L’objectif de ce projet est d’étudier une nouvelle voie de thérapie basée sur l’échographie de contraste. Les agents de contraste utilisés sont capables de vectoriser différentes molécules chimiques et de les libérer lorsqu’ils sont détruits par le biais des ultrasons. Cette méthode permet donc un traitement ciblé et contrôlé ce qui a pour avantages de réduire la quantité de principe actif (donc des effets de secondaires). De plus, les microbulles augmentent la perméabilité cellulaire ou tissulaire donc améliore leur incorporation cellulaire. Cependant le mécanisme n’est pas connu. In vitro, nous avons utilisé un ensemble de techniques dont le patch clamp pour visualiser les échanges trans-membranaires et la TEER pour les modifications de la perméabilité trans-endothéliales. In vivo, nous avons effectué des ECG pour observer et comprendre les effets secondaires afin de mieux les prévenir. Le but de la thèse est d’aboutir à la connaissance du phénomène d’augmentation de la perméabilité induite par les ultrasons et les microbulles afin de pouvoir l’optimiser. / The aim of this work is to study a new way of therapy based on the contrast ultrasonography. The used contrast agents are able of transport different chemical molecules and to liberate them when they are destroyed by means of ultrasounds. This method allows a controlled and targeted treatment therefore what has as advantages to reduce drugs quantity (therefore side effects). Moreover, microbubbles augment cell or tissue permeability therefore ameliorates their cell uptake. However, the mechanism is not known. In vitro, we used the whole technology of which the patch clamp to show exchanges through the cell membrane and TEER for modification of trans-endothelial permeability. In vivo, we have performed ECG to notice and understand side effects to their apparition. The purpose of PhD work is to succeed to the knowledge of the phenomenon of increase of the permeability led by ultrasounds and microbubbles to be able to optimise it.

Des études récentes ont démontré que les activités des agents de contraste ultrasonoresous l’effet des ultrasons modulent transitoirement la perméabilité de la membraneplasmique des cellules. Ce procédé aussi appelé sonoporation est étudié pour incorporer desmolécules extracellulaires telles que des gènes thérapeutiques. Le but de la thèse fut d’étudierl’effet des paramètres acoustiques et expérimentaux pour une transfection efficace des cellulesin vitro et in vivo. Parallèlement, afin de clarifier le mécanisme de perméabilisation induit lorsde la sonoporation, nous avons, d’une part, étudié l’effet des ultrasons et des microbulles surla libération de molécules intracellulaires et d’autre part, observé en microscopie électroniqueles effets des ultrasons et des microbulles sur la membrane plasmique et sur l’incorporation denanoparticules d’or. / Future applications of ultrasound and microbubbles extend beyond imaging applications.Over the last few years, reports have shown that the activation of contrast microbubblesunder ultrasound waves, transiently modulates the cell membrane permeability. This process,named sonoporation has been studied to incorporate extracellular molecules such as therapeuticgenes. The aim of this work was to study the effect of various interrogation parameters toachieve an efficient cell transfection in vitro as well as in vivo. In parallel, and in order to clarifythe mechanism of permeabilization induced by sonoporation, we investigated the effect ofultrasound and microbubbles on release of intracellular molecules from fluorescent cells. Moreover,using electron microscopy, we examined the effect of the sonoporation process on thecell membrane and on incorporation of gold nanoparticles.

Nous avons étudié la stabilisation de microbulles d'air par les tensioactifs semi-fluorés CF3(CF2)n-1(CH2)mOP(O)(OH)2 (FnHmPhos, où n = 8, 10, m = 2) et des nanoparticules magnétiques d'oxyde de fer et de ferrite de cobalt. Ces nouveaux objets combinant propriétés acoustiques et magnétiques pourraient servir d'agent de contraste à la fois en échographie et en imagerie IRM. Nous avons étudié des propriétés physico-chimiques des tensioactifs en solution et à l'interface aireau. Nous avons montré par tensiométrie dynamique et par des études de films de Langmuir que les tensioactifs F8H2Phos et F10H2Phos forment des monocouches dont le module élastique est très élevé, ce qui favorise la stabilisation de bulles de petite taille ainsi que de bulles non-sphériques. Nous avons proposé une approche de dégonflement/gonflement contrôlé en faisant varier la pression dans la bulle par la température et nous avons étudié le froissement de la paroi des bulles pendant le dégonflement. Des microbulles portant des nanoparticules ont été obtenues dans une suspension des nanoparticules d'oxyde de fer ou de ferrite de cobalt en présence de F8H2Phos ou F10H2Phos, en déstabilisant la suspension par NaCl, ce qui permet de diminuer la barrière électrostatique entre les nanoparticules et la surface des bulles et de favoriser l'adsorption. Les microbulles obtenues sont stables pendant plus d'une semaine grâce à la paroi rigide des nanoparticules.

Sous l’action d’une excitation ultrasonore spécifique, les microbulles d’agents de contraste présentent des oscillations non linéaires. Considérant leur taille et la complexité du phénomène, des expériences et/ou des simulations complexes et onéreuses sont requises. Pour éviter cela, l’utilisation d’une analogie est proposée et validée numériquement. Lorsqu’elles sont soumises aux ultrasons, les microbulles (1-8 µm) présentent une dynamique assez riche et néanmoins complexe dont certains aspects peuvent être décrits par un réseau d’oscillateurs couplés non-linéaires. Dans cette thèse, nous proposons d’étudier le comportement oscillatoire d’une microbulle via un système acousto-mécanique de pendules couplés paramétriquement excités par une force verticale. Il s’agit de comprendre la dynamique d’une bulle unique pour l’étudier ensuite dans des conditions expérimentales et cliniques pour des applications en imagerie et en thérapie. Du point de vue théorique, nous avons montré que les deux systèmes sont décrits par une équation de Mathieu. D’un point de vue expérimental, nous avons développé la chaîne de pendules. Celle-ci consiste en un cercle d’aluminium sur lequel sont fixés des pendules à l’aide de fil de nylon. La chaîne de pendules repose sur le système d’excitation qui génère une excitation sinusoïdale variant de 1 Hz à 5 Hz. Les résultats obtenus (modes de vibration, oscillation sous-harmonique, oscillation radiale) ont été validés par une étude numérique et sont en accord avec les résultats obtenus pour les microbulles. / Under specific ultrasound excitation, contrast microbubbles undergo nonlinear oscillations. Considering the size and the complexity of the phenomenon, expensive and complex experiments and/or simulations are required. To overcome this, the use of an analogy is proposed and validated numerically. When subjected to ultrasound, microbubbles present a fairly rich and complex dynamics of which some aspects can be described by a lattice of nonlinearly coupled oscillators. In this thesis, we propose to study the oscillatory behavior of a microbubble through an acousto-mechanical setup of coupled pendula parametrically excited by a vertical force. The aim of this work is to understand the dynamics of a single bubble, to subsequently study it in experimental and clinical conditions for both imaging and therapy. From the theoretical point of view, we have shown that both systems are described by a Mathieu type equation. From the experimental point of view, we have developped the pendula ring. It consists of an aluminum ring on which pendula are fixed with nylon strings. The pendula chain lies on the excitation system that generate a sinusoidal excitation ranging from 1 Hz to 5 Hz. Results obtained (vibration modes, subharmonic oscillations, radial mode) are in agreement with simulations and are similar to the results obtained for microbubbles.

Le tendon est un organe impliqué dans de nombreux troubles musculo squelettiques. Les connaissances des différentes molécules impliquées dans la biologie des tendons permettent d’envisager des traitements par thérapie génique. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer la faisabilité de transférer des gènes dans les tendons par deux méthodes non virales : une méthode chimique utilisant des nanoparticules de silice mésoporeuses et une méthode physique reposant sur l’utilisation des ultrasons et des microbulles de gaz (sonoporation). Dans une première étude, nous avons montré que des nanoparticules de silice mésoporeuses sont capables de transférer efficacement des gènes dans le tendon d’Achille de rat. Celles-ci ont été utilisées pour transférer le gène du facteur de croissance PDGF dans des tendons lésés. Nos résultats indiquent une accélération de la réparation du tendon lésé. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la sonoporation, technique jamais appliquée aux tendons. Nous avons déterminé les paramètres acoustiques permettant un transfert de gènes efficace dans le tendon d'Achille de souris. Une expression stable d’un transgène a été maintenue pendant 100 jours suite à une injection locale d’ADN en présence de microbulles de gaz. Nous avons ensuite utilisé cette méthode dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène de la fibromoduline possédant des fibres de collagène anormales. Une restauration remarquable du phénotype de ces souris a été observée suite au transfert du gène de la fibromoduline. Nous avons ensuite étudié les interactions entre les microbulles, la membrane plasmique et le transfert de gènes dans les cellules sous ultrasons. Ces études ont permis d’identifier pour la première fois, une pénétration des microbulles de gaz dans la cellule et un trafic intracellulaire de l’ADN impliquant la voie d’endocytose clathrine dépendante. En conclusion, les deux méthodes de transfert de gènes non virales ont permis de transfecter des gènes efficacement dans les tendons. Ces résultats prometteurs permettent d’envisager leur exploitation pour des applications thérapeutiques dans les pathologies tendineuses. / Tendons are often involved in many musculoskeletal disorders. Knowledge of the different molecules involved in tendons biology allows to consider treatments based on gene therapy. The goal of my work was to evaluate the feasibility of gene transfer in tendons by using two non-viral methods: mesoporous silica nanoparticles and a physical method based on ultrasound-assisted gas microbubbles (sonoporation). In the first study, we showed that mesoporous silica nanoparticles could efficiently transfer genes in rat Achilles tendon. They were used to transfer plasmid DNA encoding PDGF growth factor gene in injured tendons. Data demonstrated that DNA/MSN complexes have improved the healing of injured tendons. In the second study, we used the sonoporation method which has never been applied to the tendons. First, we determined the acoustic parameters for gene transfer in mice Achilles tendon. A stable expression of the transgene was maintained up to 100 days following one local injection of DNA in the presence of gas microbubbles. We then used this method to restore the fibromodulin knocked out gene in a transgenic mouse model having disorganized collagen fibers in tendons. Following the transfer of fibromodulin gene, a remarkable restoration of collagen fibers in these mice was observed. In the last part, we studied the interactions of microbubbles with the plasma membrane and the plasmid DNA internalization into the cells by sonoporation. These studies have identified for the first time a rapid penetration of gas microbubbles inside the cell and an intracellular routing of DNA involving the clathrinmediated endocytosis pathway. In conclusion, both methods of non viral gene transfer led to an efficient gene transfer in tendons. These promising results obtained during this project allow considering their use for therapeutic applications in tendon diseases.

Les accidents de désaturation (ADD) résultent de la formation de microbulles dans les tissus lors de la décompression. De nombreux corps de métiers sont concernés par cette problématique : plongeurs, astronautes, tunneliers, personnel médical hyperbare... On observe que ces accidents peuvent survenir alors même que les tables de décompression sont respectées. La détection et la caractérisation des bulles de décompression présentent un intérêt diagnostic potentiel pour la prévention des ADD. Aujourd’hui, la détection de microbulles est réalisée par des personnels de santé expérimentés en utilisant des systèmes Doppler. Cependant, cette approche présente une grande dépendance à l'opérateur et ne permet pas d'obtenir une information quantitative (nombre, taille) sur la distribution des bulles circulantes. Par ailleurs, elle n'est pas adaptée à la détection de bulles tissulaires.Ces limitations conduisent à mettre en oeuvre une méthode ultrasonore bifréquentielle de détection et de caractérisation par mise en résonance des microbulles. Les contraintes de mesure temps-réel, de polydispersité en taille ([1 à 200 μm]) et de sursaturation des tissus imposent d'utiliser des ondes d'excitation de très faibles puissances mais très large bande.Les solutions mises en oeuvre visent d'une part à réduire la complexité de l'instrumentation et d'autre part à prendre en considération la dynamique de l'excitation. Par ailleurs, une solution originale, ayant fait l’objet d’un dépôt de brevet, est développée. Elle permet de s'affranchir de la mise en résonance tout en conservant un caractèrediscriminant séparant bulles et tissus. / Decompression sicknesses (DCS) are a consequence of microbubbles formation in tissues during decompression. Many fields are affected by this issue: divers, astronauts, tunneling, hyperbaric medical staff... It is observed that these accidents can occur even if the decompression tables are respected. The detection and characterization of decompression bubbles have a diagnostic potential for the prevention of DCS. Today, the detection of microbubbles is performed by experienced health workers using Doppler systems. However, this approach has a high dependence on the operator and does not provide quantitative information (number, size) about the distribution of circulating bubbles. Moreover, it is not suitable for the detection of stationary bubbles (tissue bubbles).These limitations lead to the development of a bi-frequency ultrasonic method for microbubbles detection and characterization by setting them into resonance. The constraints as real-time measurements, size polydispersity ([1 to 200 μm]) and saturation of tissues require the use of very low powerful excitation but high bandwidth waves.The solutions implemented are aimed firstly to reduce the complexity of the instrumentation and secondly to consider the dynamics of the excitation. In addition, an original solution, protected by a patent, has been developed. It allows to overcome the measurement of resonance while maintaining a discriminating character between bubbles and tissues.

Dans l'imagerie moléculaire par ultrasons, des microbulles sont fonctionnalisées avec des ligands. Après injection intraveineuse, ces microbulles ciblées s'accrochent aux marqueurs présents sur l'endothélium tumoral et permettent une détection non-invasive. Dans cette thèse, l'imagerie moléculaire par ultrasons a été développée pour la détection de la nétrine-1, qui est surexprimée dans 70% des cancers du sein et promeut la survie cellulaire. Une nouvelle thérapie moléculaire interférant avec la nétrine-1 a été développée et nécessite l'identification des patientes qui pourront bénéficier de ce traitement. Avec l'imagerie moléculaire de la nétrine-1, il a été possible de discriminer les tumeurs positives pour la nétrine-1 des tumeurs négatives. Par sa capacité à détecter de manière spécifique la nétrine-1 présentée sur l'endothélium des tumeurs, cette technique d'imagerie pourrait donc devenir un test d'accompagnement pour la thérapie d'interférence de la nétrine-1 chez les patientes atteintes de cancer du sein.La destruction ciblée des microbulles par ultrasons induit la cavitation et la sonoporation qui perméabilisent le tissu et facilite la délivrance locale de médicaments. De plus, cette destruction ciblée peut induire l'infiltration de cellules immunitaires et la libération d'antigènes tumoraux, déclenchant une réponse immunitaire anti-tumorale. Dans cette thèse, nous avons quantifié l'activation de la réponse immunitaire dans le carcinome hépatocellulaire, suivant la délivrance de nanoparticules chargés en microARN-122 et anti-microARN-21. Dans les nœuds lymphocytaires tumoraux, une baisse d'expression des cytokines pro-tumorales et une augmentation d'expression des cytokines anti-tumorales ont été observées, suggérant une réponse thérapeutique positive. L'approche thérapeutique de destruction ciblée des microbulles par ultrasons pour la délivrance de micro-ARN s'avère donc être un outil immuno-modulatoire puissant / Ultrasound molecular imaging uses microbubbles as ultrasound contrast agents which are functionalized with targeting ligands. Upon intravenous injection, targeted microbubbles bind to molecular markers presented on the tumor endothelium and enable the non-invasive assessment cancer-related biomarkers. In the present thesis, ultrasound molecular imaging was developed for detection of netrin-1, which is upregulated in 70% of metastatic breast cancer and promotes cell survival. A newly developed netrin-1 interference therapy requires the identification of patients who overexpress the target protein and, could benefit from anti-netrin-1 therapy. In vivo imaging of netrin-1 showed a significantly increased imaging signal in netrin-1-positive breast tumors compared to netrin-1-negative breast tumors and normal mammary glands. The results suggest that ultrasound molecular imaging allows accurate detection of netrin-1 on the endothelium of netrin-1-positive tumors and has the potential to become a companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer patients.Ultrasound-targeted microbubble destruction triggers cavitation and sonoporation thereby permeabilizing the tissue and facilitating local drug delivery. Further, immune cell infiltration and tumor antigen release are induced and trigger anti-tumor immune responses. In the present thesis, ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated delivery of anti-cancer microRNA-122 and anti-microRNA-21 is studied for immune response activation in hepatocellular carcinoma, in which the immune microenvironment is deregulated. Tumor lymph nodes showed pro-tumor cytokine downregulation and anti-tumor cytokine upregulation, suggesting an overall positive therapy response with regard to the tumor immunology. The results identified ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated miRNA delivery as a potent immuno-modulatory therapeutic approach

Le tendon est un organe impliqué dans de nombreux troubles musculo squelettiques. Les connaissances des différentes molécules impliquées dans la biologie des tendons permettent d'envisager des traitements par thérapie génique. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer la faisabilité de transférer des gènes dans les tendons par deux méthodes non virales : une méthode chimique utilisant des nanoparticules de silice mésoporeuses et une méthode physique reposant sur l'utilisation des ultrasons et des microbulles de gaz (sonoporation). Dans une première étude, nous avons montré que des nanoparticules de silice mésoporeuses sont capables de transférer efficacement des gènes dans le tendon d'Achille de rat. Celles-ci ont été utilisées pour transférer le gène du facteur de croissance PDGF dans des tendons lésés. Nos résultats indiquent une accélération de la réparation du tendon lésé. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la sonoporation, technique jamais appliquée aux tendons. Nous avons déterminé les paramètres acoustiques permettant un transfert de gènes efficace dans le tendon d'Achille de souris. Une expression stable d'un transgène a été maintenue pendant 100 jours suite à une injection locale d'ADN en présence de microbulles de gaz. Nous avons ensuite utilisé cette méthode dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène de la fibromoduline possédant des fibres de collagène anormales. Une restauration remarquable du phénotype de ces souris a été observée suite au transfert du gène de la fibromoduline. Nous avons ensuite étudié les interactions entre les microbulles, la membrane plasmique et le transfert de gènes dans les cellules sous ultrasons. Ces études ont permis d'identifier pour la première fois, une pénétration des microbulles de gaz dans la cellule et un trafic intracellulaire de l'ADN impliquant la voie d'endocytose clathrine dépendante. En conclusion, les deux méthodes de transfert de gènes non virales ont permis de transfecter des gènes efficacement dans les tendons. Ces résultats prometteurs permettent d'envisager leur exploitation pour des applications thérapeutiques dans les pathologies tendineuses.

Nous avons étudié la stabilisation de microbulles d’air par les tensioactifs semi-fluorés CF3(CF2)n-1(CH2)mOP(O)(OH)2 (FnHmPhos, où n = 8, 10, m = 2) et des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer et de ferrite de cobalt. Ces nouveaux objets combinant propriétés acoustiques et magnétiques pourraient servir d’agent de contraste à la fois en échographie et en imagerie IRM. Nous avons étudié des propriétés physico-chimiques des tensioactifs en solution et à l’interface aireau. Nous avons montré par tensiométrie dynamique et par des études de films de Langmuir que les tensioactifs F8H2Phos et F10H2Phos forment des monocouches dont le module élastique est très élevé, ce qui favorise la stabilisation de bulles de petite taille ainsi que de bulles non-sphériques. Nous avons proposé une approche de dégonflement/gonflement contrôlé en faisant varier la pression dans la bulle par la température et nous avons étudié le froissement de la paroi des bulles pendant le dégonflement. Des microbulles portant des nanoparticules ont été obtenues dans une suspension des nanoparticules d’oxyde de fer ou de ferrite de cobalt en présence de F8H2Phos ou F10H2Phos, en déstabilisant la suspension par NaCl, ce qui permet de diminuer la barrière électrostatique entre les nanoparticules et la surface des bulles et de favoriser l’adsorption. Les microbulles obtenues sont stables pendant plus d’une semaine grâce à la paroi rigide des nanoparticules. / The stabilization of air microbubbles by semi-fluorinated surfactants CF3(CF2)n-1(CH2)mOP(O)(OH)2 (FnHmPhos, where n = 8, 10, m = 2) and iron oxide nanoparticles was studied in order to design novel microbubbles that possess both acoustical and magnetic properties. Such microbubbles have potential applications as dual constrast agents by enhancing the signals from both ultrasonography and MRI imaging. We have studied physic-chemical properties of the surfactants in solution and at water-air interface. We have demonstrated by dynamic tensiometry and studies of Langmuir monolayers that F8H2Phos and F10H2Phos form highly elastic interfacial films that are favorable for long-term stabilization of small bubbles and bubbles of non-spherical shape. We designed an approach of temperature-controlled pumping/shrinking of the microbubbles and demonstrated the correlation of the collapse structures of the bubble shell with microbubble stability. The stabilization of microbubbles by iron oxide or cobalt ferrite nanoparticles was achieved by destabilizing the nanoparticle suspension in the presence of F8H2Phos or F10H2Phos. Under these conditions the nanoparticles were adsorbed onto the surface of the microbubbles forming a rigid shell which enhanced their stability and lengthened their lifetime to greater than one week.

La sonoporation, associant les ultrasons (US) et les microbulles (MB) permet une délivrance localisée des molécules thérapeutiques (e.g., acides nucléiques, molécules chimio-thérapeutiques), avec une efficacité thérapeutique élevée et un faible taux de toxicité. Cependant, les mécanismes impliqués dans le transfert de ces molécules restent jusqu’alors mal connus. Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse ont pour objectif de mettre en évidence l’importance du contact microbulle/cellule et les forces de radiation au cours de la sonoporation et s’intéressent par ailleurs, à l’étude des mécanismes sous-jacents durant le processus de sonoporation ainsi que les conséquences cellulaires (membranaire et intracellulaire) engendrées. Ces études sont réalisées par microscopie électronique, et comparent deux lignées cellulaires U-87 MG et MDA-MB-231. Nous nous intéresserons également aux effets du sérum sur l’efficacité de la sonoporation dans la délivrance de molécules (gènes), mais aussi aux changements du cytosquelette et son implication au cours du processus de sonoporation. / Sonoporation combines ultrasound and microbubbles, and promises a local delivery of therapeutic molecules (i.e., nucleic acids, chemotherapeutic molecules) with a high therapeutic efficacy and a low toxicity level. However, the mechanisms involved in the molecules uptake remain hitherto unclear. The work presented in this thesis manuscript aims to highlighting the processes of action of sonoporation by exploring the importance of microbubble/cell contact and the radiation forces and the study of underlying mechanisms during sonoporation and the generated cellular consequences (membrane and intracellular), by electron microscopy, and by comparing two cell lines U-87 MG and MDA-MB-231. We also explore the serum effects on the efficiency of sonoporation in the delivery of molecules (genes) but also the changes in the cytoskeleton and its involvement during sonoporation.