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Human RNA bait library depletion for human (viral) pathogen discovery using shotgun metagenomic sequencing / Déplétion de la contamination de l'hôte utilisant la technique de capture par hybridation sur sondes spécifiques pour l'identification de pathogènes humains par métagénomique en séquençage direct

Gaudin, Maxime 23 November 2018 (has links)
La métagénomique virale est une approche prometteuse pour la détection et l’identification sans a priori de potentiels nouveaux pathogènes.Cependant, son utilisation reste encore marginale en raison de l’importante contamination des viromes par les séquences nucléiques de l’hôte.L'objectif de cette thèse était d’améliorer l’approche de métagénomique pour le diagnostic clinique de maladies infectieuses virales en augmentant le ratio de séquences pathogène/hôte par déplétion des acides nucléiques humains.Le premier chapitre consiste en une synthèse bibliographique des approches de métagénomique virale en recherche clinique et des challenges à relever dans ce domaine. Elle inclut également une revue sur les approches de capture/séquençage ciblées de certains pathogènes dans le domaine des maladies infectieuses humaines.Le deuxième chapitre propose une mise au point méthodologique permettant d’enrichir les métagénomes en séquences non-humaines basée sur l’hybridation et la capture de l’ensemble des acides nucléiques de l’hôte après hybridation avec des sondes ARN humaines biotinylées.Le troisième chapitre est divisé en deux sous-chapitres qui proposent l’application de ce protocole à la détection d’agents potentiellement impliqués (1) dans un cas fatal d’encéphalite et (2) dans un cas énigmatique d’endocardite infectieuse à hémoculture négative.Dans un quatrième chapitre, l’approche méthodologique que nous avons développée est discutée et les résultats sont replacés dans un contexte élargi d’émergence des maladies infectieuses et de lien de causalité entre l’agent détecté et la pathologie observée. / Viral metagenomics, which is based on the random shotgun sequencing of all viral genomes present in a sample, is a promising approach for blind detection and identification of potential new pathogens. Its use is however still marginal because of the large proportion of human nucleic sequences. In this context, this thesis work aims at improving the metagenomic approach for the clinical diagnosis of viral infectious diseases by increasing the ratio of pathogen-to-host sequences trough depletion of human nucleic acids from the samples. The first chapter of this thesis consists in a bibliographic synthesis of viral metagenomic approaches in clinical research and the challenges we faced in this field. This bibliographic overview also includes a review article on targeted-enrichment sequencing approaches for pathogen detection in the field of human infectious diseases. The second chapter proposes a methodological development allowing the enrichment of non-human sequences from metagenomes through hybridization and capture of human nucleic acids with biotinylated human RNA probes. The third chapter is divided into two sub-chapters that propose the application of this protocol to the detection of putative pathogens in (1) a fatal case of encephalitis and (2) an enigmatic case of blood-culture negative infectious endocarditis. The methodological approach developed during this work is finally discussed in a fourth chapter, which also replaces the results obtained in the broader context of emerging infectious diseases and validation of the causal link between the agent detected and the observed pathology.
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Métagénomique et approches alternatives pour l'étude fondamentale et l'exploitation de la microflore tellurique / Metagenomics and alternative approaches for the fundamental study of exploitation of soil microbes

Jacquiod, Samuel 12 November 2012 (has links)
Mes travaux de thèse ont été réalisés dans le cadre du projet Européen METAEXPLORE, visant à découvrir de nouvelles enzymes d’intérêt industriel à partir des communautés microbiennes environnementales via les approches dites de « métagénomique ». Je me suis personnellement focalisé sur la recherche de chitinases dans les communautés bactériennes du sol, en particulier celui de la station expérimentale de Rothamsted (Royaume-Uni). Des approches de séquençage en 454 ont été réalisées afin de caractériser les bactéries dégradant la chitine au travers d’une stratégie d’enrichissement du sol en microcosme. J’ai également pu réaliser des criblages génétiques de banque de clones fosmidiques afin d’identifier des gènes d’intérêt potentiel. J’ai également été impliqué dans le développement d’un nouvel outil biotechnologique appelé « Genefish », dont le but est la capture de séquences d’ADN environnementales d’intérêt sur un plasmide à l’aide d’une souche E. coli ultra-recombinogène. Mes travaux seront présentés sous la forme de trois chapitres, reprenant successivement :- Chapitre 1 : Une synthèse bibliographique du contexte scientifique- Chapitre 2 : La recherche de nouvelles chitinases via des approches métagénomiques- Chapitre 3 : Le développement et l’utilisation de l’outil « Genefish / I realized my PhD in the frame of the European project METAEXPLORE, which aims to discover new enzymes of industrial interest from the environmental microbial communities through the metagenomic approaches. I was personally focused on finding new chitinases within the soil bacterial communities, with a particular emphasis on the Park Grass soil from Rothamsted research station (U.K). Pyrosequencing approaches were applied in order to characterize chitin degrading bacteria through a soil enrichment strategy in microcosm. I was also involved in genetic screening of fosmid clone library for identifying potential genes of interest. Furthermore, I participated to the development of a new biotechnological tool called “Genefish”, which aims to capture environmental DNA sequence of interest into a plasmid thanks an hyper-recombineering E. coli strain. My PhD work will be presented in 3 chapters:- Chapter 1: A literature review of the scientific context- Chapter 2: The search for new chitinases through metagenomic approaches- Chapter 3: The development and the use of the “Genefish” tool
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Génomique et métagénomique comparatives des bactéries

Déraspe, Maxime January 2021 (has links)
Les domaines de la génomique et de la métagénomique ont apporté un support incommensurable à l'avancement de nos connaissances sur la génétique des bactéries. Les bactéries pathogènes sont maintenant séquencées et analysées pour identifier les facteurs causant leur virulence et/ou leur résistance aux antibiotiques ainsi que leur capacité à transmettre ces éléments génétiques qui sont d'un intérêt clinique. Les bactéries commensales, quant à elles, sont de plus en plus associées à la santé humaine et sont étudiées à l'aide de la métagénomique pour contrer les difficultés liées à leur culture étant donné leur grande diversité en matière de besoins métaboliques. Les nouvelles technologies de séquençages permettent donc de produire en masse ces séquences d'ADN à des fins de caractérisation et de comparaison dans le but d'élucider des questions souvent reliées à la santé humaine. Les avancées en génomique et en métagénomique requièrent des logiciels bio-informatiques capables de gérer et de s'adapter à la quantité massive et croissante des données biologiques. Les deux premières hypothèses de ce doctorat concernaient le développement de méthodes efficaces et flexibles pour l'analyse de génomes et de métagénomes bactériens. Plusieurs méthodes d'analyses bio-informatiques ont été explorées et ont mené à l'implémentation de deux logiciels pour supporter les hypothèses de recherche : Ray Surveyor et kAAmer. La première hypothèse de recherche consistait à vérifier s'il était possible d'obtenir une comparaison de génomes, depuis leur simple contenu en k-mers de séquences d'ADN, avec des résultats analogues aux comparaisons génomiques standards comme le pourcentage moyen d'identités ou les arbres phylogénétiques, mais sans nécessiter d'alignements de séquences. Nous avons démontré avec le logiciel Ray Surveyor et plusieurs analyses de génomique et de métagénomique bactérienne, qu'il était possible d'obtenir de tels comparaisons à l'aide de séquences d'ADN découpées en k-mer. Dans l'étude qui présenta les résultats de l'hypothèse de recherche, nous avons aussi estimé la propension génotypique de plusieurs espèces bactériennes à des phénotypes d'intérêt clinique à l'aide de bases de données de gènes spécialisées. La deuxième hypothèse était de tester s'il était possible de développer un logiciel pour l'identification de séquences protéiques, basé sur des k-mers d'acides aminés, qui serait plus performant que les logiciels existants, spécifiquement pour l'identification de protéines avec un haut degré d'homologie. Les travaux menèrent à l'implémentation de kAAmer, un logiciel permettant de créer des bases de données de protéines où la recherche de séquence se fait par association exacte de k-mers tout en supportant l'alignement de séquences. KAAmer s'est avéré très efficace pour la recherche de séquences de protéines avec des performances surpassant même, dans la majorité des scénarios, les aligneurs de séquences les plus rapides. D'autres fonctionnalités intéressantes sont aussi offertes par kAAmer, tel que la possibilité d'héberger une base de données en tant que service de manière permanente. Enfin, la troisième et dernière hypothèse de recherche visait à valider si les deux logiciels développés durant le projet de doctorat (Ray Surveyor et kAAmer) produiraient des résultats viables dans une analyse métagénomique du microbiote intestinal en lien avec l'obésité. Les profilages taxonomique et fonctionnel furent donc réalisés avec kAAmer et la comparaison de novo des métagénomes investiguée avec Ray Surveyor. Les résultats obtenus se sont avérés significatifs et ont démontrés, entre autres, une tendance vers une abondance relative plus élevée pour le phylum Bacteroidetes et moins élevée pour les phyla Firmicutes et Acinetobacteria chez les sujets obèses. Une multitude de fonctions métaboliques se sont aussi avérées significativement différentes dans les conditions normales et d'obésités des métagénomes, avec une mention particulière à celles reliées au métabolisme des acides gras à chaîne courte qui sont reconnues pour être associées à l'obésité. / The fields of genomics and metagenomics have provided immeasurable support to the advancement of our knowledge of bacterial genetics. Pathogenic bacteria are now routinely sequenced and analyzed to identify the factors causing their virulence or antibiotic resistance as well as their ability to transmit genetic elements. Commensal bacteria are increasingly associated with human health and are being studied using metagenomics to counter the issues associated with their culture due to their wide range of metabolic needs. Next generation sequencing enabled us to mass-produce these DNA sequences for characterization and comparison purposes in order to elucidate questions related to human health. Improvement in genomics and metagenomics studies required bio-informatics software that are able to manage and adapt to an increasing availability of biological sequences data. The first two hypotheses of this thesis include the development of efficient and flexible methods for the analysis of bacterial genomes and metagenomes. Several bio-informatics analysis methods were explored and led to the implementation of two software to support the research hypotheses: Ray Surveyor and kAAmer. The first research hypothesis was to test the possibility of obtaining a comparison of genomes, from their simple DNA k-mers content, with results analogous to standard genomic comparisons such as average nucleotide identity or phylogenetic trees, but without the need for sequence alignments. Using Ray Surveyor software and several bacterial genomic and metagenomic analyses, we have demonstrated that it is possible to obtain such comparisons using k-mers from DNA sequences. In the study that presented the results of the research hypothesis, we also estimated the genotypic propensity of several bacterial species to clinically relevant phenotypes using specialized gene databases. The second hypothesis was to test the possibility of developing a software for protein sequence identification, based on amino acid k-mers, which would be more efficient than existing software, specifically for the identification of proteins with a high degree of homology. The work led to the implementation of kAAmer, a software solution that allows the creation of protein databases where the sequence search is done by exact match of k-mers, while supporting sequence alignment. KAAmer has proven to be very efficient for protein sequence search with performances surpassing even the fastest sequence aligners in most scenarios. Other interesting features are also offered by kAAmer, such as the possibility to host a database as a service on a permanent basis. Finally, the third and last research hypothesis aimed to test the capacity the two software developed during the PhD project (Ray Surveyor and kAAmer) to produce viable results in a metagenomic analysis of the gut microbiota in relation to obesity. Taxonomic and functional profiling was performed with kAAmer as the de novo comparison of metagenomes with Ray Surveyor. The results obtained were significant and showed, among others, a trend towards higher relative abundance of the Bacteroidetes phylum and lower relative abundance of the Firmicutes and Acinetobacteria phyla in obese subjects. Several metabolic functions were also found to be significantly different in the normal and obese conditions, with a particular mention to the metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) that are known to be associated with obesity.
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Caractérisation métagénomique de l'écosystème microbien de la chaîne de valeur du porc

Laforge, Pascal 02 May 2022 (has links)
La viande de porc est susceptible à la croissance microbienne en raison de sa teneur élevée en nutriments et en eau. L'élaboration de nouvelles stratégies pour optimiser sa qualité microbiologique passe par une profonde compréhension de la composition microbienne de la chaîne de valeur du porc. Les nouvelles technologies de séquençage (16S et génomes entiers) permettent la caractérisation de ce microbiome. Cependant, aucune étude à ce jour n'a suivi les mêmes animaux de la ferme, à l'usine jusqu'à la pièce de viande, les échantillons étant plutôt prélevés aléatoirement sur les différents sites. Cette étude consiste à évaluer comment le microbiote de porcs provenant de deux fermes avec des statuts sanitaires différents, ainsi que les microorganismes de leur environnement, influencent la composition microbienne de la chaîne de valeur, la contamination des usines et la qualité microbiologique des viandes. Les dénombrements d'aérobes mésophiles totaux et d'entérobactéries des échantillons prélevés à la fin des procédures préopératoires étaient près ou sous le seuil de détection indiquant que les procédures de nettoyage sont efficaces. De plus, les dénombrements des échantillons prélevés à l'abattoir ne variaient pas significativement en fonction des fermes étudiées. Cependant, un test de la somme des rangs de Wilcoxon (p<0.05) a révélé que la contamination moyenne aux Enterobacteriaceae pour les échantillons d'abattoir collectés après l'abattage des animaux était plus souvent supérieure pour la ferme avec un statut sanitaire inférieur comparativement à l'autre ferme Le séquençage de l'ADN microbien de la chaîne de valeur du porc a révélé qu'Acinetobacter, Clostridium, Moraxella et Rothia étaient les genres les plus abondants dans cette chaîne de valeur. L'algorithme LEfSe (p < 0.05, LDA 1.0) a permis d'identifier un plus grand nombre de biomarqueurs pour la ferme avec le statut sanitaire inférieur. De plus, les indices de diversité alpha étaient significativement plus élevés dans l'air et dans la moulée pour la ferme dont le statut est inférieur. L'analyse de la diversité bêta indiquait que les facteurs tels que le type d'échantillon et la localisation (ferme, éviscération et découpe) ont eu un effet significatif sur le microbiome de la chaîne de valeur et cela, selon un test ANOSIM (p<0,05). Ainsi, ces résultats suggèrent que l'écosystème microbien de la chaîne de valeur du porc varie avec la ferme d'origine. L'impact du statut sanitaire des animaux sur la chaîne de valeur mérite d'être étudié à plus grande échelle. / Pork meat is a food product at risk of microbial contamination due to its rich nutrient and water content. Developing new strategies to optimize the microbiological quality of these products requires a deeper understanding of the microbial ecology of the pork value chain. This microbiome is beginning to be studied using new genomic methods (16S and whole genome sequencing). However, no study to date has followed the same animals from farm to meat, rather samples are taken at random from different sites. The purpose of this study is to evaluate how the microbiota of pigs, originating from farms with different sanitary status, and their environment, influence the microbial composition of the value chain, the contamination of slaughter house and the microbiological quality of the resulting meats. The counts of total mesophilic aerobes and Enterobacteriaceae in samples collected at the end of preoperative procedures were near or below the detection limit indicating that the cleaning procedures are effective. In addition, the counts of samples taken at the slaughter house did not vary significatively depending on the farms analyzed. However, a Wilcoxon rank sum test (p <0.05) revealed that mean Enterobacteriaceae counts associated with the farm with a lower sanitary status, across all slaughter house samples collected after the slaughter of animals, are more often above the ones from the other farm. Sequencing of the pork value chain microbial DNA revealed that Acinetobacter, Clostridium, Moraxella and Rothia were the most abundant genera in this value chain. The LEfSe algorithm (p <0.05, LDA 1.0) identified a greater number of biomarkers for the farm with the lower sanitary status. Alpha diversity indices were significantly higher in air and food when the status is lower. In addition, analysis of beta diversity indicates that the factors; sample type and localization (farm, evisceration, and cut-out) have a significant impact on the value chain microbiome according to a ANOSIM test (p <0.05). Thus, these results suggest that the microbial ecosystem of the pork value chain varies with the farm of origin and the impact of the herd sanitary status deserves to be studied on a larger scale.
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Metagenomic deep sequencing reveals taxonomic and functional profiles of the gut microbiome of young Nunavik Inuit

Abed, Jehane Y. 10 January 2024 (has links)
Titre de l'écran-titre (visionné le 4 décembre 2024) / Le microbiome intestinal a évolué avec son hôte humain et joue un rôle crucial dans la santé physique et mentale. Cependant, les données sur le métagénome de l'intestin sont biaisées en faveur des populations au mode de vie industrialisé. Jusqu'à présent, la majorité des communautés non industrielles étudiées dépendent d'un régime alimentaire principalement composé d'aliments riches en fibres issus de la cueillette locale. Tandis que, les populations industrialisées consomment principalement des aliments de supermarché caractérisés par une faible teneur en fibres et une forte teneur en matières grasses. Les caractéristiques taxonomique et fonctionnelle du microbiome de ces populations ont été décrites par de nombreuses études métagénomique. En revanche, il existe peu de données métagénomiques sur des populations telles que les Inuits du Nunavik, dont l'alimentation repose sur des produits animaux chassé localement. Nous avons donc émis l'hypothèse que nous identifierions une composition d'espèces et des capacités fonctionnelles distinctes dans les microbiomes intestinaux du Nunavik par rapport aux métagénomes non industrialisés et industrialisés. En outre, nous avons postulé que nous pourrions reconstruire les génomes de bactéries précédemment inconnues dans les métagénomes intestinaux des Inuits du Nunavik. Tout d'abord, nous avons généré des données de séquençage shotgun en profondeur à partir de 279 échantillons donnés par des résidents du Nunavik. Ensuite, nous avons choisi des échantillons provenant de populations non industrialisées et industrialisées dans une base de données publique pour qu’ils servent de groupes de comparaison. Nous avons utilisé une méthode basée sur les lectures de séquençage non assemblées pour réaliser un profilage taxonomique et fonctionnel des échantillons du Nunavik et de comparaison. Enfin, nous avons utilisé une approche basée sur l'assemblage des lectures de séquençage pour reconstruire des génomes assemblés du métagénome (MAG), identifier et décrire des espèces microbiennes non caractérisées présentes dans le microbiome intestinal du Nunavik. Mes travaux ont démontré que le microbiome intestinal des jeunes Inuits du Nunavik présente une plus grande diversité intraindividuelle, une plus faible diversité inter-individuelle et qu'il est distinct de celui de leurs homologues non industrialisés et industrialisés. De plus, nous avons identifié des signatures taxonomiques et fonctionnelles uniques qui distinguent les microbiomes du Nunavik des groupes de comparaison. En outre, nous avons reconstruit un total de 30365 MAG, représentant 840 génomes non redondants qui appartiennent chacun à une seule espèce bactérienne. Parmi les 840 MAG non redondants, 734 sont des représentants d'espèces décrites et ont été classés comme MAG connus (kMAG). En revanche, 101 n'ont pas été assignés au niveau taxonomique de l'espèce, et 5 représentent des genres non caractérisés ; nous les avons donc classés comme MAGs inconnus (uMAGs). De plus, nous avons démontré que les uMAGs sont fortement associés au microbiome intestinal du Nunavik par rapport aux populations non industrialisées et industrialisées. Enfin, une analyse fonctionnelle complète a démontré que près de 30 % des gènes prédits dans les uMAGs ont des fonctions inconnues. Dans son ensemble, mon projet de doctorat fournit une description complète des profils taxonomiques et fonctionnels du microbiome intestinal des Inuits du Nunavik. Les études réalisées dans le cadre de cette thèse démontrent que le microbiome intestinal du Nunavik est différent de celui de populations ayant des modes de vie et des environnements différents des Inuits. Ensemble, les résultats de mes travaux contribuent à réduire les biais des bases de données, à améliorer la représentativité et à maximiser le profilage taxonomique. Ce projet de doctorat permet donc de mieux comprendre la composition bactérienne de l'intestin humain. Par conséquent, ces résultats ont le potentiel d'améliorer les modèles prédictifs de l'état de santé, non seulement pour les jeunes Inuits du Nunavik, mais aussi pour l'ensemble de la population. / The gut microbiome has co-evolved with its human host and plays a crucial role in physical and mental health. However, Human gut metagenome data are biased toward populations following an industrialized lifestyle. Until now, most non-industrial communities studied depend on a diet primarily composed of locally foraged fiber-rich foods. Whereas industrialized populations predominantly consume market food characterized by low fiber high fat contents. The taxonomic and functional characteristics of the gut microbiome of these populations have been described by numerous metagenomic studies. In contrast, there is limited metagenomic data from populations such as the Nunavik Inuit, who rely on naturally sourced animal products in their diet. Hence, we hypothesized that we would identify distinct species composition and functional capabilities in Nunavik gut microbiomes compared to non-industrialized and industrialized metagenomes. Additionally, we postulated that we could reconstruct genomes of previously unknown bacteria from Nunavik Inuit gut metagenomes. We first generated deep shotgun sequencing data from 279 samples donated by Nunavik resident. Next, we chose samples from non-industrialized and industrialized populations available in a public database to serve as comparison groups. We performed read-based taxonomic and functional profiling of metagenomic data for Nunavik and comparison samples. Lastly, we used an assembly-based approach to reconstruct metagenome assembled genomes (MAGs) and identify previously uncharacterized microbial species within the Nunavik gut microbiome. My work demonstrated that the Nunavik Inuit youth gut microbiome exhibits higher intra-individual diversity, lower interindividual diversity, and is distinct from their non-industrialized and industrialized counterparts. Furthermore, we identified unique taxonomic and functional signatures discriminating Nunavik microbiomes from comparison groups. In addition, we reconstructed a total of 30,365 MAGs, representing 840 distinct non-redundant genomes that each belong to a single bacterial species. Among the 840 non-redundant MAGs, 734 are representatives ofdescribed species and were categorized as known MAGs (kMAGs). In contrast, 101 were unassigned at the species level, and 5 represent uncharacterized genera, thus, we classified them as unknown MAGs (uMAGs). Furthermore, we demonstrate that uMAGs strongly associate with Nunavik gut microbiome compared to nonindustrialized and industrialized population. Finally, comprehensive functional analysis demonstrated that close to 30% of genes predicted in uMAGs have unidentified functions. Overall, my doctoral project provides a comprehensive description of the Nunavik Inuit gut microbiome taxonomic and functional profiles. Studies performed for this thesis demonstrate that the Nunavik gut microbiome is different from populations with different lifestyles and environment. Together my work findings contribute to reducing database bias, enhancesrepresentativeness and maximizes taxonomic profiling. Hence, it allows for a more comprehensive understanding of the bacterial composition of the Human gut. As a result, it has the potential to improve predictive models of health status not only for young Nunavik Inuit but also for the broader population
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Caractérisation métagénomique de l'écosystème microbien de la chaîne de valeur du porc

Laforge, Pascal 02 May 2022 (has links)
La viande de porc est susceptible à la croissance microbienne en raison de sa teneur élevée en nutriments et en eau. L'élaboration de nouvelles stratégies pour optimiser sa qualité microbiologique passe par une profonde compréhension de la composition microbienne de la chaîne de valeur du porc. Les nouvelles technologies de séquençage (16S et génomes entiers) permettent la caractérisation de ce microbiome. Cependant, aucune étude à ce jour n'a suivi les mêmes animaux de la ferme, à l'usine jusqu'à la pièce de viande, les échantillons étant plutôt prélevés aléatoirement sur les différents sites. Cette étude consiste à évaluer comment le microbiote de porcs provenant de deux fermes avec des statuts sanitaires différents, ainsi que les microorganismes de leur environnement, influencent la composition microbienne de la chaîne de valeur, la contamination des usines et la qualité microbiologique des viandes. Les dénombrements d'aérobes mésophiles totaux et d'entérobactéries des échantillons prélevés à la fin des procédures préopératoires étaient près ou sous le seuil de détection indiquant que les procédures de nettoyage sont efficaces. De plus, les dénombrements des échantillons prélevés à l'abattoir ne variaient pas significativement en fonction des fermes étudiées. Cependant, un test de la somme des rangs de Wilcoxon (p<0.05) a révélé que la contamination moyenne aux Enterobacteriaceae pour les échantillons d'abattoir collectés après l'abattage des animaux était plus souvent supérieure pour la ferme avec un statut sanitaire inférieur comparativement à l'autre ferme Le séquençage de l'ADN microbien de la chaîne de valeur du porc a révélé qu'Acinetobacter, Clostridium, Moraxella et Rothia étaient les genres les plus abondants dans cette chaîne de valeur. L'algorithme LEfSe (p < 0.05, LDA 1.0) a permis d'identifier un plus grand nombre de biomarqueurs pour la ferme avec le statut sanitaire inférieur. De plus, les indices de diversité alpha étaient significativement plus élevés dans l'air et dans la moulée pour la ferme dont le statut est inférieur. L'analyse de la diversité bêta indiquait que les facteurs tels que le type d'échantillon et la localisation (ferme, éviscération et découpe) ont eu un effet significatif sur le microbiome de la chaîne de valeur et cela, selon un test ANOSIM (p<0,05). Ainsi, ces résultats suggèrent que l'écosystème microbien de la chaîne de valeur du porc varie avec la ferme d'origine. L'impact du statut sanitaire des animaux sur la chaîne de valeur mérite d'être étudié à plus grande échelle. / Pork meat is a food product at risk of microbial contamination due to its rich nutrient and water content. Developing new strategies to optimize the microbiological quality of these products requires a deeper understanding of the microbial ecology of the pork value chain. This microbiome is beginning to be studied using new genomic methods (16S and whole genome sequencing). However, no study to date has followed the same animals from farm to meat, rather samples are taken at random from different sites. The purpose of this study is to evaluate how the microbiota of pigs, originating from farms with different sanitary status, and their environment, influence the microbial composition of the value chain, the contamination of slaughter house and the microbiological quality of the resulting meats. The counts of total mesophilic aerobes and Enterobacteriaceae in samples collected at the end of preoperative procedures were near or below the detection limit indicating that the cleaning procedures are effective. In addition, the counts of samples taken at the slaughter house did not vary significatively depending on the farms analyzed. However, a Wilcoxon rank sum test (p <0.05) revealed that mean Enterobacteriaceae counts associated with the farm with a lower sanitary status, across all slaughter house samples collected after the slaughter of animals, are more often above the ones from the other farm. Sequencing of the pork value chain microbial DNA revealed that Acinetobacter, Clostridium, Moraxella and Rothia were the most abundant genera in this value chain. The LEfSe algorithm (p <0.05, LDA 1.0) identified a greater number of biomarkers for the farm with the lower sanitary status. Alpha diversity indices were significantly higher in air and food when the status is lower. In addition, analysis of beta diversity indicates that the factors; sample type and localization (farm, evisceration, and cut-out) have a significant impact on the value chain microbiome according to a ANOSIM test (p <0.05). Thus, these results suggest that the microbial ecosystem of the pork value chain varies with the farm of origin and the impact of the herd sanitary status deserves to be studied on a larger scale.
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INTERACTIONS ENTRE COMPOSITION CHIMIQUE ET POPULATIONS MICROBIENNES DE LA NEIGE: QUELLES SONT LES CONSEQUENCES SUR LE CYCLE DU MERCURE EN ARCTIQUE ?

Larose, Catherine 13 January 2010 (has links) (PDF)
L'objectif principal de cette thèse est de caractériser les interactions entre la composition chimique et la structure des communautés microbiennes dans un manteau neigeux arctique. Une attention toute particulière est portée au mercure, dont le cycle biogéochimique complexe est encore mal connu. Avant toute chose, les fractions biotiques et abiotiques d'un manteau neigeux saisonnier doivent être caractérisées. A partir d'échantillons de neige et d'eau de fonte prélevés au cours d'une étude de deux mois en 2007 à Ny-Ålesund, nous avons montré que la diversité des séquences est élevée et nous avons également examiné le devenir du mercure, depuis son dépôt au cours des phénomènes de déplétions jusqu'à son transfert lors de la fonte des neiges. Les résultats de cette campagne ont souligné la nécessité d'améliorer nos connaissances sur la spéciation du mercure et ont conduit à l'élaboration d'un biocapteur mer-lux pour mesurer la fraction biodisponible de mercure, déployé lors d'une seconde campagne de deux mois au printemps 2008. En parallèle à l'analyse chimique, nous avons suivi les changements dans la structure des communautés microbiennes présentes dans les échantillons de neige et d'eau de fonte. Nous avons enfin exploré l'effet de la contamination au mercure sur la fonction de la communauté et démontré que le méthylmercure affecte la structure des communautés ainsi que sa fonction à des concentrations beaucoup plus faibles que précédemment rapportées. Nos résultats fournissent une base pour de nouvelles études sur l'interaction entre la composition chimique, la présence de contaminants anthropiques et la structure des communautés microbiennes.
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Dégradation de la Fumonisine B1 par la communauté microbienne dans les ensilages de maïs grain humide / Degradation of Fumonisin B1 by microorganisms in high moisture maize grain silages

Martinez Tuppia, Ccori Silbina 04 December 2015 (has links)
Les mycotoxines telles que la fumonisine B1 (FB1) produites par les champignons du genre Fusarium sont particulièrement préoccupantes pour la filière maïsicole. L’ensilage de maïs est un processus de fermentation naturel susceptible de favoriser l’évolution des teneurs en FB1. La maîtrise du risque de contamination par la FB1 et la recherche de moyens permettant la décontamination des ensilages est donc nécessaire. L’objectif de ce travail est de caractériser le devenir de la FB1 dans les ensilages de maïs grain et de mettre en évidence l’existence d’agents microbiens capables de dégrader cette toxine. Pour cela, des mini-silos contenant du maïs grain naturellement contaminé en FB1 provenant de différents parcelles et issus des deux années de récolte ont été préparés. La stratégie analytique basée sur le dosage de la FB1 libre et la FB1 complexée par HPLC-MS/MS a révélé une diminution significative de la teneur en FB1 totale qui ne peut être attribuée à un mécanisme de complexation et résulte d’un mécanisme de dégradation. La recherche du microbiote associé à la dégradation de la FB1 a été réalisée par deux approches complémentaires : Une analyse métagénomique combinant l’extraction sélective de l’ADN microbien et le séquençage haut débit «shotgun» afin de comparer la diversité taxonomique et fonctionnelle d’un ensilage dégradant la FB1 et d’un ensilage moins dégradant. En parallèle, un criblage de microorganismes cultivables capables de métaboliser la FB1 a été conduit et a permis de confirmer les résultats de l’analyse globale. Ce travail apporte une première image du microbiote potentiellement associé à la dégradation de la FB1, ainsi que des activités microbiennes responsables. / Fungi of the genus Fusarium are one of the major contaminants of maize that can produce mycotoxins, such as the fumonisin B1 (FB1). Maize silage which is based on the fermentation of whole crop plant or grains is considered the main source of monogastrics and cattle feeding in Europe. The ensiling process could favor changes in FB1 content; however this has scarcely been documented. This led to questioning regarding the possibility of managing the microbiota during ensiling in order to reduce the level of mycotoxins exposure and improve feed quality. The aim of this work is to study the fate of FB1 during ensiling process of high moisture maize grain and to identify an endemic microbiota capable of degrading FB1. Laboratory scale silages were prepared with naturally contaminated FB1 grains from two cropping years. An analytical procedure allowed assessing both free and matrix associated FB1 forms and showed a significant decrease in total FB1 content that are not linked to the presence of bound FB1. Additionally, our data showed that the FB1 content decrease was mainly due to a degradation process. Identification of a potential microbiota responsible for FB1 degradation was conducted. A metagenomics approach combining a selective microbial DNA extraction and high-throughput shotgun sequencing showed microbial specific patterns between FB1 degrading and weakly degrading silage. These results were also supported by the isolation of microbial strains able to metabolize FB1. Ultimately, this work evidenced a microbiota associated to FB1 degradation and the functional diversity involved in this activity. Bacteria and yeasts have been obtained for further studies on degradation activities and their usage as silage starter.
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Métagénomique comparative de novo à grande échelle / Large scale de novo comparative metagenomics

Benoit, Gaëtan 29 November 2017 (has links)
La métagénomique comparative est dite de novo lorsque les échantillons sont comparés sans connaissances a priori. La similarité est alors estimée en comptant le nombre de séquences d’ADN similaires entre les jeux de données. Un projet métagénomique génère typiquement des centaines de jeux de données. Chaque jeu contient des dizaines de millions de courtes séquences d’ADN de 100 à 200 nucléotides (appelées lectures). Dans le contexte du début de cette thèse, il aurait fallu des années pour comparer une telle masse de données avec les méthodes usuelles. Cette thèse présente des approches de novo pour calculer très rapidement la similarité entre de nombreux jeux de données. Les travaux que nous proposons se basent sur le k-mer (mot de taille k) comme unité de comparaison des métagénomes. La méthode principale développée pendant cette thèse, nommée Simka, calcule de nombreuses mesures de similarité en remplacement les comptages d’espèces classiquement utilisés par des comptages de grands k-mers (k > 21). Simka passe à l’échelle sur les projets métagénomiques actuels grâce à un nouvelle stratégie pour compter les k-mers de nombreux jeux de données en parallèle. Les expériences sur les données du projet Human Microbiome Projet et Tara Oceans montrent que les similarités calculées par Simka sont bien corrélées avec les similarités basées sur des comptages d’espèces ou d’OTUs. Simka a traité ces projets (plus de 30 milliards de lectures réparties dans des centaines de jeux) en quelques heures. C’est actuellement le seul outil à passer à l’échelle sur une telle quantité de données, tout en étant complet du point de vue des résultats de comparaisons. / Metagenomics studies the genomic content of a sample extracted from a natural environment. Among available analyses, comparative metagenomics aims at estimating the similarity between two or more environmental samples at the genomic level. The traditional approach compares the samples based on their content in known identified species. However, this method is biased by the incompleteness of reference databases. By contrast, de novo comparative metagenomics does not rely on a priori knowledge. Sample similarity is estimated by counting the number of similar DNA sequences between datasets. A metagenomic project typically generates hundreds of datasets. Each dataset contains tens of millions of short DNA sequences ranging from 100 to 150 base pairs (called reads). In the context of this thesis, it would require years to compare such an amount of data with usual methods. This thesis presents novel de novo approaches to quickly compute the similarity between numerous datasets. The main idea underlying our work is to use the k-mer (word of size k) as a comparison unit of the metagenomes. The main method developed during this thesis, called Simka, computes several similarity measures by replacing species counts by k-mer counts (k > 21). Simka scales-up today’s metagenomic projects thanks to a new parallel k-mer counting strategy on multiple datasets. Experiments on data from the Human Microbiome Project and Tara Oceans show that the similarities computed by Simka are well correlated with reference-based and OTU-based similarities. Simka processed these projects (more than 30 billions of reads distributed in hundreds of datasets) in few hours. It is currently the only tool able to scale-up such projects, while providing precise and extensive comparison results.
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Description des communautés microbiennes du sol par une approche métagénomique / Decrypting soil microbial communities using metagenomic approaches

Delmont, Tom 19 December 2011 (has links)
Les données présentées dans ce manuscrit de thèse sont principalement basées sur l'analyse de séquences d'ADN extraites directement de l'environnement (et en particulier du sol) en les comparant aux données cumulées au fil des siècles sur les microorganismes cultivés en laboratoire. Les objectifs, difficultés, résultats et perspectives de cette approche, que l'on nomme « métagénomique », sont décrits. Un métagénome représente la diversité génétique d'un habitat défini (par exemple un sol du champ agricole) dans sa globalité. Ainsi, générer un métagénome a notamment pour but d’accéder à la diversité génétique de la majorité d'espèces récalcitrantes à la culture. Elle permet aussi d'estimer le potentiel fonctionnel d'un jeu de données métagénomiques représentant un écosystème, puis de le comparer à d'autres jeux de données, représentant quant à eux d'autres environnements. Enfin, un autre intérêt de cette approche est la possibilité, dans certains cas, d'assembler partiellement ou entièrement un métagénome, et ainsi de permettre la reconstruction de structures génétiques complexes, qu'elles représentent des plasmides ou des génomes, circulaires ou non. Ce manuscrit de thèse présente ces aspects de la métagénomique (extraction, séquençage, annotation, comparaison, assemblage) sur l'environnement sol, en se basant sur une prairie anglaise (Park Grass, Rothamsted Research) étudiée depuis plus de 150 ans. Les communautés microbiennes prédominantes ont été partiellement caractérisées, leur potentiel fonctionnel comparé à d'autre environnements majeurs de notre planète (océans, sédiments, neige, etc.). Parce que l'assemblage de ces données est très limité dû à une trop grande diversité, des expérimentations ont été faites en microcosmes afin de stimuler une partie de la communauté avant de générer de nouveaux jeux de données, hautement simplifiés. Cette approche a permis l'assemblage et l'étude structurelle de génomes correspondant à des espèces résistant à des conditions extrêmes (par exemple un apport considérable de mercure, ou de métaux lourds).Lorsque l'on regarde la métagénomique dans sa globalité, les perspectives apparaissent clairement : usant d'outils de plus en plus performants (séquençage, annotation, assemblage, etc.), les microbiologistes peuvent d'ores et déjà récolter le fruit de plus de trois milliards d'années d'évolution et d'adaptation microbienne. / Microbial ecology is beginning to interact with metagenomics and many microbiologists are attracted to metagenomics in the hope of discovering novel relationships between microorganisms and/or confirming that work done on isolates applies to the remaining uncultured members of the different ecosystems. With a growing number of available metagenomic datasets, metagenomes can be intensively mined by microbial ecologists in search of previously undetected correlations (both structural and functional). Here, we provide a preliminary exploration of 77 publically available metagenomes corresponding to DNA samples extracted from oceans, atoll corals, deep oceans, Antarctic aquatic environments, Arctic snows, terrestrial environments (sediments, soils, sludges, microbial fuel cell anode biofilms, acid mine drainage biofilms), polluted air, and animal and human microbiomes (human feces, mouse and chicken cecum, and cow rumen). Results show well-defined environmental specificities that emphasize microbial adaptation and evolution capabilities. Unexpected observations were also made for several ecosystems, thus providing new hypotheses about the life style of their microbial communities. Available metagenomes are a gold mine of underexploited information that could be used to explore specific microbial structural and functional relationships. The statistical analysis provided here depends in part on replicates from the different ecosystems. With the continued emphasis on metagenomic sequencing, future analyses should support rigorous statistical treatment. This preliminary metagenomic decryption could represent a pilot-scale test for a future Earth microbiome global comparison

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