Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des proliférations malignes de cellules progénitrices de la moelle osseuse, dont l'incidence augmente avec l'âge. Elles se caractérisent par l'accumulation dans le sang et dans la moelle de cellules hématopoïétiques immatures. Il s'agit de tumeurs particulièrement agressives, dont le traitement repose avant tout sur une chimiothérapie intensive. La netrin-1 est un ligand soluble impliqué notamment dans le développement du système nerveux central et le système vasculaire. La netrin-1 interagit avec de nombreux récepteurs, dont Deleted in Colon Cancer (DCC) et les récepteurs de la famille UNC5H qui sont des récepteurs à dépendance. Ceux-ci ont la particularité d'entrainer une signalisation positive lorsqu'ils sont lié à leur ligand et en revanche de déclencher activement l'apoptose ne l'absence de ce ligand. Le rôle oncogénique de la netrin-1 et le rôle de suppresseur de tumeur de ses récepteurs à dépendance a été démontré dans plusieurs tumeurs solides, mais leur rôle reste en cours d'exploration dans les hémopathies.Comme cela a pu être démontré dans d'autres modèles, le netrin-1 et plusieurs de ses récepteurs sont surexprimés les LAM. Dans ce travail nous démontrons que la netrin-1 a un effet protecteur contre l'apoptose induite par ses récepteurs à dépendance. En conséquence, le traitement avec un anticorps monoclonal interférant dans la liaison de la netrin-1 et de ses récepteurs et notamment UNC5B entraine l'apoptose des cellules leucémiques. Ces données suggèrent que l'inhibition de l'interaction de la netrin-1 avec ses récepteurs peut avoir un effet thérapeutique dans les LAM / Acute myloide leukemias (AML) are malignant proliferation of bonoe marrow progenitor cells. Their incidence increases with age. Clinical symptoms are due to the accumulation of immature hematopoietic cells in the bone marrow and in the blood. AML are very aggressive tumors and there treatment is currently based on intensive chemotherapy.Netrin-1 is a diffusible ligand which provides important guidance cue during the development of the central nervous system as well as that of the vascular system. Netrin-1 interacts with many receptors among which are Deleted in Colon Cancer (DCC) and receptors of the UNC5H family which are dependence receptors. These receptors induce a positive signaling when bound to their receptors but can also induce an apoptotic signal when their ligand is unbound. There is emerging data suggesting that netrin-1 has oncogenic properties, while dependence receptors behave as tumor suppressors in several cancer models, but the role of netrin-1 and its receptors is unknown in hematological malignancies.As seen in other models, we show that netrin-1 is overexpressed in a sizable fraction of AML cases. Furthermore, netrin-1 prevents apoptosis by binding to its dependence receptors. Consequently interfering with the binding of netrin-1 to its dependence receptors, using a netrin-1 directed monoclonal antibody, induces apoptosis in AML cells. These data suggest that therapeutic interference with netrin-1’s binding to dependence receptor may have activity in AML

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive et sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces neurones émettent des projections axonales dans le striatum et forme la voie nigrostriée ; un circuit de neurones impliqué dans le contrôle de la motricité. La perte de ces neurones est responsable des troubles moteurs caractéristiques de la maladie. Bien qu'il existe des traitements symptomatiques permettant d'améliorer la qualité de vie des patients, aucun traitement ne permet d'arrêter l'évolution de la maladie. Freiner la dégénérescence de ces neurones aurait un impact médical, économique et de santé publique considérable compte tenu du vieillissement croissant de la population. Dans ce but, beaucoup d'études ont été menées sur des facteurs neurotrophiques [1], [2], en particulier le GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor), afin de favoriser la survie des neurones et la croissance des axones. Plusieurs essais cliniques ont été conduits mais l efficacité thérapeutique de ces facteurs reste controversée [3], [4]. Trouver des molécules plus spécifiques des neurones dopaminergiques, impliquées dans leur développement, leur survie ou leur fonction, et qui pourraient éventuellement agir de façon complémentaire avec les facteurs neurotrophiques déjà identifiés offrirait des perspectives thérapeutiques nouvelles. Nous avons pensé que netrin-1 pouvait être un candidat intéressant. En effet, cette protéine de guidage axonal, par l'intermédiaire de son récepteur DCC (deleted in colorectal cancer), favorise la pousse et l'orientation des axones, la migration des neurones [5], [6] et participe à la formation et au maintien des synapses [7], [8], [9]. Ce couple ligand/récepteur joue un rôle majeur dans l'établissement et le maintien de connexions entre les neurones et participe notamment à la formation de la voie nigrostriée [10]. Si le rôle de netrin-1 au cours du développement est largement documenté, sa fonction dans le cerveau adulte est peu connue. De façon intéressante, Livesey and Hunt montrent que la substance noire est la région du cerveau adulte contenant le niveau le plus élevé de transcrits de netrin-1 [11]. Netrin-1 est également exprimée dans les zones du striatum où projettent les fibres dopaminergiques des neurones de la substance noire pars compacta, neurones qui, par ailleurs, expriment très fortement DCC [12]–[13]. Cette expression conjointe de netrine-1 et du récepteur DCC suggère un rôle dans le maintien, la survie voire la fonction des neurones dopaminergiques de la substance noire. Par ailleurs, certains polymorphismes du gène DCC sont associés à différents aspects de la maladie de Parkinson (susceptibilité de développer la maladie, l'âge d'apparition des symptômes, sévérité de la progression de la maladie) [14], [15]. Ces différentes observations indiquent que netrin-1 et DCC pourraient réguler le maintien ou la survie des neurones dopaminergiques et donc participer au développement et/ou à la progression de la maladie de Parkinson. De plus, les travaux du laboratoire ont montré que netrin-1 était une molécule de survie. En son absence, DCC est capable d'activer une signalisation sensibilisant la cellule et entraînant la mort de celle-ci [16], [17]. L'ajout de netrin-1 permet d'inhiber cette signalisation pro-apoptotique. En raison du rôle de netrin-1 sur la croissance des axones, le maintien des synapses et la survie cellulaire nous avons choisi d'étudier son effet sur la survie des neurones dopaminergiques de la substance noire dans des modèles in vivo. Pour cela, nous avons étudié l'effet de l'injection de netrin-1 sur la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire dans un modèle animal de référence de la maladie de Parkinson, le modèle de rat lésé à la 6 hydroxydopamine (6-OHDA) [etc…] / The secreted protein netrin-1 has diverse functions among which guidance and survival of neurons when bound to its dependence receptor DCC. In the absence of netrin-1, DCC is cleaved and actively triggers cell death in various contexts. DCC is highly present in a subset of mature neurons that typically degenerates in Parkinson’s disease, dopaminergic neurons of the substantia nigra. Besides, polymorphisms of DCC gene are associated with the disease. Thus, netrin-1 signalling might be implicated in Parkinson’s disease pathogenesis. Here we show, in various Parkinson’s disease models and samples from Parkinson’s disease patient brains, a reduction of netrin-1 levels associated with an increase of DCC cleavage and caspase activity. Specific deletion of netrin-1 in the substantia nigra induces DCC cleavage and leads to the loss of dopamine neurons and motor deficits in mice while intrastriatal injection of netrin-1 restores dopamine neurons and improves motor behaviour in rodent models of the disease. These results highlight the therapeutic potential of targeting netrin-1 signalling in Parkinson’s disease

Chez les bilatériens, les connexions permettant de relier la partie droite et gauche du système nerveux central (SNC) sont appelées commissures cérébrales. Comprendre les mécanismes moléculaires permettant la mise en place de ces circuits constituent un enjeu majeur en neurobiologie du développement. Le guidage des commissures cérébrales repose sur des paires de ligands-récepteurs telles que Netrine-1/DCC et Slits/Robos. Nétrine et Slits sont exprimés au niveau de la plaque du plancher tandis que leurs récepteurs respectifs, DCC et Robo1/2, sont exprimés dans les neurones et axones commissuraux de la moelle épinière et du tronc cérébral au cours du développement. L'étude des souris déficientes pour ces gènes a permis d'établir un modèle : Nétrine-1, agirait à distance afin d'attirer les axones commissuraux par gradient vers la ligne médiane ventrale, puis, les Slits permettraient de repousser les axones en dehors de la plaque du plancher. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des modèles génétiques murins afin d'étudier in vivo la mise en place des commissures et la migration des neurones précérébelleux. Nous avons inactivé de façon spécifique l'expression des molécules Nétrine-1, Slits et Robo1/2 dans différentes régions du SNC. Nous avons montré que la présence de Nétrine-1 dans la plaque du plancher n'était pas nécessaire à l'attraction des axones commissuraux mais que la source principale de Nétrine-1 était la glie radiaire. Nous avons aussi montré que le couple Slit/Robo n'était pas essentiel à la migration des neurones précérébelleux. Ces données remettent en cause le modèle classiquement proposé et suggèrent l'existence de d'autres mécanismes moléculaires de guidage. / In all bilaterians, the connections linking the left and the right part of the central nervous system (CNS) are called the commissures. Understanding molecular mechanisms involved in the formation of these circuits is a major issue in developmental neurobiology. The guidance of commissural projections lay on two major couples of ligand- receptors: Netrin-1/DCC and Slits/Robos. Netrin-1 and Slits are expressed in the floor plate whereas their respective receptors, DCC and Robo1/2, are present in the neurons and commissural axons of the spinal cord and the hindbrain during the development. Analysis of mice deficient for these genes lead to establish a model: a Netrin-1 gradient would act through long distances in order to attract commissural axons to the ventral midline, then Slits would repulse axons outside the floor plate. During my thesis, I used genetic mouse models to study the setting of commissural axons and the migration of precerebellar neurons in vivo. We have specifically inactivated the expression of Netrin-1 Slits and Robo1/2 genes in different region of the CNS. We showed that floor plate-derived Netrin-1 was not necessary for the attraction of commissural axons and that the principal source of Netrin-1 was the radial glia. We also showed that the Slit/Robo couple was not essential for the migration of precerebellar neurons. These results reassess the model firstly provided and suggest the presence of other molecular mechanisms involved in commissural axon guidance.

Le développement du système nerveux central fait intervenir de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, la différenciation, l'apoptose, la migration neuronale et le guidage axonal. Ces processus sont finement régulés et aboutissent à la formation d'un système nerveux central fonctionnel. Au cours de cette thèse, je me suis principalement intéressé à une molécule chimiotropique, la Nétrine-1 et à ses récepteurs APP (Amyloïd-b Precursor Protein) et DCC (Deleted in Colorectal Cancer). La Nétrine-1 est impliquée à la fois dans le contrôle de la navigation neuronale (ie migration neuronale et guidage axonal) et dans celui de la survie neuronale. Un premier aspect de mon travail a consisté à étudier le rôle d'un nouveau récepteur à la Nétrine-1 : APP. Nous avons donc démontré que APP est un récepteur à la Nétrine-1 impliqué dans le guidage des axones commissuraux. En effet, APP collabore avec DCC afin de stimuler la croissance axonale en réponse à la Nétrine-1. Le second aspect de mon travail a été l'étude du rôle de la Nétrine-1 en tant que facteur de survie neuronale. En effet, son récepteur DCC appartient à la famille des récepteurs à dépendance. En absence de Nétrine-1, DCC ne reste pas inactif, mais déclenche une signalisation pro-apoptotique qui va éliminer la cellule. Nous avons démontré que pendant le développement du système nerveux, la Nétrine-1 inhibe cette signalisation et contrôle la survie des neurones commissuraux. Le contrôle de la signalisation pro-apoptotique de DCC par la Nétrine-1 pourrait ainsi réaliser un contrôle qualité des projections axonales et faciliter l'orientation du cône de croissance lors du guidage du cône de croissance / The development of the central nervous system requires several cellular processes such as proliferation, differentiation, apoptosis, neuronal migration and axon guidance. This whole process is finely regulated and leads to the formation of a functional central nervous system. During my thesis, I have mainly worked on a chemotropic molecule, Netrin-1 and its receptors APP (Amyloid-ß Precursor Protein) and DCC (Deleted in Colorectal Cancer). Netrin-1 is involved in both neuronal navigation (neuronal migration and axonal guidance) and neuronal survival. I have firstly investigated the role of a new Netrin-1 receptor, APP during axonal guidance. We have shown that APP is involved in the guidance of commissural axons. Indeed, APP collaborates with DCC in order to promote axonal outgrowth in response to Netrin-1. Thereafter, I have investigated the role of Netrin-1 as a neuronal survival factor. In fact, the Netrin-1 receptor DCC belongs to the dependence receptor family. In absence of Netrin-1, DCC does not remain inactive, since it triggers a pro-apoptotic signalling pathway. During the development of the central nervous system, we have shown that Netrin-1 blocks the pro-apoptotic signalling pathway and promotes neuronal survival. The Netrin-1 control of DCC pro-apoptotic signalling might carry out a “quality control” of the axonal projection or/and it could promote the steering of the growth cone during axonal guidance

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20798号 / 医博第4298号 / 新制||医||1025(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 辻川 明孝, 教授 清水 章, 教授 戸口田 淳也 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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La pluripotence est la capacité d'une cellule à s'auto-renouveler et à donner toutes les cellules somatiques ainsi que les cellules germinales. Les cellules pluripotentes peuvent être aussi reprogrammées à partir de cellules somatiques, ouvrant ainsi de nouvelles opportunités pour l'utilisation thérapeutique des cellules souches dans le traitement des maladies dégénératives. La connaissance des mécanismes moléculaires, en particulier des voix de signalisation qui contrôlent la pluripotence, est cruciale pour l'amélioration de notre compréhension de l'embryogenèse précoce et l'utilisation des iPSC (cellules souches pluripotentes induites) dans la médicine régénérative. Ici, je donne la première description de la Nétrine-1 en tant que régulateur de la reprogrammation et de la pluripotence. La Nétrine-1 et ses récepteurs ont été initialement caractérisés dans le système neuronal, mais il a aussi été montré qu'ils étaient exprimés dans différents types cellulaires et impliqués dans divers processus. Dans la première partie, j'ai contribué à explorer comment Nétrine-1 empêche l'apoptose médiée par son récepteur à dépendance DCC (Deleted in Colon Carcinoma) pendant la reprogrammation. Dans la deuxième partie, j'ai disséqué les fonctions et la régulation de cette voie dans le maintien de la pluripotence et dans l'engagement des lignages / Pluripotency is the ability of embryonic epiblast cells to self-renew and to give rise to all somatic cells as well as germ cells. Somatic cells can also be reprogrammed toward pluripotency, opening new avenues for stem cell based therapies in the treatment of degenerative diseases. Deciphering the molecular mechanisms, and in particular signaling pathways that control pluripotency is crucial to improve our understanding of early embryogenesis and the use of iPSC (inducible Pluripotent Stem Cell) in regenerative medicine.Herein, I provide the first description of Netrin-1 as a regulator of reprogramming and pluripotency. Netrin-1 and its receptors are present in many cell types and are engaged in a variety of cellular processes beyond its initial characterization in the neuronal system. In the first part, I contributed to explore how Netrin-1 prevents apoptosis mediated by its dependence receptor DCC (Deleted in Colon Carcinoma) during reprogramming. In the second part, I dissected the functions and regulation of this pathway in pluripotency maintenance and in lineage commitment

L'épithélium intestinal adulte des mammifères est un tissu hautement organisé entièrement renouvelé tous les 5 à 7 jours, grâce à la présence de cellules souches intestinales (CSI). Localisées à la base des cryptes, les CSI sont capables de s'auto-renouveler et de générer l'ensemble des types cellulaires de ce tissu. Afin de préserver l'équilibre entre leur auto-renouvellement et leur différenciation, véritable garant de l'homéostasie de l'épithélium intestinal, les CSI résident dans un microenvironnement finement régulé, « la niche », leur procurant l'ensemble des signaux nécessaires à leurs fonctions. La Nétrine-1, molécule sécrétée et apparentée à la famille des Laminines, est exprimée dans l'environnement des cryptes intestinales, mais également au cours du développement intestinal. Initialement découverte pour son rôle dans le guidage axonal, cette protéine est à ce jour considérée comme une molécule pléïotropique impliquée dans divers processus physiologiques tels que la morphogénèse, la migration, l'adhésion cellulaire, la prolifération mais également pathologiques comme la tumorigénèse. Considérant ces observations nous nous sommes donc intéressés au rôle potentiel de la Nétrine-1 dans la régulation du compartiment souche intestinal adulte, ainsi que lors de l'ontogénèse intestinale. Dans une première partie, nous montrons qu'ex vivo la Nétrine-1 promeut la croissance des entéroïdes et régule l'expression génique de certains marqueurs spécifiques des CSI. Dans une seconde partie, nous montrons, grâce à la génération et caractérisation de nouveaux modèles murins, que la Nétrine-1 est impliquée dans le développement de l'épithélium intestinal grêle et que sa délétion conduit à un retard d'émergence des villi / The adult intestinal epithelium is a highly organized tissue, which is completely self-renewed every 5 to 7 days, due to a pool of multipotent intestinal stem cells (ISC). Located at the base of intestinal crypts, ISC have the ability to self- renew and to give rise to all epithelial intestinal cell types. To preserve the balance between their self-renewal and their differentiation, and therefore to maintain the epithelial tissue homeostasis, ISC reside in a tightly regulated microenvironment - called “niche”- that provides them all factors required for their functions. Netrin-1, a laminin-related secreted protein, is expressed in the microenvironment of the crypt, and is also expressed during intestinal development. Initially described as an axonal guidance cue, Netrin-1 is now considered as a pleiotropic molecule involved in many different processes such as morphogenesis, cell migration, cell adhesion, proliferation and also tumorigenesis. Based on these observations, we hypothesized that Netrin-1 could play a role in the maintenance of the adult intestinal stem cell compartment, and also in the intestinal ontogenesis. In a first part, we showed that Netrin-1 promotes the growth of enteroids ex vivo while regulating gene expression of specific intestinal stem cell markers. In the second part, we demonstrated, by using two novel genetically engineered mouse models, that Netrin-1 is involved in the embryonic development of the intestinal epithelium and that its deletion leads to a delay in villi emergence

Neuronal networks are the central functional units of the nervous system. Knowledge about the identity of participating neurons and the assembly of these during development is crucial for the understanding of CNS function. A promising system to dissect the development and functionalities of a neuronal network is the central pattern generator (CPG) for locomotion. We used screening approaches to identify spinal neuronal subpopulations by their specific gene expression, potentially involved in CPG function. Amongst others we found paired-like homeodomain transcription factor 2 (Pitx2) as a cholinergic interneuron marker for partition cells, with a possible role in the spinal network for locomotion. In addition, we present two genes, Chondrolectin (Chodl) and Estrogen-related receptor beta (ERRβ) as novel markers for fast and slow motor neurons, respectively. The neuronal components of the CPG integrate three key functions; rhythm generation, ipsilateral flexors/extensors coordination and bilateral coordination over the midline. Commissural interneurons (CINs) are considered to participate in the latter. During development axons are guided to their targets by the help of axon guidance molecules. Netrin-1 and its receptor DCC (Deleted in Colorectal Cancer) have been shown to play an important role for spinal cord neurons in axon-pathfinding and migration towards the midline. We show that loss of netrin-1 functionally results in a switch from alternating to synchronous left-right locomotor activity and deletion of DCC surprisingly leads to a different phenotype, best described as uncoordination. Thus, during development, netrin-1 and DCC play a critical role for the establishment of a functional balanced CPG. Further we show a selective loss of CINs, predominantly from dorsally originating subtypes, not affecting the ventral-most V3 subtype in netrin-1 mutant mice, but a loss of CINs from all progenitor domains in Dcc mutant mice. Together, our data suggest a netrin-1-independent mechanism for DCC in axon guidance and a role of the most ventral originating CINs as part of the neuronal network controlling synchronous activities over the midline. Another pair of axon guidance molecules, EphA4 and ephrinB3, has been shown to cooperate in preventing ipsilateral interneurons from crossing the spinal midline and if either molecule is deleted in mice, this will result in a defect in left-right coordination of locomotion. We provide in vivo and in vitro evidence that the GTPase-activating protein α2-chimerin, as a downstream molecule of EphA4 signaling, is essential in axon guidance decisions involved in the correct formation of the spinal circuitry for locomotion.