La protéine Core est la principale composante structurelle de la nucléocapside du virus de l’hépatite C (HCV). Cette protéine subit diverses modifications post-traductionnelles pour accomplir ses fonctions. Elle requiert des clivages successifs par des protéases cellulaires pour atteindre sa forme mature (177 aa). La maturation est effectuée par signal peptidase (SP), qui la sépare de la polyprotéine précurseur (191 aa), et par signal peptide peptidase (SPP). Nous avons identifié une autre modification chez la protéine Core, l’ajout d’un acide gras en C184, dans le domaine transmembranaire de la protéine immature. Des analyses mutationnelles démontrent que cette acylation contribue au clivage optimal de la protéine Core par SPP. Nous avons aussi identifié les enzymes responsables de l’acylation en C184. Ces résultats offrent une nouvelle perspective sur l’activité protéolytique de SPP et mettent en évidence l’importance des interactions avec l’hôte pour le cycle viral du HCV. / Hepatitis C virus (HCV) core protein is the main structural protein involved in assembly of the viral nucleocapsid. Core undergoes various post-translational modifications in order to perform its different functions. It requires successive processing by host proteases to reach its mature form (177 aa). The sequential cleavages are accomplished by signal peptidase (SP), which separates core from HCV polyprotein (191 aa), and by signal peptide peptidase (SPP). Herein, we identify another modification on core protein, the addition of fatty acid moiety at C184, in the transmembrane domain of the immature core. Mutational analysis demonstrates that acylation of C184 contributes to complete maturation of core via SPP processing. We also identify the enzymes responsible for the acylation of C184. These results show a new perspective on the requirements for proteolytic activity by SPP and highlight the importance of host interaction with the life cycle of HCV.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

Le virus de l'hépatite C infecte plus de 3% de la population mondiale et il n'existe aucun vaccin disponible à ce jour afin de prévenir l'infection. La cirrhose et la stéatose sont des manifestations pathologiques de l'infection chronique auxquelles s'ajoute également le développement de tumeurs chez certains patients. En utilisant des peptides marqués, des protéines recombinantes et des capsides produites in vivo, j'ai tenté de montrer que la protéine de la capside du VHC pénètre dans les cellules humaines, sous forme libre ou encapsidée. Les résultats démontrent que les deux formes de la protéine permettent l'entrée dans la cellule. Il semble également que le premier domaine basique (a.a. 5-24) soit impliqué dans l'entrée de la protéine libre. Le mécanisme d'entrée est inconnu. Cette entrée alternative permettrait au VHC d'élargir son tropisme cellulaire et de contribuer au développement des pathologies et à l'établissement de la persistance chez l'hôte.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique avec au dessus de 120 millions de personnes infectées et à ce jour aucun traitement capable de contrer de manière efficace ce virus. Le VHC a été découvert en 1989, classé dans la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hepacivirus. Il s’agit d’un virus enveloppé, formé donc d’une bicouche lipidique, d’une capside, et d’un acide nucléique (ARN). La capside virale est formée d’une seule et unique protéine appelée « Core ». Il s’agit d’une protéine de 177 acides aminés sous sa forme mature. Il a été démontré au sein du laboratoire du Professeur Denis Leclerc que la première moitié de la protéine (C82) était suffisante pour générer à la fois in vivo et in vitro la formation de la capside virale. Ayant comme objectif de comprendre les mécanismes régissant l’assemblage viral, nous avons étudié cette protéine d’un point de vue structural. Suite à la mise au point d’un protocole robuste d’expression, de marquage isotopique et de purification, nous avons étudié la Core C82 par dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la Core C82 est non structurée et flexible, confirmant ainsi l’analyse de la séquence primaire et les prédictions de structure secondaire de la Core. Nous avons ainsi mis en évidence que la moitié N-terminale de la Core du VHC appartenait à la famille des protéines intrinsèquement non structurées (IUP). Les IUPs sont des protéines peu ou très peu structurées et parfois capables de se structurer en liaison à un partenaire (protéine, acide nucléique, petite molécule). Nous avons donc, dans le but de structurer la Core C82, testé de multiples conditions de sel, détergent, agent lipomimétique et un partenaire protéique (protéine p53). Seul l’ajout d’un agent lipomimétique (2,2,2-trifluoroéthanol, TFE) à la Core C82 est venu modifier sa structure et sa dynamique. Nous avons ainsi pu démontrer que la Core C82 pouvait adopter une structure en hélice α. Nous avons, de plus, confirmé que ce repliement était également présent dans des versions tronquées plus longues de la Core (formes C124 et C170). Enfin, nous avons, parallèlement à son étude structurale, mis au point un test in vitro d’inhibition de l’assemblage. Cet outil nous a permis de découvrir plusieurs peptides dérivés de la séquence protéique de la Core et de la protéine NS5A du VHC, ayant un effet inhibiteur sur l’assemblage viral in vitro de la Core mature (C170). Ces travaux innovateurs représentent une avenue encourageante vers la découverte d’un moyen efficace de soigner l’infection au VHC. Au final, même si la structure 3D de la Core mature reste non déterminée, notre étude structurale de la Core C82 est la plus complète réalisée à ce jour à l’échelle atomique. Par ailleurs, nos travaux préliminaires sur la forme mature de la Core (C170) semblent être très prometteurs et permettraient de déterminer la structure 3D de la protéine Core mature. / The hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem with more than 120 million infected people, and to date no efficient treatment is available. HCV was discovered in 1989, classified in the flaviviridae family, and is the only member of the hepacivirus genus. It is an enveloped virus, consisting in a lipid bilayer, a capsid, and a ribonucleic acid (RNA). The viral capsid is composed by only one protein called “Core” protein. It is a 177 amino acid long protein in its mature form. It was demonstrated in our laboratory that the first half of this protein (C82) was sufficient to generate, both in vivo and in vitro, the assembly of the viral capsid. In order to understand the mechanism controlling the capsid assembly, we have studied the structural aspect of this protein. After developing robust protocols of overexpression, isotope labelling and purification of the protein C82, we studied this truncated form using circular dichroism and nuclear magnetic resonance. The experimental data obtained suggest that Core C82 is an unstructured and very flexible protein, thus confirming primary sequence analysis and secondary structure predictions. We established that the N-terminal half of the Core protein is a member of the intrinsically unstructured protein family (IUP). IUPs are proteins which are totally or partially unstructured, but can sometimes undergo a structural change induced by the binding of a partner (protein, nucleic acid, small molecule). In order to induce a structured form of the C82 protein, we have tested a large range of conditions of salt, detergent, lipomimetic solvent, as well as interaction with a proteic partner (p53). Only the addition of a lipomimetic agent (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) to the Core C82 protein resulted in a structural and a dynamical change. In this special condition, we were able to demonstrate that the Core C82 can adopt an α-helix conformation. We have, moreover, confirmed that this conformation was also present in longer truncated form of the Core protein (C124 and C170). We also, along its structural analysis, developed an in vitro test to inhibit the assembly of the Core protein. This tool allowed us to discover several small peptides derived from the HCV Core and NS5A proteins amino acid sequences, with an inhibitory effect on the viral assembly of the mature Core protein (C170). This innovative work is potentially an interesting step towards the development of an efficient treatment against HCV. Ultimately, even if the 3D structure of the mature Core protein remains unsolved, our structural study of the C82 truncated form is the most comprehensive study to date at an atomic resolution. Moreover, our preliminary works on the mature form of the Core protein (C170) are very promising and should eventually lead to the three dimensional structure.

Les vaccins ont été l'un des succès les plus spectaculaires de la médecine depuis les travaux révolutionnaires d'Edouard Jenner (1749-1823) et Louis Pasteur (1822-1895). L'approche traditionnelle de conception de vaccins, reposant principalement sur l'inoculation de pathogènes inactivés ou atténués, ne peut plus répondre aux besoins actuels en vaccinologie. En effet, l'émergence de nouveaux pathogènes (VIH, VHC) a poussé les scientifiques à raffiner leur approche en identifiant des nouvelles cibles immunoprotectrices (épitopes) et en inventant des nouveaux modes de présentation de ces cibles au système immunitaire. Ceux-ci ont pour objectif d'augmenter l'immunogénicité de cibles qui souvent sont peu immunogènes en raison de leur faible durée de vie dans l'organisme. Dans ce contexte, les pseudovirions (PV) constitués d'une protéine structurale capable de se multimériser et mimer l'organisation hautement répétitive d'un virus sauvage, sont des modes de présentation prometteurs. L'objectif de mon doctorat a été d'étudier et caractériser le potentiel d'un de ces pseudovirions formé à partir des nucléocapsides du virus de la Mosaïque de la Papaye (PapMV). Dans un premier temps, les résultats ont montré que les PV de PapMV sont capables d'induire in vivo une forte réponse humorale contre un épitope du VHC présenté à surface en de nombreuses copies. Cette réponse humorale est diversifiée (Th1/Th2), de longue durée, et entièrement dépendante du niveau de multimérisation de la nucléocapside. En effet, la nucléocapside mutée, présentant le même épitope et incapable de s'assembler en pseudovirion, perd toute immunogénicité. Dans un second temps, il a été démontré que les PV de PapMV présentant un épitope hautement conservé d'influenza (M2) sont capables de fournir une protection partielle in vivo contre une infection virale. Cette protection peut être améliorée de façon très importante si les PV de PapMV (PapMVCP-M2) sont adjuvantés avec des PV de PapMV sans fusion (PapMVCP). Ces résultats soulignent la nature versatile des PV de PapMV, pouvant être utilisés à la fois comme système de présentation d'épitopes mais aussi comme adjuvant. En outre, des expériences ont démontré que les modes de purification des PV pouvaient influer sur l'immunogénicité des PV de PapMVCP-M2. L'ensemble de ces résultats, associés à des études montrant l'efficacité des PV de PapMV pour induire une réponse cellulaire (LCT) protectrice, font des PV de PapMV un outil hautement attractif pour la conception des vaccins modernes.

En thérapie génique, les virus adéno-associés (AAV) ont prouvé maintes fois qu’ils étaient capables de transférer un gène désiré dans différents types de tissus cibles. La plupart des humains possèdent déjà une pré-immunité existante contre les sérotypes humains d’AAV, ce qui se caractérise par une réponse robuste des anticorps contre la capside virale contenant le transgène avant qu’il n’atteigne sa cible thérapeutique. Dû à ce phénomène, les nouveaux AAV avec une faible séroprévalence sont hautement attractifs comme véhicules de transfert de gènes. Des études ont démontré que les AAV découverts, provenant du porc comme AAVpo1 ou AAVpo2, ne sont pas reconnus par la pré-immunité humaine. Ce mémoire décrit des objectifs primaires de recherche comme l’isolation de nouveaux sérotypes d’AAV provenant des fèces de porc, la production des nouveaux vecteurs viraux et la caractérisation de leur capacité de transduction in vitro. Les résultats ont démontré que les nouveaux vecteurs AAV porcins sont capables de transduire une bonne variété de cellules et de tissus. Aussi, des évidences d’échanges de génome du gène CAP entre 2 AAV ont été trouvées durant le processus de la recherche. Même si les nouveaux vecteurs AAV ont réussi à transduire des lignées cellulaires avec succès, des études plus poussées sur la bio distribution du vecteur chez les souris seront nécessaires pour vérifier la fiabilité de ces nouveaux vecteurs.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Gp12 est une protéine qui se fixe symétriquement au centre de chacun des 60 hexamères de la capside icosaédrique du bactériophage SPP1. La protéine produite dans un système d’expression hétérologue se lie à la capside de particules virales dont le gène codant gp12 a été inactivé. Cette interaction a lieu spécifiquement avec des capsides qui ont subi le processus d’expansion et encapsulé l'ADN viral.L'analyse de la séquence de gp12 montre la présence d'un motif (GXY)n retrouvé dans des protéines de type collagène. Nous avons démontré que gp12 est un trimère allongé en solution. Ce trimère s'avère sensible à la collagénase VII qui coupe la protéine gp12 dans un site spécifique du motif (GXY)8. Le profil de dichroïsme circulaire de gp12 porte aussi la signature d'une protéine de type collagène. La fixation de gp12 sur la capside virale conduit à une augmentation de 20°C de sa stabilité thermique. Gp12 peut être dénaturée-dissociée et puis renaturée-reassociée sous l'effet de la température. Le trimer de gp12 et sa forme dénaturée se fixent à la capside de SPP1 mais avec des profils d’interaction différents. Ces propriétés permettent d’utiliser gp12 comme un ligand réversible de la capside phagique en fonction de la température. Gp12 a une organisation modulaire avec un motif collagène qui sépare les modules amino et carboxyl-terminaux. Des protéines avec une organisation similaire sont codées par des gènes adjacents à celui codant pour la protéine majoritaire de la capside dans des prophages de Bacilli, suggérant une fonction similaire à gp12. Leurs modules ont une taille variable. Une recherche de protéines procaryotes et virales avec des segments collagène a montré qu’elles sont abondantes parmi les bactéries et les virus. Le motif est rare parmi les archées et leurs virus. Ces résultats montrent l’importance des protéines avec des séquences de type collagène dans le monde non-eucaryote et du développement de leur étude biochimique et fonctionnelle. / Gp12 is a protein found distributed symmetrically at the surface of the icosahedral capsid from bacteriophage SPP1. Recombinant gp12 binds to phage particles whose gene coding for gp12 was disrupted. This interaction occurs specifically with capsids that undergone expansion and packaged DNA.The gp12 protein sequence is marked by the presence of a stretch of 8 repeats of a GXY motif, which is the sequence signature of collagen. Our results showed that gp12 is an elongated trimer in solution. The trimer is sensitive to collagenase VII that cuts the gp12 protein inside the collagen motif. Its circular dichroism profile has also the signature of a collagen-like protein. Binding of gp12 to SPP1 capsids increases its thermal stability by 20°C. Gp12 is denatured and dissociated reversibly by temperature shift. The gp12 trimer and its denatured form bind to SPP1 capsids but with a different interaction behavior. These properties allow to use gp12 as thermo-switchable SPP1 capsid binder. Gp12 has a modular organization with a central collagen motif that connects the amino and carboxyl termini. Proteins with a similar organization that are encoded by genes adjacent to the gene coding for the major capsid protein were identified in prophages of Bacilli, suggesting a function similar to gp12. Their modules have a variable length.A pangenome-wide search for collagen-like proteins in prokaryotes and viruses shows that they are abundant among bacteria and viruses. In contrast, this motif is rare is archaea and their viruses. Our analysis highlights the importance of collagen-like proteins in the non-eukaryotic world and supports the interest to develop their biochemical and structural study.

La surface externe du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) a été caractérisée par deux approches différentes : biochimique et immunologique. Sept régions ont été identifiées. Trois régions de surface (les extrémités N- et C-terminales, ainsi que la région 117 à 136) peuvent être considérées comme étant dominantes puisqu’elles ont été ciblées par les deux approches. Les régions 141-152, 173-184, 189-200 et 205-215 ont été révélées par l’approche immunologique seulement. De plus, un criblage de l’épitope HA11 du virus de l’Influenza à plusieurs sites a permis de valider le potentiel du PapMV à présenter des épitopes en surface. Les extrémités N- et C-terminales et la position 187 supportent l’insertion du peptide HA11 à la surface. Seulement la fusion à l’extrémité N-terminal en position 12 donne des particules stables à température corporelle des animaux et permettent de lever une réponse immunitaire contre le peptide HA11. Donc, la stabilité des nanoparticules est essentielle à l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. / Surface-exposed regions of Papaya Mosaic Virus (PapMV) were evaluated by two different methods: immunoblot assay and chemical modifications followed by mass spectrometry. Three regions were targeted by both techniques: the N- and C-termini and region 125-136. These regions are therefore considered to be major surface epitopes. Four other regions were only detected by the immunological technique: regions 117-128, 141-152, 173-184 and 189-200. Sites of fusion using the Influenza virus HA11 peptide were evaluated on the PapMV vaccine platform. Fusions of HA11 at three functional sites located after amino acids 12 and 187 and at the C-terminus led to the production of PapMV particles. It was successfully demonstrated that the HA11 epitope was located at the surface of the particles. The stability and immunogenicity of the nanoparticles were evaluated, and a direct correlation was established between the stability of the particles and their ability to trigger an efficient immune response against HA11.