Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus du foie qui cause 1 à 2 millions de morts chaque année. Approximativement 400 millions d’individus sont infectés chroniquement. Le VHB est un virus enveloppé et comprend un génome ADN de ~3.2 kbp au sein d’une capside icosaédrique. La capside est formée de 240 copies d’une protéine unique appelée Core ou protéine de la capside. Durant l’infection, la capside est importée dans le noyau pour libérer le génome viral. L’import est facilité au travers du complexe du pore nucléaire (NPC) en utilisant des récepteurs de transport nucléaire. Des biopsies réalisées sur des patients infectés par le VHB ont montrées que les capsides nucléaires sont issues de l’entrée nucléaire mais aussi de protéines Core nouvellement traduites.Ce travail analyse l’import nucléaire de la capside du VHB et la libération du génome viral. Nous avons montré que les imports des protéines Core et de la capside suivent des systèmes d’import différents. Il a été démontré à partir de tests d’import nucléaire basés sur des cellules perméabilisées par la digitonine que les capsides utilisent l’hétérodimère des importines α et β. Cette découverte est en accord avec de précédentes observations qui ont également démontrées l’exposition de NLS à la surface de la capside, sur lequel s’attache l’importine α. Des expériences de contrôle utilisant le GST-NLS ont permis de démontrer que la fixation du NLS sur l’importine nécessite une interaction avec l’importine  pour la stabilisation du complex de l’import. En analysant l’import nucléaire de la protéine Core non assemblée, nous avons pu observer un import basé uniquement sur l’interaction avec l’importine β, ce qui implique que la protéine Core présente un domaine IBB et non un NLS. Le transport a travers le NPC se termine par l’arrivée des capsides dans le panier nucléaire, qui est une structure en cage, du côté nucléaire. En accord avec la littérature, nous avons observé une liaison de l’importine β sur le domaine C-terminal de la Nup153. L’ajout de RanGTP, qui dissocie les complexes d’import, ne dissocie pas l’importine β de ce domaine, ce qui permet d’émettre l’hypothèse qu’un autre domaine de la Nup153 est impliqué. Contrairement aux autres cargos, la capside du VHB est stoppée dans le panier nucléaire par sont interaction avec la Nup153. Puisque le domaine de liaison de l’importine β chevauche celui de la capside, l’importine β doit se dissocier de la Nup153. L’interaction capside-Nup153 est supposée déstabiliser la capside et permettre la libération du génome viral dans le noyau et la diffusion des protéines Core en supériorité numérique par rapport à la Nup153.En conséquence, les capsides montrent une instabilité, comme nous l’avons démontré par chromatographie d’exclusion de taille, révélant non seulement la capside mais aussi ses intermédiaires d’association/dissociation. Ces expériences sont limitées aux capsides recombinantes car elles nécessitent une grande quantité d’échantillons. Dans le but de confirmer l’instabilité des autres capsides (matures et immatures), nous avons analysé l’accessibilité des acides nucléiques encapsidés pour la nucléase S7. Les résultats ont confirmé une dissociation in vitro partielle pour toutes les capsides, mais avec une cinétique lente, ce qui n’est pas cohérent avec la réaction in vivo. En analysant l’impact de la Nup153 sur cette accessibilité, nous observons qu’un facteur nucléaire supplémentaire, présent du moins dans les cellules hépatiques, accélère la cinétique de dissociation. / The hepatitis B virus (HBV) is a hepatotropic virus which causes 1 to 2 million of death every year. Approximately 400 million individuals are chronically infected. HBV is enveloped and comprises a DNA genome of ~3.2 kbp within an icosaedral capsid. The capsid is formed by 240 copies of one single protein species termed core or capsid protein. During the infection, the capsid is imported to the nucleus in order to release the viral genome. The import is facilitated through the nuclear pore complex (NPC) using nuclear transport receptors. Biopsies of HBV-infected patients show nuclear capsids, which are derived from nuclear entry of the capsid but also from nuclear import of progeny core proteins.This work investigates the nuclear import of the HBV capsid and the release of the viral genome. We showed that the imports of core protein and capsid follow different pathways. Capsids were shown to use the heterodimer of importin α and β for nuclear import as it was demonstrated by nuclear import essay, based on digitonin-permeabilised cells. This finding is consistent with earlier observations, which also demonstrated the exposure of NLS on the capsid surface, to which importin  attaches. Control experiments using GST-NLS demonstrated that binding of the NLS to importin  required interaction with importin  for stabilization of the import complex. Analysing the nuclear import of the unassembled core protein we observed an import based on interaction with only importin β implying that the core protein expose an importin -binding domain rather than an NLS.The transport through the NPC is terminated with the arrival of a cargo capsid in the nuclear basket, which is a cage like structure at the nuclear side of the NPC. Consistent with the literature we observed an attachment of importin  to the C terminal domain of Nup153. Addition of RanGTP, which dissociates import complexes, did not dissociate importin  from this domain, which led to the hypothesis that other Nup153 domains are involved. In contrast to other karyophilic cargos HBV capsids become arrested within the nuclear basket by capsid-Nup153 interaction. As the binding site of importin overlaps with the binding site of the capsid such importin -Nup153 interaction has to be dissociated. The subsequent capsid-Nup153 interaction was thought to destabilize the capsid allowing liberation of the viral genome into the nuclear and the diffusion of core proteins, supernumerous with regard to the Nup153 molecules, deeper into the nucleus. Accordingly, capsids show an imminent instability as we demonstrated by separation of capsids using size exclusion chromatography revealing not only capsids but assembly/disassembly intermediates. These experiments were limited to recombinant, E. coli-expressed due to the high amounts needed. To confirm the instability of other capsids e.g. genome-containing ones, we analyzed the accessibility of the capsid enclosed nucleic acids to the S7 nuclease. The results confirmed partial dissociation in vitro similar for all capsids but with a slow kinetic, which is not coherent with the in vivo reaction. Investigating the impact of Nup153 we observed that an additional nuclear factor, present in at least hepatoma cells accelerates the dissociation kinetic.

L'ostéoarthrose (OA) est la forme la plus commune d’arthrite et son étiologie demeure encore méconnue. Les travaux du Dr Moreau et son équipe ont permis de mettre en évidence une quasi perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans les chondrocytes OA et la protéine PHB-1 a été identifiée comme étant membre d’un complexe répresseur pouvant lier le promoteur de Pitx1. Le but de la présente étude était de confirmer l’accumulation anormale de PHB-1 dans le noyau des chondrocytes OA, tel que suggéré par des données préliminaires, et d’identifier les mécanismes impliqués dans son import ou rétention au noyau. Pour ce faire, un volet mécanistique utilisant les lignées C28/I2 et U2OS fut combiné à l’étude clinique des chondrocytes articulaires de patients OA et de sujets sains. Les résultats de cette étude démontrent que chez 55 pourcent des patients OA, la Prohibitine s’accumule dans le noyau des chondrocytes articulaires et que cette accumulation corrèle avec une augmentation de la sumoylation totale dans le noyau des cellules OA. Le présent projet de recherche propose pour la première fois qu’une sumoylation accrue au sein des cellules OA pourrait être responsable de l’accumulation nucléaire de PHB-1, médiée par sa liaison aux protéines SUMO-1 via un domaine de liaison aux SUMOs (SBM) localisé aux résidus 76 à 79 de PHB-1. Les résultats de cette étude ont aussi permis de mettre en évidence que dans les chondrocytes OA, les protéines SUMO-1 et SUMO-2/3 s’accumulent dans des corps nucléaires de type PML, suggérant un recrutement de protéines interagissant avec les SUMOs au sein de ces structures dans les cellules OA. Nous sommes persuadés que cette étude générera des retombées importantes non seulement au niveau fondamental pour la compréhension des mécanismes moléculaires liés à la biologie des chondrocytes articulaires, mais aussi au niveau du développement d’outils génétiques permettant le dépistage de l’arthrose à un stade précoce. / Despite intensive efforts, the aetiology of Osteoarthritis (OA) remains elusive, however, genetic factors have been found to be strong determinants of the disease. Recent studies in Dr. Moreau’s lab have demonstrated an aberrant nuclear accumulation of PHB-1, a ubiquitous protein implicated in multiple cellular processes, in human OA articular chondrocytes. Moreover, we have shown that PHB-1 is part of a repressor complex that binds to the promoter of Pitx1 transcription factor, through the recognition of an E2F-like binding site which could contribute to OA onset. The role of Pitx1 and PHB-1 in OA pathogenesis is not clear, the goal of this study was to characterize PHB-1 nuclear accumulation in OA chondrocytes and to determine the molecular mechanisms by which PHB-1 accumulates in the nucleus of OA chondrocytes. In our studies we used U2Os and C28/I2 as well as human chondrocytes obtained from OA and control patients. Our data confirmed that PHB-1 accumulates in the nucleus of about 55 percent of OA patients and that this accumulation correlates with an increased in sumoylation of the proteins in the nuclear fraction of OA chondrocytes. Present findings suggest that increased sumoylation could trigger PHB-1 nuclear accumulation through binding of PHB-1 to a sumoylated protein via a SUMO interacting motif (SBM) mapped to residus 76 to 79 of PHB-1. Moreover, these results demonstrate that sumoylated proteins accumulate in PML nuclear bodies in the nucleus of OA chondrocytes, suggesting the recruitment of SUMO-interacting proteins in PML bodies of arthritic chondrocytes. Further studies are needed to identify the potential sumoylated proteins which are interacting with PHB1.

L'efficacité du transfert de gènes non viral est limitée par les barrières physiologiques qui entravent le cheminement de l'ADN jusqu'au noyau des cellules cibles. <br />Ce travail a permis de concevoir et d'étudier trois outils visant à améliorer cette efficacité. <br />Un premier volet concerne le ciblage du noyau cellulaire. Une banque de plasmides comportant une séquence aléatoire a été construite dans le but d'identifier une séquence nucléotidique permettant l'interaction du plasmide avec une protéine karyophile qui pourrait l'escorter jusqu'au noyau cellulaire. Le caractère aléatoire de la banque a été validé mais les séquences recherchées n'ont pas pu être identifiées grâce aux tests que nous avons employés.<br />Le peptide de localisation nucléaire IBB de l'importine a été couplé de façon covalente au squelette d'un plasmide dans le but de promouvoir la fixation du plasmide aux protéines récepteurs d'import nucléaire. La spécificité de l'interaction entre ce plasmide-IBB et les récepteurs cellulaires n'a pas pu être démontrée, les tests employés n'ont pas permis de mettre en évidence un import nucléaire accru de ces plasmides. En revanche le peptide IBB compacte l'ADN, améliorant la lipofection par modification des caractéristiques physico-chimiques du lipoplexe.<br />Le deuxième volet de ce travail concerne le ciblage extracellulaire, envisagé dans le système modèle du récepteur aux asialoglycoprotéines des hépatocytes. Des liposomes cationiques à têtes de ciblage galactosylées ont permis de définir les caractéristiques structurales et physico-chimiques les plus favorables pour l'accessibilité de la tête de ciblage. L'intégration d'un espaceur polyéthylèneglycol au lipide galactosylé a permis de limiter l'internalisation non spécifique des lipoplexes dans les cellules non visées, nous n'avons pas observé de ciblage des hépatocytes.

L'ostéoarthrose (OA) est la forme la plus commune d’arthrite et son étiologie demeure encore méconnue. Les travaux du Dr Moreau et son équipe ont permis de mettre en évidence une quasi perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans les chondrocytes OA et la protéine PHB-1 a été identifiée comme étant membre d’un complexe répresseur pouvant lier le promoteur de Pitx1. Le but de la présente étude était de confirmer l’accumulation anormale de PHB-1 dans le noyau des chondrocytes OA, tel que suggéré par des données préliminaires, et d’identifier les mécanismes impliqués dans son import ou rétention au noyau. Pour ce faire, un volet mécanistique utilisant les lignées C28/I2 et U2OS fut combiné à l’étude clinique des chondrocytes articulaires de patients OA et de sujets sains. Les résultats de cette étude démontrent que chez 55 pourcent des patients OA, la Prohibitine s’accumule dans le noyau des chondrocytes articulaires et que cette accumulation corrèle avec une augmentation de la sumoylation totale dans le noyau des cellules OA. Le présent projet de recherche propose pour la première fois qu’une sumoylation accrue au sein des cellules OA pourrait être responsable de l’accumulation nucléaire de PHB-1, médiée par sa liaison aux protéines SUMO-1 via un domaine de liaison aux SUMOs (SBM) localisé aux résidus 76 à 79 de PHB-1. Les résultats de cette étude ont aussi permis de mettre en évidence que dans les chondrocytes OA, les protéines SUMO-1 et SUMO-2/3 s’accumulent dans des corps nucléaires de type PML, suggérant un recrutement de protéines interagissant avec les SUMOs au sein de ces structures dans les cellules OA. Nous sommes persuadés que cette étude générera des retombées importantes non seulement au niveau fondamental pour la compréhension des mécanismes moléculaires liés à la biologie des chondrocytes articulaires, mais aussi au niveau du développement d’outils génétiques permettant le dépistage de l’arthrose à un stade précoce. / Despite intensive efforts, the aetiology of Osteoarthritis (OA) remains elusive, however, genetic factors have been found to be strong determinants of the disease. Recent studies in Dr. Moreau’s lab have demonstrated an aberrant nuclear accumulation of PHB-1, a ubiquitous protein implicated in multiple cellular processes, in human OA articular chondrocytes. Moreover, we have shown that PHB-1 is part of a repressor complex that binds to the promoter of Pitx1 transcription factor, through the recognition of an E2F-like binding site which could contribute to OA onset. The role of Pitx1 and PHB-1 in OA pathogenesis is not clear, the goal of this study was to characterize PHB-1 nuclear accumulation in OA chondrocytes and to determine the molecular mechanisms by which PHB-1 accumulates in the nucleus of OA chondrocytes. In our studies we used U2Os and C28/I2 as well as human chondrocytes obtained from OA and control patients. Our data confirmed that PHB-1 accumulates in the nucleus of about 55 percent of OA patients and that this accumulation correlates with an increased in sumoylation of the proteins in the nuclear fraction of OA chondrocytes. Present findings suggest that increased sumoylation could trigger PHB-1 nuclear accumulation through binding of PHB-1 to a sumoylated protein via a SUMO interacting motif (SBM) mapped to residus 76 to 79 of PHB-1. Moreover, these results demonstrate that sumoylated proteins accumulate in PML nuclear bodies in the nucleus of OA chondrocytes, suggesting the recruitment of SUMO-interacting proteins in PML bodies of arthritic chondrocytes. Further studies are needed to identify the potential sumoylated proteins which are interacting with PHB1.

Au laboratoire du Dr. Bachand, l’orthologue chez la levure à fission de la protéine humaine PABPN1 qui est reliée à la dystrophie musculaire oculopharyngée a été découvert. Cette protéine se nomme Pab2. Elle a une localisation nucléaire, fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, et les arginines de son domaine arginine riche sont asymétriquement diméthylées tout comme son orthologue humain. Bien que ces protéines aient une localisation nucléaire, aucune étude in vivo n’a été effectuée afin d’élucider leur mécanisme d’import nucléaire. Dans mon premier projet de recherche, la levure à fission a été utilisée pour caractériser le mécanisme d’import nucléaire de ces protéines liant les queues poly(A). Il a été démontré que Pab2 détient un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS qui est suffisant et nécessaire à sa localisation nucléaire ainsi qu’à l’exécution de ses fonctions. De plus, il a été démontré que le PY-NLS de Pab2 provoque l’internalisation nucléaire de la protéine hétérologue GST-GFP-Pab2 (139-166). De concert avec un système d’import nucléaire de type PY-NLS, une délétion de la karyophérine Kap104, orthologue de la Kap?2 qui est le transporteur des cargos PY-NLS, engendre un défaut d’import nucléaire de Pab2. S’ensuit aussi par la démonstration d’une interaction physique directe entre Pab2 et Kap104. Il a été observé que la méthylation du domaine arginine riche en C-terminal, où se retrouve le PY-NLS, n’affecte pas la localisation de Pab2. Toutefois, dans un contexte où Pab2 détient un signal de localisation nucléaire sub-optimal ; la méthylation du domaine arginine riche réduit son efficacité d’import nucléaire. Finalement, une vérification in vivo de l’importance du mécanisme d’import de type PY-NLS de PABPN1 par un système d’inhibition spécifique de la Kap?2 a permis de confirmer que ce mécanisme d’import n’est pas nécessaire à sa localisation nucléaire. Suggérant la présence de systèmes d’imports nucléaires redondants ainsi que la possibilité d’une autre voie d’import nucléaire prioritaire pourPABPN1. Une analyse transcriptomique par micropuce d’ADN a permis d’identifier divers gènes surexprimés dans une cellule pab2?. Une des classes de gènes qui ont été identifiés se réfère à des éléments génétiques mobiles se dénommant Tƒ2 chez la levure à fission. La confirmation de l’accumulation d’environ deux fois des transcrits Tƒ2 dans une souche pab2? par buvardage Northern a fit naître mon deuxième projet de recherche. Plusieurs études ont démontré que Pab2 agit dans la même voie que Rrp6, une exonucléase 3’-5’, dans la maturation et la dégradation de divers transcrits de façon post-transcriptionnelle. Afin de corroborer une répression post-transcriptionnelle des Tƒ2 par Pab2; un essai génétique a été effectué en combinant sa délétion à celle d’une protéine, Abp1, connue pour réprimer de façon transcriptionnelle ces Tƒ2. Étonnamment, une diminution d’accumulation de transcrits Tƒ2 a été observée dans le double mutant comparativement au simple mutant abp1?. Une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par la Pol II a permis de confirmer que ce phénotype était d’ordre transcriptionnel. Les essais de ChIP ont aussi permis de corroborer un rôle post-transcriptionnel de répression des Tƒ2 par Pab2. Il a été démontré par un autre groupe de recherche qu’il y a activation du RNAi envers les Tƒ2 qui mènent à l’établissement d’une marque d’hétérochromatine dans un mutant rrp6?. Un dépistage de transcrits antisens aux Tƒ2 a permis d’en identifier un qui accumule dans un double mutant abp1?/pab2?. Il a aussi été observé que ce transcrit antisens accumule à des étapes spécifiques de la méiose. De plus, son accumulation dans des mutants génétiques ou bien en méiose corrèle négativement avec l’accumulation de l’ARNm des Tƒ2. [symboles non conformes]

L'intégration de l’ADN viral du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH 1) dans le génome humain est catalysé par la protéine intégrase. C’est une protéine clé pour l'infection du VIH. Cette protéine est toujours présente dans le complexe de préintégration (PIC). Le PIC est un grand complexe nucléoprotéique dont la taille et la composition sont variables. Ce complexe est formé après la transcription inverse et est transporté au noyau par le pore nucléaire. Integrase est exigé pour les étapes de transcription inverse, de migration du PIC le long des microtubules, d’import nucléaire, de ciblage de la chromatine et d'intégration.L'organisation spatiale du PIC et son mode de fonctionnement ne sont pas bien connus. L'objectif principal de mon travail a été l’étude du PIC au niveau de l’import nucléaire. Ce complexe que j’ai reconstitué in vitro est formé de trois protéines : la Transportine-SR2 et VBP1 humaines ainsi que de l’intégrase du VIH-1. Le clonage des différentes constructions, l'optimisation de la production des protéines individuelles, la reconstitution du complexe in vitro aussi bien que des données préliminaires sur la structure de ce complexe en cryomicroscopie électronique sont décrites dans ce manuscrit. / Integration of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) cDNA into the human genome is catalyzed by the viral integrase protein (IN). It is a key protein for HIV infection. This protein is always present in the preintegration complex (PIC). PIC is a large nucleoprotein complex of variable composition and size. This complex is formed after reverse transcription and is transported to the nucleus through nuclear pore. Integrase is required for the steps of reverse transcription, PIC migration along microtubules, transfer to the nucleus, chromatin targeting and integration.At present, PIC’s spatial organization and way of functioning are not well known. The main objective of my work was the study of the PIC at the nuclear import step. This complex I reconstituted In vitro is composed of three proteins: human Transportin-SR2 and VBP1 as well as viral integrase. The cloning of the different constructs, the optimization of the production of the individual proteins, in vitro complex reconstitution as well as preliminary data on the cryo-EM structure are described in the manuscript.