and were isolated from soil samples whereas previously described mimiviruses of amoeba were isolated from fresh or marine water. Furthermore, we described the genome of Courdo11 virus, which belongs to lineage C, and is closely related to the first mimivirus isolated from a human, who exhibited unexplained pneumonia.

Les virus géants sont un groupe de virus ADN double brin caractérisés par une taille géante du virion et du génome, et un répertoire de gènes qui comprend environ 450 à 2500 gènes prédits. Une proportion importante de ces gènes (jusqu'à 93%) sont des 'ORFans', ou codent pour des protéines de fonction inconnue. Acanthamoeba polyphaga mimivirus est le premier virus géant découvert, il y a une décennie, par co-culture sur Acanthamoeba spp. Il est le membre prototype de la famille Mimiviridae. Le génome de Mimivirus code pour environ 1000 protéines, parmi lesquelles ~50% n'ont pas d'homologue connu dans les banques de séquences publiques. La capside de Mimivirus a un diamètre d'environ 500 nm et est couverte par une couche dense de fibres, à l'exception de l'un de ses sommets. Ces fibres sont d'environ 130 nm de longueur et se composent d'une tige souple et d'une tête de forme globulaire.Dans ce travail de thèse, nous avons cherché à étudier les gènes impliqués dans la formation des fibres de Mimivirus. Dans ce but, nous avons notamment exprimé des gènes candidats dans E. coli, et nous avons mis au point une stratégie qui a utilisé l'interférence ARN afin d'étudier la fonction et la structure des protéines de Mimivirus. Nous avons annoté quatre protéines associées aux fibres. La stratégie utilisant les petits ARN interférant appliquée ici est originale et a été utilisée pour la première fois pour les virus géants qui infectent les amibes. Elle pourrait permettre de décrypter la fonction des gènes des mimivirus et d'annoter potentiellement des centaines de protéines présentes dans les bases de données publiques, et de différencier l'ADN poubelle des gènes réellement utilisés. / Giant viruses are a group of double stranded DNA viruses that are characterized by a giant virion and genome size, and gene repertoires encompassing approximately 450 to 2500 predicted genes. A substantial proportion of these genes (up to 93%) consists in ORFans, or encodes proteins with unknown functions. Acanthamoeba polyphaga mimivirus is the first giant virus that was discovered, a decade ago, after co-culturing on Acanthamoeba spp. It is the prototype member of the family Mimiviridae. Mimivirus encodes about 1000 proteins, among which ~50% have no known homolog in public sequence databases. The Mimivirus capsid is about 500 nm in diameter and is covered by a dense layer of fibers, except at one of its vertices. These fibers are about 130 nm in length and consist of a soft shaft and a globular shaped head.In this thesis work, we aimed to study the genes involved in the formation of the Mimivirus fibers. For this purpose, we have expressed candidate genes in E. coli, and implemented a strategy that used RNA interference to study the function and structure of Mimivirus proteins. We then succeeded in annotating four proteins as fiber associated proteins. The short interfering RNA strategy that we applied here is original and has been used for the first time in giant viruses that infect amoeba. It could allow deciphering the function of the mimivirus gene repertoires and help annotating hundreds of proteins without known function found in public databases and differentiate between junk DNA and truly used genes.

Les virus géants d'amibes( Acanthamoeba) sont des virus à ADN double brin . Ces virus géants ont été isolés depuis 2008 essentiellement à partir de prélèvements d'eaux et sols) collectés dans diverses régions géographiques à travers le monde, ou à partir de prélèvements humains (selle, liquide broncho-alvéolaire et sang). Ils sont repartis en 4 familles virales dont les plus représentées sont les familles Mimiviridae et Marseilleviridae avec pour membres fondateurs respectifs Mimivirus et Marseillevirus et comptent à ce jour respectivement 44 et 20 isolats. Les virus géants d'amibes sont ubiquitaires dans notre biosphère, et les êtres humains y sont potentiellement exposés. Au cours de cette Thèse, nous avons premièrement écrit une revue de la littérature décrivant les outils de mise en évidence des virus géants d'amibes chez l'homme incluant la sérologie, la culture, la PCR ou l'hybridation de sondes fluorescentes in situ. Deuxièmement, nous avons conçu et évalué 5 systèmes de PCR en temps réel détectant les membres des groupes de mimivirus d'amibes, leurs virophages et les marseillevirus. Nous avons participé à un 3ème travail décrivant les différentes procédures d'isolement sur amibes utilisées jusqu'à présent dans notre laboratoire . Enfin, dans un 4ème travail préliminaire, nous avons recherché par PCR la présence des mimivirus et marseillevirus dans 701 plasmas de patients infectés par HIV-1.Au total, nos travaux ont décrit les mises au point, performances et limites des tests de PCR pour l'étude des virus géants, et ont contribué aux outils et fourni des éléments pour l'étude de l'implication des virus géants d'amibes en pathologie humaine. / The giant viruses of amoebas( Acanthamoeba) are double stranded DNA viruses. These giant viruses have been isolated essentially from water and soil samples collected in various geographic regions around the world or from human samples (stool, blood and bronchoalveolar fluid). These giant viruses are divided into four viral families among which those comprising the largest number of representatives are the Mimiviridae and Marseilleviridae families, whose respective founders are Mimivirus and Marseillevirus and comprise 44 and 20 representative members, respectively. Giant viruses of amoeba are ubiquitous in our biosphere, which means that humans can be exposed to them. In this Thesis, we initially wrote a review of the literature describing the tools to detect the present of these giant viruses in humans, including serology, culture isolation, PCR and fluorescence in situ hybridization (FISH). Secondly, we designed and evaluated the performance of five real-time PCR systems targeting the members of the 3 groups of mimiviruses of amoeba, their virophages and the marseilleviruses. We were involved in a third work that described the different isolation procedures on amoebae used so far in our laboratory for giant viruses. Finally, in a fourth preliminary work, we looked by PCR for the presence of mimiviruses and marseilleviruses DNA in 701 plasma from patients infected with HIV-1. In summary, our work described the developed PCR assays for the study of giant viruses, and their performance and limitations, and it contributed to the tools and evidence for the study of the involvement of the giant amoeba virus in human pathology.

Les Megavirales appartiennent à des familles de virus géants infectant un grand nombre d'hôtes eucaryotes. Leurs génomes ont des tailles variant de 100 kb to 2.5 mb et leur composition a montré des caractéristiques surprenantes qui ont soulevées diverses questions sur l’origine et l’évolution de ces virus. Les études de métagénomique environnementale ont montré qu’il existe une «matière noire», composée de séquences reliées à aucun organisme connu. Cependant, l'identification des séquences a été principalement réalisée en utilisant les séquences ADN ribosomal (ADNr), ce qui conduit à ignorer les virus. D’autres gènes informationnels « cœur », incluant la DNA-dependant RNA polymerase (RNAP) constituent d'autres marqueurs qui apparaissent comme plus appropriés pour une classification plus exhaustive des séquences, puisqu’ils apparaissent conservés dans les organismes cellulaires ainsi que les mégavirus. Nous avons utilisé un petit ensemble de gènes universels conservés incluant la RNAP et avons reconstruit des séquences ancestrales pour rechercher des séquences reliées aux mégavirus dans les bases de données. Cela a permis d’identifier trois nouvelles séquences de megavirus qui avaient été mal annotées comme correspondant à des organismes cellulaires, ainsi que de nouveaux clades viraux dans les bases métagénomiques environnementales. De plus, nous avons montré que l’ordre Megavirales constituait une quatrième branche monophylogénétique ou « TRUC » (pour Things Resisting Uncompleted Classification). Nos analyses montrent également que la RNAP ainsi que quelques autres gènes utilisés dans nos études permettent de considérer un répertoire plus complet d’organismes que l’ADNr. / Nucleocytoplasmic large DNA viruses (NCLDVs), or representatives of order Megavirales, belong to families of giant viruses that infect a large number of eukaryotic hosts. These viruses genomes size ranges from 100 kb to 2.5 mb and compose surprising features, which raised various questions about their origin and evolution. Environmental metagenomic studies showed that there is a “dark matter”, composed of sequences not linked to any known organism. However sequence identification was mainly determined using ribosomal DNA (rDNA) sequences, which led therefore to ignore viruses, because they are devoid of such genes. Informational genes, including DNA-dependant RNA polymerase (RNAP), are other markers that appear as more appropriate for a comprehensive classification as they are conserved in cellular organisms (Bacteria, Archaea and Eukarya) and in Megavirales. We used a small set of universally conserved genes that included RNAP and reconstructed ancestral sequences to search for megavirus relatives in sequence databases and to perform phylogeny reconstructions. This allowed identified three megaviral sequences that were misannotated as cellular orgainsms, and new viral clades in environmental databases. In addition, we delineated Megavirales as a fourth monophylogenetic TRUC (things resisting uncompleted classification) aside cellular organisms. Moreover, we classified by phylogenetic and phyletic analyses based on informational genes new giant viruses as new bona fide members of the fourth TRUC. Our analyses shows that RNAP as well as a few other genes used in our studies allow a more comprehensive overview and classification of the biological diversity than rDNA.