La netrine-1 joue un rôle important en tant qu’un élément de guidance pour la croissance axonale au début du développement du système nerveux central. Des études récentes ont démontré une expression de la netrin-1 dans le cerveau antérieur adulte, où elle régule la fonction synaptique et la plasticité dans les neurones corticaux. Cependant, la contribution de la netrine-1 dans la rétine adulte reste encore inconnue. Le but de cette étude est donc de caractériser l'expression de la netrine-1 dans la rétine des souris adultes sauvages (rétine intacte) et malades (rétine blessée). L'expression rétinéene de la netrine-1 et de son récepteur, supprimée dans le cancer colorectal (DCC), a été déterminée, à partir des immunobuvardages, chez des souris post-natales de jour 0 (P0), P14 et adultes. Le recours au double marquage de la netrine-1 avec un anticorps spécifique contre RBPMS, un marqueur sélectif pour les cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), a permis l’identification de sa localisation sur les sections transversales de rétine. De plus, les niveaux de netrin-1 ont également été quantifiés à trois et sept jours après l'axotomie du nerf optique. Nous avons démontré que la netrine-1 et DCC sont fortement exprimés dans la rétine à P0, toutefois l’expression de netrin-1 est relativement stable pendant le développent alors que l’expression de DCC est remarquablement réduite à l'âge adulte. De plus, ces expériences ont conclu une expression robuste de la netrin-1 dans le soma RGC adulte et, une expression des récepteurs DCC autour du corps cellulaire. Fait important, nous avons aussi pu démontrer que les niveaux d’expressions de la netrine-1 et DCC sont réduits à trois et sept jours suivant l'axotomie du nerf optique. Cependant, la surexpression de la protéine netrin-1 n'a pas eu un effet significatif sur la survie du RGC par rapport aux témoins injectés par un véhicule. Les résultats obtenus suggèrent que : (i) la netrine-1 est abondamment exprimée dans la rétine néonatale et subit une diminution importante à l'âge adulte, (ii) la netrine-1 et son récepteur DCC sont présents dans les RGC et, (iii) l'expression de la netrine-1 diminue considérablement suite à une lésion axonale. Ensemble, ces résultats suggèrent un rôle pour la netrin-1 dans le système visuel chez les adultes. / Netrin-1 plays a highly-conserved role as a guidance cue directing axonal growth during the early stages of central nervous system development. Recent data has shown that netrin-1 is continued to be expressed in the adult forebrain where it regulates synaptic function and plasticity in cortical neurons. However, the contribution of netrin-1 in the adult retina remains unknown. The purpose of this study was to characterize the expression of netrin-1 in the intact and injured adult mouse retina. The retinal expression of netrin-1 and its receptor, deleted in colorectal cancer (DCC), was examined at postnatal day 0 (P0), P14, and adult mice using western blots. Double labeling of netrin-1 with an antibody against RBPMS, a selective marker for retinal ganglion cells (RGCs), was used to determine its location on retinal cross-sections. Netrin-1 levels were also quantified at 3 and 7 days after optic nerve axotomy. We demonstrate that netrin-1 and DCC are abundantly and widely expressed in the retina at P0, but although the expression level of netrin-1 remains relatively stable during development, the expression level of DCC is markedly downregulated in adulthood. Adult RGC soma were shown to be endowed with robust netrin-1 expression. DCC receptors were also found to be expressed around the cell body. Importantly, we show that netrin-1 and DCC levels are further downregulated at 3 and 7 days after optic nerve axotomy. However, the over-expression of netrin-1 protein failed to exert any significant effect on RGC survival in comparison to vehicle-injected controls. Our data support that: 1) netrin-1 is abundantly expressed in the neonatal retina and undergoes marked downregulation in adulthood, 2) netrin-1 and DCC are present in RGCs, 3) netrin-1 expression decreases rapidly after axonal injury. Together, these results suggest a role for netrin-1 in the mature visual system.

Les récepteurs à dépendance ont la particularité d’induire deux signalisations différentes en fonction de la disponibilité de leur ligand. En présence de leur ligand, ils initient une signalisation positive favorisant notamment la survie cellulaire tandis qu’en leur absence, ils induisent la mort de la cellule par apoptose. Ils créent donc un état de dépendance de la cellule vis-à-vis du ligand pour survivre. Cette dualité fonctionnelle leur confère un rôle central dans le maintien de l’homéostasie tissulaire chez l’adulte et particulièrement dans l’intestin et le colon. En ce sens, l’apoptose induite par les récepteurs à dépendance serait un mécanisme de sauvegarde limitant l’échappement tumoral en permettant l’élimination des cellules proliférant ou migrant dans un environnement dépourvu d’une quantité suffisante de ligand. Un avantage sélectif potentiel pour une cellule tumorale serait donc de perdre cette induction de la mort cellulaire, soit via l’altération des récepteurs soit via un gain excessif d’expression du ligand. Ainsi, les travaux présentés montrent qu’un gain d’expression du ligand netrine-1 par la cellule tumorale elle-même caractérisée une fraction des tumeurs colorectales dérivées de pathologies inflammatoires chroniques et que la perte de l’expression des récepteurs à dépendance fixant la nétrine- 1 est observée dans le reste des cancers colorectaux. En particulier, nous avons montré que l’expression du gène qui code pour le récepteur de la netrin-1 UNC5C est altérée par méthylation dans 70% des cancers colorectaux, et que ce gène comporte également des mutations ponctuelles germinales dans des formes familiales de cancer colorectal, chez lesquels aucune autre mutation n’avait été décrite. Nous avons ainsi montré que les récepteurs à dépendance agissent comme des suppresseurs de tumeur conditionnels à l’absence de nétrine-1 et que l’altération de leur signalisation apoptotique constitue un avantage sélectif qui favorise la progression des cancers colorectaux / Dependence receptors share the common property of inducing two types of signaling according to their ligand availability. In the presence of their ligand, they induce a positive signal allowing cell survival whereas in its absence, they induce cell death by apoptosis. These receptors thus create cellular states of dependence on the ligands. Dependence receptors dual functionality plays a major role both during the embryonic development and in the regulation of tissue homeostasis in adult, particularly in intestine and colon. Indeed, apoptosis induced by dependence receptors would be a safeguard mechanism that restricts tumor escape by eliminating cells that would proliferate or migrate in settings of limited ligand availability. A potential selective advantage for a tumor cell would then be to loose this apoptotic signaling, either through a loss of the receptor apoptotic function or through an autocrine gain of the ligand expression. We show here than an over-expression of the ligand netrin-1 by a tumoral cell characterize a fraction of colorectal tumor derived from chronic inflammatory pathology, while the others tumors have lost the expression of netrin-1 dependence receptors. In particular, we have shown that the expression of UNC5C gene is down-regulated due to methylation of the promoter in 70% of cases, and different variants of the gene are associated with a familial form of colorectal cancer. Dependence receptors behave as conditional tumor suppressors in absence of their ligand, and the alteration of their apoptotic signaling is a selective advantage for tumoral cells and favors cancer progression

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les récepteurs à dépendance constituent une nouvelle classe de récepteurs à activité pro-apoptotique capables en présence de leur ligand de transduire un signal de survie cellulaire et à l’inverse, en absence de ligand d’induire l’apoptose. Parmi ces récepteurs, la famille des récepteurs UNC5H et leur ligand la Nétrine-1 (i.e. UNC5H1-4) sont plus particulièrement impliqués dans la morphogenèse des organes branchés, l’angiogenèse et le guidage axonal mais aussi dans le contrôle de la tumorigenèse et de l’homéostasie. En effet, ces récepteurs et leur ligand seraient capables de contrôler la prolifération et la survie cellulaire car le ligand induirait un état de dépendance des cellules exprimant les récepteurs UNC5H. Nous avons pu mettre en évidence un mode particulier de dérégulation tumorigène de la signalisation apoptotique des récepteurs UNC5H : la surexpression de Nétrine-1. Nous avons montré que l’acquisition de cette surexpression par les cellules tumorales constitue un réel avantage sélectif car cette surexpression permet aux cellules tumorales de s’affranchir de leur dépendance à la Nétrine-1 et ainsi de former des tumeurs voire de former des métastases. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la signalisation apoptotique des récepteurs UNC5H grâce à un crible d’ARNinterférence et 47 nouveaux effecteurs potentiels de l’apoptose sont actuellement en cours de caractérisation. Parmi eux, le complexe PP2A/PR65β a été caractérisé comme essentiel à l’apoptose induite par le récepteur à dépendance UNC5H2 et plus particulièrement dans la régulation de l’angiogenèse médiée par le couple UNC5H2/Nétrine-1. / Dependence receptors are a new class of pro-apoptotic receptor able to induce a survival signal in presence of their ligand and, on the opposite site to induce apoptosis in abaence of their ligand. Among them, UNC5H receptors (i.e UNC5H1-4) and their ligand Netrin-1 are implicated in morphogenesis of branched organs, angiogenesis and nervous system development but also in tumorigenesis control and homeostasis regulation. Indeed, this couple of ligand/receptors could control proliferation and cell survival by inducing a state of cellular dependance to the ligand presence for cell expressing UNC5H receptors. First, we have discovered a particular tumorigenic inhibition of UNC5H apoptotic activity due to Netrin-1 overexpression by tumor cells. In this context we have shown that this overexpression is a selective advantage for tumor cells as they loss their dependence to Netrin-1 and could (i) survive and proliferate without any ligand limitation and could also (ii) migrate and form metastasis. In a second part, we started to study UNC5H apoptotic pathway using and RNAi screening and 47 new potential effectors have been identified. Among them, PR65β/PP2A complex have been characterised as an essential actor of UNC5H2 induced apoptosis through the regulation of DAP-kinase by phosphorylation and particularly in angiogenesis regulation mediated by UNC5H2/Netrin-1.

Dans certains cancers, le ligand nétrine-1 (NTN1) est surexprimé, induisant alors une inhibition de l'apoptose induite par ses récepteurs à dépendance DCC et UNC5H, et promouvant ainsi la progression tumorale. Néanmoins, dans d'autres cancers, l'inhibition sélective de l'apoptose induite par cette voie de signalisation est liée à la perte d'expression de protéines pro apoptotiques effectrices. Dans cette étude, nous avons montré chez l'homme qu'une forte proportion de cancers mammaires et pulmonaires subit des pertes d'expression de DAPK1 et NTN1 liées à l'hyperméthylation de leur promoteur. DAPK1 est une protéine kinase notamment responsable de la transmission du signal proapoptotique des récepteurs à dépendance en absence de leur ligand nétrine-1. L'inhibition de la méthylation de l'ADN à l'aide d'épidrogues telles que la décitabine dans les cancers exprimant faiblement NTN1 restaure l'expression à la fois de DAPK1 et NTN1. Ainsi, la combinaison de traitements décitabine avec des stratégies induisant le silence transcriptionnel de NTN1, ou des anticorps bloquant l'interaction entre le ligand (NTN1) et son récepteur (UNC5B dans le cas présent), induit la potentialisation de la mort cellulaire des tumeurs, et bloque efficacement la croissance tumorale dans différents modèles animaux. Ainsi, combiner l'utilisation d'inhibiteurs de la méthylation de l'ADN avec des agents neutralisant la nétrine-1 pourrait représenter une stratégie pertinente pour combattre ces cancers / In a substantial part of human cancers, netrin-1 (NTN1) is up-regulated and this upregulation is inhibiting apoptosis induced by its so-called dependence receptors DCC and UNC5H and thus promotes tumor progression. However, in other cancers, the selective inhibition of this dependence receptor death pathway relies on the silencing of pro-apoptotic effector proteins. We show here that a large fraction of human breast and lung tumors exhibits simultaneous DNA methylation-dependent loss of expression of NTN1 and of DAPK1, a serine threonine kinase known to transduce the netrin-1 dependence receptor pro-apoptotic pathway. The inhibition of DNA methylation by drugs such as decitabine in netrin- 1-low cancer cells restores the expression of both NTN1 and DAPK1. Consequently, the combination of decitabine with NTN1 silencing strategies or with an anti-netrin-1 neutralizing antibody potentiates tumor cell death and efficiently blocks tumor growth in different animal models. Thus, combining DNA methylation inhibitors with netrin-1 neutralizing agents may be a valuable strategy for combating cancer

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Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.

Dans l'imagerie moléculaire par ultrasons, des microbulles sont fonctionnalisées avec des ligands. Après injection intraveineuse, ces microbulles ciblées s'accrochent aux marqueurs présents sur l'endothélium tumoral et permettent une détection non-invasive. Dans cette thèse, l'imagerie moléculaire par ultrasons a été développée pour la détection de la nétrine-1, qui est surexprimée dans 70% des cancers du sein et promeut la survie cellulaire. Une nouvelle thérapie moléculaire interférant avec la nétrine-1 a été développée et nécessite l'identification des patientes qui pourront bénéficier de ce traitement. Avec l'imagerie moléculaire de la nétrine-1, il a été possible de discriminer les tumeurs positives pour la nétrine-1 des tumeurs négatives. Par sa capacité à détecter de manière spécifique la nétrine-1 présentée sur l'endothélium des tumeurs, cette technique d'imagerie pourrait donc devenir un test d'accompagnement pour la thérapie d'interférence de la nétrine-1 chez les patientes atteintes de cancer du sein.La destruction ciblée des microbulles par ultrasons induit la cavitation et la sonoporation qui perméabilisent le tissu et facilite la délivrance locale de médicaments. De plus, cette destruction ciblée peut induire l'infiltration de cellules immunitaires et la libération d'antigènes tumoraux, déclenchant une réponse immunitaire anti-tumorale. Dans cette thèse, nous avons quantifié l'activation de la réponse immunitaire dans le carcinome hépatocellulaire, suivant la délivrance de nanoparticules chargés en microARN-122 et anti-microARN-21. Dans les nœuds lymphocytaires tumoraux, une baisse d'expression des cytokines pro-tumorales et une augmentation d'expression des cytokines anti-tumorales ont été observées, suggérant une réponse thérapeutique positive. L'approche thérapeutique de destruction ciblée des microbulles par ultrasons pour la délivrance de micro-ARN s'avère donc être un outil immuno-modulatoire puissant / Ultrasound molecular imaging uses microbubbles as ultrasound contrast agents which are functionalized with targeting ligands. Upon intravenous injection, targeted microbubbles bind to molecular markers presented on the tumor endothelium and enable the non-invasive assessment cancer-related biomarkers. In the present thesis, ultrasound molecular imaging was developed for detection of netrin-1, which is upregulated in 70% of metastatic breast cancer and promotes cell survival. A newly developed netrin-1 interference therapy requires the identification of patients who overexpress the target protein and, could benefit from anti-netrin-1 therapy. In vivo imaging of netrin-1 showed a significantly increased imaging signal in netrin-1-positive breast tumors compared to netrin-1-negative breast tumors and normal mammary glands. The results suggest that ultrasound molecular imaging allows accurate detection of netrin-1 on the endothelium of netrin-1-positive tumors and has the potential to become a companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer patients.Ultrasound-targeted microbubble destruction triggers cavitation and sonoporation thereby permeabilizing the tissue and facilitating local drug delivery. Further, immune cell infiltration and tumor antigen release are induced and trigger anti-tumor immune responses. In the present thesis, ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated delivery of anti-cancer microRNA-122 and anti-microRNA-21 is studied for immune response activation in hepatocellular carcinoma, in which the immune microenvironment is deregulated. Tumor lymph nodes showed pro-tumor cytokine downregulation and anti-tumor cytokine upregulation, suggesting an overall positive therapy response with regard to the tumor immunology. The results identified ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated miRNA delivery as a potent immuno-modulatory therapeutic approach

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.