Le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique avec au dessus de 120 millions de personnes infectées et à ce jour aucun traitement capable de contrer de manière efficace ce virus. Le VHC a été découvert en 1989, classé dans la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hepacivirus. Il s’agit d’un virus enveloppé, formé donc d’une bicouche lipidique, d’une capside, et d’un acide nucléique (ARN). La capside virale est formée d’une seule et unique protéine appelée « Core ». Il s’agit d’une protéine de 177 acides aminés sous sa forme mature. Il a été démontré au sein du laboratoire du Professeur Denis Leclerc que la première moitié de la protéine (C82) était suffisante pour générer à la fois in vivo et in vitro la formation de la capside virale. Ayant comme objectif de comprendre les mécanismes régissant l’assemblage viral, nous avons étudié cette protéine d’un point de vue structural. Suite à la mise au point d’un protocole robuste d’expression, de marquage isotopique et de purification, nous avons étudié la Core C82 par dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la Core C82 est non structurée et flexible, confirmant ainsi l’analyse de la séquence primaire et les prédictions de structure secondaire de la Core. Nous avons ainsi mis en évidence que la moitié N-terminale de la Core du VHC appartenait à la famille des protéines intrinsèquement non structurées (IUP). Les IUPs sont des protéines peu ou très peu structurées et parfois capables de se structurer en liaison à un partenaire (protéine, acide nucléique, petite molécule). Nous avons donc, dans le but de structurer la Core C82, testé de multiples conditions de sel, détergent, agent lipomimétique et un partenaire protéique (protéine p53). Seul l’ajout d’un agent lipomimétique (2,2,2-trifluoroéthanol, TFE) à la Core C82 est venu modifier sa structure et sa dynamique. Nous avons ainsi pu démontrer que la Core C82 pouvait adopter une structure en hélice α. Nous avons, de plus, confirmé que ce repliement était également présent dans des versions tronquées plus longues de la Core (formes C124 et C170). Enfin, nous avons, parallèlement à son étude structurale, mis au point un test in vitro d’inhibition de l’assemblage. Cet outil nous a permis de découvrir plusieurs peptides dérivés de la séquence protéique de la Core et de la protéine NS5A du VHC, ayant un effet inhibiteur sur l’assemblage viral in vitro de la Core mature (C170). Ces travaux innovateurs représentent une avenue encourageante vers la découverte d’un moyen efficace de soigner l’infection au VHC. Au final, même si la structure 3D de la Core mature reste non déterminée, notre étude structurale de la Core C82 est la plus complète réalisée à ce jour à l’échelle atomique. Par ailleurs, nos travaux préliminaires sur la forme mature de la Core (C170) semblent être très prometteurs et permettraient de déterminer la structure 3D de la protéine Core mature. / The hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem with more than 120 million infected people, and to date no efficient treatment is available. HCV was discovered in 1989, classified in the flaviviridae family, and is the only member of the hepacivirus genus. It is an enveloped virus, consisting in a lipid bilayer, a capsid, and a ribonucleic acid (RNA). The viral capsid is composed by only one protein called “Core” protein. It is a 177 amino acid long protein in its mature form. It was demonstrated in our laboratory that the first half of this protein (C82) was sufficient to generate, both in vivo and in vitro, the assembly of the viral capsid. In order to understand the mechanism controlling the capsid assembly, we have studied the structural aspect of this protein. After developing robust protocols of overexpression, isotope labelling and purification of the protein C82, we studied this truncated form using circular dichroism and nuclear magnetic resonance. The experimental data obtained suggest that Core C82 is an unstructured and very flexible protein, thus confirming primary sequence analysis and secondary structure predictions. We established that the N-terminal half of the Core protein is a member of the intrinsically unstructured protein family (IUP). IUPs are proteins which are totally or partially unstructured, but can sometimes undergo a structural change induced by the binding of a partner (protein, nucleic acid, small molecule). In order to induce a structured form of the C82 protein, we have tested a large range of conditions of salt, detergent, lipomimetic solvent, as well as interaction with a proteic partner (p53). Only the addition of a lipomimetic agent (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) to the Core C82 protein resulted in a structural and a dynamical change. In this special condition, we were able to demonstrate that the Core C82 can adopt an α-helix conformation. We have, moreover, confirmed that this conformation was also present in longer truncated form of the Core protein (C124 and C170). We also, along its structural analysis, developed an in vitro test to inhibit the assembly of the Core protein. This tool allowed us to discover several small peptides derived from the HCV Core and NS5A proteins amino acid sequences, with an inhibitory effect on the viral assembly of the mature Core protein (C170). This innovative work is potentially an interesting step towards the development of an efficient treatment against HCV. Ultimately, even if the 3D structure of the mature Core protein remains unsolved, our structural study of the C82 truncated form is the most comprehensive study to date at an atomic resolution. Moreover, our preliminary works on the mature form of the Core protein (C170) are very promising and should eventually lead to the three dimensional structure.

La surface externe du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) a été caractérisée par deux approches différentes : biochimique et immunologique. Sept régions ont été identifiées. Trois régions de surface (les extrémités N- et C-terminales, ainsi que la région 117 à 136) peuvent être considérées comme étant dominantes puisqu’elles ont été ciblées par les deux approches. Les régions 141-152, 173-184, 189-200 et 205-215 ont été révélées par l’approche immunologique seulement. De plus, un criblage de l’épitope HA11 du virus de l’Influenza à plusieurs sites a permis de valider le potentiel du PapMV à présenter des épitopes en surface. Les extrémités N- et C-terminales et la position 187 supportent l’insertion du peptide HA11 à la surface. Seulement la fusion à l’extrémité N-terminal en position 12 donne des particules stables à température corporelle des animaux et permettent de lever une réponse immunitaire contre le peptide HA11. Donc, la stabilité des nanoparticules est essentielle à l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. / Surface-exposed regions of Papaya Mosaic Virus (PapMV) were evaluated by two different methods: immunoblot assay and chemical modifications followed by mass spectrometry. Three regions were targeted by both techniques: the N- and C-termini and region 125-136. These regions are therefore considered to be major surface epitopes. Four other regions were only detected by the immunological technique: regions 117-128, 141-152, 173-184 and 189-200. Sites of fusion using the Influenza virus HA11 peptide were evaluated on the PapMV vaccine platform. Fusions of HA11 at three functional sites located after amino acids 12 and 187 and at the C-terminus led to the production of PapMV particles. It was successfully demonstrated that the HA11 epitope was located at the surface of the particles. The stability and immunogenicity of the nanoparticles were evaluated, and a direct correlation was established between the stability of the particles and their ability to trigger an efficient immune response against HA11.

La protéine Core est la principale composante structurelle de la nucléocapside du virus de l’hépatite C (HCV). Cette protéine subit diverses modifications post-traductionnelles pour accomplir ses fonctions. Elle requiert des clivages successifs par des protéases cellulaires pour atteindre sa forme mature (177 aa). La maturation est effectuée par signal peptidase (SP), qui la sépare de la polyprotéine précurseur (191 aa), et par signal peptide peptidase (SPP). Nous avons identifié une autre modification chez la protéine Core, l’ajout d’un acide gras en C184, dans le domaine transmembranaire de la protéine immature. Des analyses mutationnelles démontrent que cette acylation contribue au clivage optimal de la protéine Core par SPP. Nous avons aussi identifié les enzymes responsables de l’acylation en C184. Ces résultats offrent une nouvelle perspective sur l’activité protéolytique de SPP et mettent en évidence l’importance des interactions avec l’hôte pour le cycle viral du HCV. / Hepatitis C virus (HCV) core protein is the main structural protein involved in assembly of the viral nucleocapsid. Core undergoes various post-translational modifications in order to perform its different functions. It requires successive processing by host proteases to reach its mature form (177 aa). The sequential cleavages are accomplished by signal peptidase (SP), which separates core from HCV polyprotein (191 aa), and by signal peptide peptidase (SPP). Herein, we identify another modification on core protein, the addition of fatty acid moiety at C184, in the transmembrane domain of the immature core. Mutational analysis demonstrates that acylation of C184 contributes to complete maturation of core via SPP processing. We also identify the enzymes responsible for the acylation of C184. These results show a new perspective on the requirements for proteolytic activity by SPP and highlight the importance of host interaction with the life cycle of HCV.

Le Virus de la Mosaïque de la Papaye est un virus végétal filamenteux flexible. Son unique protéine structurale, la protéine de capside, est composée de 215 acides aminés. Le but de ce présent projet de recherche est de déterminer l'importance de l'extrémité N-terminale de la CP dans l'assemblage du PapMV. Des études antérieures à ce projet ont démontré que la délétion des cinq premiers acides aminés de la CP (CP6-215) n'affectait pas la capacité de la CP à se multimériser, alors qu'une délétion des vingt-six premiers acides aminés (CP27.215) conduisait à une incapacité de la CP à se multimériser. L'élaboration de mutants de délétion à l'extrémité N-terminale ainsi que leur expression dans la bactérie E. coli a permis de mettre en évidence l'importance de la phénylalanine retrouvée à la position 13 de la CP. Des mutations ponctuelles pour cet acide aminé ont permis de révéler le rôle que jouait l'hydrophobicité à l'extrémité N-terminale dans la multimérisation de la protéine de capside.