L’objectif de cette thèse était d’isoler de nouveaux Mimiviridae dans l’environnement marin à l’aide d’amibes, hôtes potentiels de ces derniers et surtout organismes ubiquistes phagocytaires et connus pour être parasités par des microorganismes pathogènes. Après la mise en place et la validation de protocoles d’échantillonnages et de mise en culture de prélèvements environnementaux, plusieurs échantillons ont été analysés. Un nouveau membre de la famille des Mimiviridae a été isolé à partir d’un échantillon marin côtier provenant du Chili, stocké dans un milieu enrichi en amidon (milieu riz, propice à la conservation voire à la production de virus) puis mis en coculture dans une souche d’amibe Acanthamoeba griffini. Le séquençage de son génome révèle 1260 kb, codant pour 1120 protéines putatives, ce qui en fait le plus grand génome viral connu. Nommé megavirus chiliensis, sa capside est icosaédrique et possède également des fibrilles comme Acanthamoeba polyphaga mimivirus tout en étant plus grande (diamètre apparent 520 nm vs 450 nm). Bien que les morphologies des deux virus soient similaires et que de nombreuses particularités de mimivirus soient conservées chez megavirus (stargate), 23 % des protéines de megavirus n’ont pas d’homologues chez mimivirus, et les 594 gènes orthologues partagés présentent une identité résiduelle moyenne de 50 %. De plus, megavirus présente 3 amino-acyl-ARNt-synthètases supplémentaires (IleRS, TrpRS et AsnRS) à celles de mimivirus. Ces résultats suggèrent que ces deux virus sont issus d’un génome cellulaire ancestral qui a évolué par réduction génomique. Un parasite intracellulaire obligatoire a également été isolé à partir d’échantillons de sédiments marins de la côte chilienne. Des observations au microscope électronique à transmission indiquent une forme ressemblant à une endospore, de taille très variable (de 400 nm jusqu’à 1 μm), avec une paroi multicouche épaisse (~60 nm) et un pore apical. Cependant, aucune évidence de division n’a encore été observée, laissant penser que cette entité capable de multiplication pourrait être un virus, sans ressembler aux morphologies connues à ce jour. / In order to isolate new Mimiviridae from the marine environment, we used amoeba -ubiquitous phagotrophic protozoa - as potential host for these viruses. Different sampling protocols were tested and validated before carrying out co-cultures with amoeba and environmentals samples. A new Mimiviridae giant virus was isolated from Chilean coastal seawater completed with rice media (enriched incubation). Produced in Acanthamoeba griffini, its genome sequence has 1,260 Mbp and encodes for 1120 putative proteins, making it the largest known viral genome and thus named Megavirus chiliensis. Its icosaedral capsid is covered with fibrils and its size is bigger than that of Acanthamoeba polyphaga mimivirus (520 nm vs 450 nm). Although both virions are very similar and most of the mimivirus idiosyncrasies are conserved in megavirus (stargate), 23 % of megavirus putative proteins have no mimivirus homologs. Both viruses share 594 orthologous proteins exhibiting an average identity of 50 %. Moreover, megavirus contains 3 additional amino-acyl tRNA synthetases (IleRS, TrpRS and AsnRS) compare to mimivirus. These results suggest that these viruses have evolved from an ancestral cellular genome by reductive evolution. In addition, an amoeba obligatory intracellular parasite was isolated from marine sediments from Chilean coast. Transmission electron microscopic images show a particule like endospore with variable size (from 400 nm to 1 µm), a multilayered outer wall (~60 nm) and an apical pore. No evidence of division was observed, suggesting that the multiplication of this endoparasite occurs without division, suggesting that it could be a virus without any similarity to those described today.

Les virus géants sont un groupe de virus ADN double brin caractérisés par une taille géante du virion et du génome, et un répertoire de gènes qui comprend environ 450 à 2500 gènes prédits. Une proportion importante de ces gènes (jusqu'à 93%) sont des 'ORFans', ou codent pour des protéines de fonction inconnue. Acanthamoeba polyphaga mimivirus est le premier virus géant découvert, il y a une décennie, par co-culture sur Acanthamoeba spp. Il est le membre prototype de la famille Mimiviridae. Le génome de Mimivirus code pour environ 1000 protéines, parmi lesquelles ~50% n'ont pas d'homologue connu dans les banques de séquences publiques. La capside de Mimivirus a un diamètre d'environ 500 nm et est couverte par une couche dense de fibres, à l'exception de l'un de ses sommets. Ces fibres sont d'environ 130 nm de longueur et se composent d'une tige souple et d'une tête de forme globulaire.Dans ce travail de thèse, nous avons cherché à étudier les gènes impliqués dans la formation des fibres de Mimivirus. Dans ce but, nous avons notamment exprimé des gènes candidats dans E. coli, et nous avons mis au point une stratégie qui a utilisé l'interférence ARN afin d'étudier la fonction et la structure des protéines de Mimivirus. Nous avons annoté quatre protéines associées aux fibres. La stratégie utilisant les petits ARN interférant appliquée ici est originale et a été utilisée pour la première fois pour les virus géants qui infectent les amibes. Elle pourrait permettre de décrypter la fonction des gènes des mimivirus et d'annoter potentiellement des centaines de protéines présentes dans les bases de données publiques, et de différencier l'ADN poubelle des gènes réellement utilisés. / Giant viruses are a group of double stranded DNA viruses that are characterized by a giant virion and genome size, and gene repertoires encompassing approximately 450 to 2500 predicted genes. A substantial proportion of these genes (up to 93%) consists in ORFans, or encodes proteins with unknown functions. Acanthamoeba polyphaga mimivirus is the first giant virus that was discovered, a decade ago, after co-culturing on Acanthamoeba spp. It is the prototype member of the family Mimiviridae. Mimivirus encodes about 1000 proteins, among which ~50% have no known homolog in public sequence databases. The Mimivirus capsid is about 500 nm in diameter and is covered by a dense layer of fibers, except at one of its vertices. These fibers are about 130 nm in length and consist of a soft shaft and a globular shaped head.In this thesis work, we aimed to study the genes involved in the formation of the Mimivirus fibers. For this purpose, we have expressed candidate genes in E. coli, and implemented a strategy that used RNA interference to study the function and structure of Mimivirus proteins. We then succeeded in annotating four proteins as fiber associated proteins. The short interfering RNA strategy that we applied here is original and has been used for the first time in giant viruses that infect amoeba. It could allow deciphering the function of the mimivirus gene repertoires and help annotating hundreds of proteins without known function found in public databases and differentiate between junk DNA and truly used genes.

La co-culture d’amibes est utilisée afin d’isoler des microorganismes. Ainsi le premier virus géant,fut découvert. Cependant, les méthodes de culture sur protozoaires sont délicates et fastidieuses. De ce fait, le développement de ces cultures représente une difficulté pour les microbiologistes, limitant ainsi l’analyse d’un nombre important d’échantillons et la caractérisation de nouveaux virus. De nouvelles stratégies et des améliorations des modèles actuels sont donc nécessaires. Notre travail a été de développer de nouvelles stratégies permettant l’isolement de microorganismes associés aux amibes. Dans la 1ere partie nos travaux ont permis une amélioration des cultures avec le développement de nouveaux milieux de culture et l’utilisation ciblée d’antimicrobiens.La clé de ces stratégies est l’association des techniques rapides aux étapes améliorées de culture et leur application à un large panel de protozoaires pouvant abriter des microorganismes. Les résultats ont permis le développement d’un système d’isolement à haut débit très efficace. Nous avons notamment mis au point des techniques de tri de virus géants par cytométrie.Dans la seconde partie, nos travaux ont porté sur la description et la caractérisation des nouveaux isolats.Les résultats obtenus démontrent l’importance de poursuivre l’isolement et la caractérisation de ces microorganismes afin de mieux appréhender l’évolution de ces microorganismes, leur biotope et leur pathogénicité.De nouveaux outils sont nécessaires,notre manque d’imagination et l’absence de systèmes automatisés seront les limites aux nouvelles stratégies dans le monde de la microbiologie. / Amoebae are predators without distinction and they can also act as hosts to several different microorganisms that may coexist simultaneously. Some protozoa are sources of human pathogens where they act as reservoir of any human pathogens like Legionellae, Chlamydiaceae and others. In addition, the first giant virus, Acanthamoeba Polyphaga imivirus, was discovered using Amoeba as cell host. Since then, many other giant viruses have been isolated. For decades, amoebae were used as cell hosts in the culture- based process to isolate microorganisms, and allowed to recover new giant viruses and bacterial species from human and environmental samples. In contrast the co-culture system with protozoa is tedious and fastidious. Microbiologists are limited to routine culture methods, limiting by this the speed of screening potential samples and the efficiency of yielding new isolates. Much effort and improvement were needed. Our work consisted in the development of new strategies and techniques for the isolation of new microorganisms associated to protozoa. In the first part of this work, we described, all the improvements we brought to the protists culture system for the isolation of intracellular microorganisms especially giant viruses and Chlamydiaceae. Major improvements were based on modified culture enrichment steps, adapted culture media, and targeted use of specific drugs. The key of this new strategy was the implementation of high-throughput technologies to the ameliorated culture based systems, and the application of this later to a wide panel of protozoa used as potential host cells. These presented advances and strategies demonstrated significant time saving, and higher sensitivity than older techniques, they considerably increased the potential of collecting new environmental or clinical isolates and also new undiscovered microorganisms especially new giant virus familiesand particular Chlamydiaceae associated to amoebae. We continued to ameliorate the efficiency of the flow cytometric technology by reviewing its contributions to the virology field, then by applying it to the isolation system by sorting the new isolates as a new strategy for better genomic and proteomic analysis. In the second part of this work, we focused on the characterization of new isolates at the level of developmental cycle and genomic description. We used electron microscopy, and genome sequencing as main tools to describe our newly isolated giant viruses but also report new species of Chlamydiaceae and managed to decipher Chlamydiaceae species with a host dependent replication cycle, an issue that has not, thus far, been observed in protozoa-associated Chlamydiaceae. The strategies and results described herein show the importance of pursuing the isolation of new associatedamoebal microorganisms in order to give rise to new insights into the evolution of these microorganisms, their respective biotopes, and their potential or hidden pathogenicity. The more we need to search the more tools are needed, only our lack of imagination and appropriate automated systems will put limits on any needed strategy in the field of microbiology.

Les virus géants d'amibes( Acanthamoeba) sont des virus à ADN double brin . Ces virus géants ont été isolés depuis 2008 essentiellement à partir de prélèvements d'eaux et sols) collectés dans diverses régions géographiques à travers le monde, ou à partir de prélèvements humains (selle, liquide broncho-alvéolaire et sang). Ils sont repartis en 4 familles virales dont les plus représentées sont les familles Mimiviridae et Marseilleviridae avec pour membres fondateurs respectifs Mimivirus et Marseillevirus et comptent à ce jour respectivement 44 et 20 isolats. Les virus géants d'amibes sont ubiquitaires dans notre biosphère, et les êtres humains y sont potentiellement exposés. Au cours de cette Thèse, nous avons premièrement écrit une revue de la littérature décrivant les outils de mise en évidence des virus géants d'amibes chez l'homme incluant la sérologie, la culture, la PCR ou l'hybridation de sondes fluorescentes in situ. Deuxièmement, nous avons conçu et évalué 5 systèmes de PCR en temps réel détectant les membres des groupes de mimivirus d'amibes, leurs virophages et les marseillevirus. Nous avons participé à un 3ème travail décrivant les différentes procédures d'isolement sur amibes utilisées jusqu'à présent dans notre laboratoire . Enfin, dans un 4ème travail préliminaire, nous avons recherché par PCR la présence des mimivirus et marseillevirus dans 701 plasmas de patients infectés par HIV-1.Au total, nos travaux ont décrit les mises au point, performances et limites des tests de PCR pour l'étude des virus géants, et ont contribué aux outils et fourni des éléments pour l'étude de l'implication des virus géants d'amibes en pathologie humaine. / The giant viruses of amoebas( Acanthamoeba) are double stranded DNA viruses. These giant viruses have been isolated essentially from water and soil samples collected in various geographic regions around the world or from human samples (stool, blood and bronchoalveolar fluid). These giant viruses are divided into four viral families among which those comprising the largest number of representatives are the Mimiviridae and Marseilleviridae families, whose respective founders are Mimivirus and Marseillevirus and comprise 44 and 20 representative members, respectively. Giant viruses of amoeba are ubiquitous in our biosphere, which means that humans can be exposed to them. In this Thesis, we initially wrote a review of the literature describing the tools to detect the present of these giant viruses in humans, including serology, culture isolation, PCR and fluorescence in situ hybridization (FISH). Secondly, we designed and evaluated the performance of five real-time PCR systems targeting the members of the 3 groups of mimiviruses of amoeba, their virophages and the marseilleviruses. We were involved in a third work that described the different isolation procedures on amoebae used so far in our laboratory for giant viruses. Finally, in a fourth preliminary work, we looked by PCR for the presence of mimiviruses and marseilleviruses DNA in 701 plasma from patients infected with HIV-1. In summary, our work described the developed PCR assays for the study of giant viruses, and their performance and limitations, and it contributed to the tools and evidence for the study of the involvement of the giant amoeba virus in human pathology.