La sensation du toucher permet de détecter des stimuli mécaniques via des neurones mécanosensitifs dont les corps cellulaires sont localisés dans le ganglion rachidien dorsal. Ces neurones projettent vers la peau en périphérie et font leurs synapses avec les interneurones dorsaux de la moelle épinière. L'étude de ces neurones était difficile à cause du manque de marqueurs spécifiques pour ces neurones, jusqu'à la découverte du gène MafA dans le ganglion rachidien dorsal. En effet, mon équipe a montré que MafA est un marqueur spécifique des neurones mécanosensitifs à bas seuil de type Rapidly adapting. Le gène c-Maf, de la même famille que MafA, est aussi exprimé dans ces neurones et il est l'acteur principal de leur développement et de leur fonction. Afin de comprendre comment c-Maf contrôle le développement des neurones somatosensoriels, la première partie de mon travail visait à identifier de nouveaux gènes cibles du facteur de transcription c-Maf et à savoir comment l'expression de ce dernier est régulée dans les neurones du ganglion rachidien dorsal. Concernant la recherche des gènes cibles de c-Maf, j'ai réalisé l'étude de l'expression de gènes candidats dans le contexte de perte de fonction de c-Maf chez la souris. J'ai pu identifier deux cibles : p-cadhérine et mab21/L2, parmi une liste de gènes candidats. J'ai par la suite analysé l'expression de P-cadhérine au cours du développement et j'ai observé qu'elle est exprimée dans la sous-population de neurones sensoriels myélinisés exprimant c-Maf ainsi que dans certains interneurones des laminae III/IV de la moelle épinière. Une expression particulière de P-cadherine est observée dans les cellules des capsules frontières dans les zones d'entrée et de sortie des racines rachidiennes. Suite à ces observations, nous avons émis l'hypothèse suivante : l'expression de la p-cadhérine est régulée par c-Maf dans les neurones sensoriels ainsi que dans les interneurones pour assurer la connexion synaptique entre eux. Concernant, la régulation du gène c-maf, la question reste ouverte. La deuxième partie de mon étude concernait l'analyse du rôle de facteurs de transcription MafA, c-Maf, Runx3 et Er81 dans la plasticité neuronale induite chez la souris adulte après axotomie du nerf sciatique. Ces facteurs sont impliqués dans le développement des neurones somatosensoriels. Cette analyse a montré que l'expression de MafA et Er81 diminue trois jours après axotomie du nerf périphérique, alors que celle de Runx3 et de c-Maf n'est pas affectée. On peut suggérer que chez l'adulte, la régulation de l'expression de MafA et Er81 dépend des facteurs neurotrophiques libérés par les cibles de ces neurones tandis que celle de c-Maf et Runx3 en est indépendante. / The sense of touch relies on the detection of mechanical stimuli by specialized cutaneous mechanosensory neurons whose cell bodies are located in the dorsal root ganglia. These neurons project peripherally to the skin and synapse on target interneurons in the spinal cord. Until the discovery of MafA expression in the dorsal root ganglion, the lack of molecular markers of mechanoreceptor neurons has made it difficult to analyze the development of these neurons. My team showed that MafA is a specific molecular marker for low-threshold mechanoreceptor neurons RAM. C-Maf gene is a member of the Maf family and it is expressed in the MafA sensory neurons. The transcription factor c-Maf controls touch receptor development and function.In order to understand how c-Maf controls somatosensory neurons development, the first objective of my study was to find new targets for c-Maf transcription factor and to know how c-Maf expression is regulated in the dorsal root ganglion. Therefore, I have analysed the expression of different candidate genes in a loss of function context of c-Maf in the mice. I identified two targets: p-cadherin and Mab21/L2 among a list of candidates. Then, I analysed the p-cadherin expression during development and found that this target of c-Maf is expressed in a sub-population of c-Maf sensory neurons and interneurons of the laminae III/IV of the spinal cord. A particular expression of p-cadherin was noticed in the boundary cap cells at the dorsal root entry zone and the motor exit point of the spinal cord. These observations let us put the following hypothesis: c-Maf regulates p-cadherin expression in the sensory neurons and the interneurons to enable specific connections between these neurons. No identified factors were found to regulate c-Maf expression. In the second part of my study, I focused my efforts on the analysis of the role of MafA, c-MAf, Runx3 and Er81 transcription factors in neuronal plasticity induced in the adult mice three days after sciatic nerve axotomy. These factors are involved in the development of somatosensory neurons. The analysis showed that MafA and Er81 expression are down-regulated after peripheral nerve axotomy but the c-Maf and Runx3 expression did not change. We suggest that at adult stage the regulation of MafA and Er81 expression depend on neurotrophic factors released by the targets of these neurons but it's not the case for c-Maf and Runx3 expression.

Les pathologies du système somatosensoriel, appelées neuropathies sensitives périphériques, touchent environ 3 millions de personnes en France et causent des déficits sensoriels multiples. Parmi elles, les douleurs neuropathiques post traumatiques sont les plus fréquentes et sont souvent chroniques et résistantes aux traitements actuels. Une lésion nerveuse périphérique induit des réponses cellulaires permettant la survie et la régénération de ces neurones. Les ganglions rachidiens dorsaux (DRG) contiennent une variété de neurones sensitifs qui transmettent les stimuli somatiques. Suite à une blessure du nerf périphérique les neurones sensitifs s'adaptent à un nouvel environnement pour réussir leur élongation axonale. Parmi les mécanismes cellulaires conduisant à une croissance neuritique améliorée, il a été démontré qu'une lésion primaire in vivo du nerf augmente la régénération axonale suite à une deuxième lésion. In vitro, les neurones qui ont été conditionnés par le premier traumatisme montrent une croissance neuronale plus rapide et plus élonguée appelée croissance régénérative. L'élasticité est un paramètre déterminant des propriétés mécaniques de la membrane cellulaire. Elle donne des informations importantes sur la santé et la fonction de la cellule. Le microscope à force atomique (AFM) est devenu de nos jours un outil commun pour l'imagerie à haute résolution de matériaux biologiques puisque les cellules vivantes peuvent être imagées dans leurs conditions physiologiques. En plus du rôle des propriétés élastiques dans le processus de régénération, l'organisation structurale des tissus est en grande partie déterminante du degré et de la direction de croissance et du mouvement cellulaire. Le guidage de la croissance par la modification des surfaces ou « patterning » est possible avec la technique de « microcontact printing » qui permet la conception de circuits de protéines avec des géométries bien définies. Les protéines de la matrice extracellulaire. Dans la première partie de la thèse nous avons mis en évidence les propriétés mécaniques de la membrane de neurones sensitifs issus de DRG de souris adultes suite à une lésion du nerf sciatique gauche. Les neurones sensitifs conditionnés montrent un mode de croissance neuritique plus rapide et plus élonguée, moins de branchements neuritiques et plus de souplesse membranaire des somas et des cônes de croissance. Dans un deuxième volet du travail nous avons réussi à normaliser la pousse régénérative et l'activité électrique des neurones sensitifs et motoneurones spinaux en utilisant le patterning des protéines d'adhésion cellulaire (ECM) dans le but d'imiter la croissance longitudinale in vivo. / Peripheral nerve injuries lead to paralysis, anesthesia and lack of autonomic control of the affected body areas. The trauma results in loss of motor and sensory functions conveyed by the involved nerves. This process is referred to as Wallerian degeneration; it creates a microenviroment in the injury site that favors neurites regrowth. The increased intrinsic growth capacity of injured peripheral neurons is manifested experimentally by the conditioning lesion paradigm. Axotomy of a peripheral neuron previous to the test lesion, ‘‘primes'' the neuron, switches it on to a regenerative state and, thus, it will regenerate faster after receiving the second injury. Mechanical interactions play a key role in many processes associated with neuronal growth and development. Membrane cytoskeleton elasticity is a determining parameter of membrane mechanical properties and provides important information toward the health and function of the cell. For this reason the first objective of this thesis was to understand the conditioning injury effects on both morphology and rheological properties of live sensory neurons cell bodies and growth cones, using particularly the atomic force microscopy, and to correlate this to eventual modifications in the composition of the cytoskeletal proteins. In addition to the role of cell elastic properties and mechanical sensing in the regeneration process, the structural organization of tissues plays a major part in deciding the degree and direction of tissue growth and cell movement. The ability to guide cells and their outgrowth by modifying surfaces is possible with the microcontact printing technique which enables the design of protein pathways with experimentally defined geometries. Therefore, the second objective of the thesis was to modulate the regenerative growth of dorsal root ganglia sensory neurons and spinal motoneurons using cell adhesion proteins in order to physically mimic the in vivo longitudinal axonal growth. We used the extracellular matrix (ECM) proteins, ideal biomolecules for printing as they can guide in vitro the cellular adhesion, differentiation, migration. The patterning allowed us to normalize neurite elongation and electrical activity of sensory neurons before and after conditioning lesion.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, nach einer irreversiblen Schädigung des Sehnervs zu zeigen, ob retinale Ganglienzellen zu Umstrukturierungsprozessen an ihren Axonen ohne neuroprotektive Unterstützung fähig sind. Das besondere Interesse galt der licht- und elektronenmikroskopischen Analyse. Verwendet wurden 37 adulte Albinoratten (WISTAR-Prob). Zuerst wurde der Nervus opticus für 30 s 5 mm hinter dem Bulbus oculi gequetscht. Ein zweiter invasiver Eingriff, der zur retrograden Markierung von aberranten Neubildungen an den Axonen der Nervenfaserschicht durchgeführt wurde, fand zu den postoperativen Überlebenszeiten (ÜLZ) von drei und zehn Tagen, zwei, drei,vier, acht und zwölf Wochen sowie nach sechs und zwölf Monaten statt. Für die retrograde Markierung wurde das biotinylisierte Dextranamin (BDA) eingesetzt, das unter Verwendung des Chromogens Diaminobenzidin visualisiert wurde.Die folgenden Befunde konnten auf lichtmikroskopischer Ebene ermittelt werden: · axonale Schwellungen, · dornenförmige Fortsätze, · intraretinale Axonsprosse mit Wachstumskegeln, · zwei Formen von intraretinalen Axonkollateralen und · aberrante axonale Trajektorien in Form von Schleifenaxonen. Basierend auf dem lichtmikroskopischen Befund wurden ausgewählte Bereiche der Netzhaut ultrastrukturell untersucht.Axonale Schwellungen konnten hinsichtlich ihrer Gestalt in spindelförmig, ballonierend und breitbasig polypös unterschieden werden. Dornenförmige Fortsätze an den Nervenfasern stellen vermutlich ein morphologisches Erscheinungsbild zur Herstellung eines funktionellen Gleichgewichts dar. Die intraretinalen Axonsprosse mit ihren birnenförmigen Wachstumskegeln konnten erstmalig elektronenmikroskopisch in einer adulten Rattennetzhaut nach einer Schädigung des Nervus opticus beschrieben werden. Die nach den ÜLZ von zehn Tagen, zwei, drei und vier Wochen dokumentierten aberranten Fortsätze orientierten sich hauptsächlich vom Discus nervi optici zur Netzhautperipherie. Zu allen ÜLZ besaßen sie eine rundliche oder ovoide Gestalt und wiesen eine Größe von 5 bis 10 µm auf. Sie gingen aus einem Hauptfaszikel in der Nervenfaserschicht hervor und existierten in enger Korrelation zu benachbarten Axonen und Blutgefäßen. Die Definition des Wachstumskegels wurde durch den ultrastrukturellen Befund der Akkumulation von Mitochondrien und wachstumskegeltypischen Vesikeln verifiziert. Die Axonsprosse mit ihren Wachstumskegeln stellen das morphologische Substrat von temporären Reorganisationen der RGC nach einer Unterbrechung ihrer axonalen Efferenz dar. Es waren zwei Formen von intraretinalen Axonkollateralen sichtbar. Bei der ersten Form handelt es sich um eine axonale Kollateralisierung nach einem dreiwöchigen Versuch, die unmittelbar hinter dem Axonhügel einer Typ-III-RGC abzweigte. Diese Form der Kollateralisierung könnte vermutlich im Zusammenhang mit regenerativen Leistungen in der Netzhaut stehen, die unter dem Begriff axon-like processes definiert wurden. Die zweite Kollateralisierungsform zwei Wochen nach der Läsion bildete sich in einem orthogonalen Winkel von einer Nervenfaser in einem Axonfaszikel und entsendete mehrere Kollateralzweige. Acht Wochen nach einer Nervus opticus-Axotomie konnte eine Axonkollaterale dokumentiert werden, die sich in einem fortgeschrittenen Degenerationsprozess befand. Die beschriebene intraretinale Axonkollaterale konnte erstmalig bei der adulten Albinoratte beschrieben werden. Zwei und drei Wochen post lesionem konnten in zwei Versuchen Nervenfasern dokumentiert werden, die durch eine auffallende Schleifenbildung gekennzeichnet waren. Resümierend konnte auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene nachgewiesen werden,dass geschädigte retinale Ganglienzellen in der adulten Ratte zu axonalem Wachstum ohne neuroprotektive und neuropermissive Unterstützung fähig sind. Die beobachteten regenerativen Leistungen sind vermutlich auf das Wirken von Neurotrophinen in der Retina oder im Sehnerv selbst zurückzuführen. / The present light and electron microscopic study was undertaken to determine whether axotomized retinal ganglion cells are able to reestablish intraretinal axons without experimental neuroprotective support. 37 adult albino rats (WISTAR-Prob) were used. In a first step, the optic nerve was intraorbitally exposed and crushed for 30 s at about 5 mm from the ocular bulb. A second experiment was conducted in order to stain newly formed intraretinal axonal elements after postlesion times of either three and ten days, two, three, four, eight, and twelve weeks, or six and twelve month. Retrograde labelling was achieved using biotinylated dextran amine (BDA),followed by visualization with diaminobenzidine as chromogen. The following structures were detected light microscopically: · axonal swellings, · spine-like processes, · intraretinal axonal sprouts showing growth cones, · two types of axonal collaterals, and · aberrant axonal fibers forming so-called looping axons. On the basis of light microscopy selected areas of the retina were examined electron microscopically. Axonal swellings were typified by their shape as spindle-shaped, ballon-shaped or broad-basic polypous. Also spine-like processes, which might serve the reestablishment of a functional balance within the retinal network, were detected. Intraretinal axonal sprouts, showing pear-shaped growth cones at their endings, could be demonstrated for the first time on the ultrastructural level. Aberrant processes, most of them orientated from the optic disc to the retinal periphery, were found at survival times of ten days as well as after two, three and four weeks. At all survival stages investigated the growth cones showed a plump or ovoid morphology and ranged in size between 5 to 10 µm. Usually, they were found to originate from nerve fiber fascicles located in close neigbourhood to the axons but also to blood vessels of the inner retina. The light microscopical typification of growth cones was confirmed at the ultrastructural level, particularly as accumulated mitochondria and growth cone-specific vesicles were detected. Probably, axonal sprouts and growth cones represent a temporal attempt of retinal ganglion cells to regenerate after transection of the optic nerve. Two axon collaterals were detected in the inner retina. In the first case, three weeks postlesion, an axon was found to branch immediately behind the axon hillhock of a type III ganglion cell. This kind of collateralization is indicative of a regenerative response as it has been previously reported by other authors who found so-called axon-like processes. In a second case, two weeks postlesion, an axon appeared to bifurcate orthogonally from a fiber fascicle sending off several collaterals on its way. Furthermore, a degenerating axon collateral was seen eight weeks after optic nerve lesion. The types of axon collaterals presented in this study were described for the first time in the albino rat. So-called looping axons typically characterized by their circular course were found in the inner retina two and three weeks postlesion. In conclusion, the light and electron microscopical results demonstrate that axotomized retinal ganglion cells of the adult rat retain the capability for axonal outgrowth without any neuroprotective and neuropermissive support. Since no experimental growth-promoting measures had been taken, it might be speculated whether the observed regenerative processes were due to intrinsic neurotrophic factors in the retina or the optic nerve themselfes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La netrine-1 joue un rôle important en tant qu’un élément de guidance pour la croissance axonale au début du développement du système nerveux central. Des études récentes ont démontré une expression de la netrin-1 dans le cerveau antérieur adulte, où elle régule la fonction synaptique et la plasticité dans les neurones corticaux. Cependant, la contribution de la netrine-1 dans la rétine adulte reste encore inconnue. Le but de cette étude est donc de caractériser l'expression de la netrine-1 dans la rétine des souris adultes sauvages (rétine intacte) et malades (rétine blessée). L'expression rétinéene de la netrine-1 et de son récepteur, supprimée dans le cancer colorectal (DCC), a été déterminée, à partir des immunobuvardages, chez des souris post-natales de jour 0 (P0), P14 et adultes. Le recours au double marquage de la netrine-1 avec un anticorps spécifique contre RBPMS, un marqueur sélectif pour les cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), a permis l’identification de sa localisation sur les sections transversales de rétine. De plus, les niveaux de netrin-1 ont également été quantifiés à trois et sept jours après l'axotomie du nerf optique. Nous avons démontré que la netrine-1 et DCC sont fortement exprimés dans la rétine à P0, toutefois l’expression de netrin-1 est relativement stable pendant le développent alors que l’expression de DCC est remarquablement réduite à l'âge adulte. De plus, ces expériences ont conclu une expression robuste de la netrin-1 dans le soma RGC adulte et, une expression des récepteurs DCC autour du corps cellulaire. Fait important, nous avons aussi pu démontrer que les niveaux d’expressions de la netrine-1 et DCC sont réduits à trois et sept jours suivant l'axotomie du nerf optique. Cependant, la surexpression de la protéine netrin-1 n'a pas eu un effet significatif sur la survie du RGC par rapport aux témoins injectés par un véhicule. Les résultats obtenus suggèrent que : (i) la netrine-1 est abondamment exprimée dans la rétine néonatale et subit une diminution importante à l'âge adulte, (ii) la netrine-1 et son récepteur DCC sont présents dans les RGC et, (iii) l'expression de la netrine-1 diminue considérablement suite à une lésion axonale. Ensemble, ces résultats suggèrent un rôle pour la netrin-1 dans le système visuel chez les adultes. / Netrin-1 plays a highly-conserved role as a guidance cue directing axonal growth during the early stages of central nervous system development. Recent data has shown that netrin-1 is continued to be expressed in the adult forebrain where it regulates synaptic function and plasticity in cortical neurons. However, the contribution of netrin-1 in the adult retina remains unknown. The purpose of this study was to characterize the expression of netrin-1 in the intact and injured adult mouse retina. The retinal expression of netrin-1 and its receptor, deleted in colorectal cancer (DCC), was examined at postnatal day 0 (P0), P14, and adult mice using western blots. Double labeling of netrin-1 with an antibody against RBPMS, a selective marker for retinal ganglion cells (RGCs), was used to determine its location on retinal cross-sections. Netrin-1 levels were also quantified at 3 and 7 days after optic nerve axotomy. We demonstrate that netrin-1 and DCC are abundantly and widely expressed in the retina at P0, but although the expression level of netrin-1 remains relatively stable during development, the expression level of DCC is markedly downregulated in adulthood. Adult RGC soma were shown to be endowed with robust netrin-1 expression. DCC receptors were also found to be expressed around the cell body. Importantly, we show that netrin-1 and DCC levels are further downregulated at 3 and 7 days after optic nerve axotomy. However, the over-expression of netrin-1 protein failed to exert any significant effect on RGC survival in comparison to vehicle-injected controls. Our data support that: 1) netrin-1 is abundantly expressed in the neonatal retina and undergoes marked downregulation in adulthood, 2) netrin-1 and DCC are present in RGCs, 3) netrin-1 expression decreases rapidly after axonal injury. Together, these results suggest a role for netrin-1 in the mature visual system.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, nach einer irreversiblen Schädigung des Sehnervs zu zeigen, ob retinale Ganglienzellen zu Umstrukturierungsprozessen an ihren Axonen ohne neuroprotektive Unterstützung fähig sind. Das besondere Interesse galt der licht- und elektronenmikroskopischen Analyse. Verwendet wurden 37 adulte Albinoratten (WISTAR-Prob). Zuerst wurde der Nervus opticus für 30 s 5 mm hinter dem Bulbus oculi gequetscht. Ein zweiter invasiver Eingriff, der zur retrograden Markierung von aberranten Neubildungen an den Axonen der Nervenfaserschicht durchgeführt wurde, fand zu den postoperativen Überlebenszeiten (ÜLZ) von drei und zehn Tagen, zwei, drei,vier, acht und zwölf Wochen sowie nach sechs und zwölf Monaten statt. Für die retrograde Markierung wurde das biotinylisierte Dextranamin (BDA) eingesetzt, das unter Verwendung des Chromogens Diaminobenzidin visualisiert wurde.Die folgenden Befunde konnten auf lichtmikroskopischer Ebene ermittelt werden: · axonale Schwellungen, · dornenförmige Fortsätze, · intraretinale Axonsprosse mit Wachstumskegeln, · zwei Formen von intraretinalen Axonkollateralen und · aberrante axonale Trajektorien in Form von Schleifenaxonen. Basierend auf dem lichtmikroskopischen Befund wurden ausgewählte Bereiche der Netzhaut ultrastrukturell untersucht.Axonale Schwellungen konnten hinsichtlich ihrer Gestalt in spindelförmig, ballonierend und breitbasig polypös unterschieden werden. Dornenförmige Fortsätze an den Nervenfasern stellen vermutlich ein morphologisches Erscheinungsbild zur Herstellung eines funktionellen Gleichgewichts dar. Die intraretinalen Axonsprosse mit ihren birnenförmigen Wachstumskegeln konnten erstmalig elektronenmikroskopisch in einer adulten Rattennetzhaut nach einer Schädigung des Nervus opticus beschrieben werden. Die nach den ÜLZ von zehn Tagen, zwei, drei und vier Wochen dokumentierten aberranten Fortsätze orientierten sich hauptsächlich vom Discus nervi optici zur Netzhautperipherie. Zu allen ÜLZ besaßen sie eine rundliche oder ovoide Gestalt und wiesen eine Größe von 5 bis 10 µm auf. Sie gingen aus einem Hauptfaszikel in der Nervenfaserschicht hervor und existierten in enger Korrelation zu benachbarten Axonen und Blutgefäßen. Die Definition des Wachstumskegels wurde durch den ultrastrukturellen Befund der Akkumulation von Mitochondrien und wachstumskegeltypischen Vesikeln verifiziert. Die Axonsprosse mit ihren Wachstumskegeln stellen das morphologische Substrat von temporären Reorganisationen der RGC nach einer Unterbrechung ihrer axonalen Efferenz dar. Es waren zwei Formen von intraretinalen Axonkollateralen sichtbar. Bei der ersten Form handelt es sich um eine axonale Kollateralisierung nach einem dreiwöchigen Versuch, die unmittelbar hinter dem Axonhügel einer Typ-III-RGC abzweigte. Diese Form der Kollateralisierung könnte vermutlich im Zusammenhang mit regenerativen Leistungen in der Netzhaut stehen, die unter dem Begriff axon-like processes definiert wurden. Die zweite Kollateralisierungsform zwei Wochen nach der Läsion bildete sich in einem orthogonalen Winkel von einer Nervenfaser in einem Axonfaszikel und entsendete mehrere Kollateralzweige. Acht Wochen nach einer Nervus opticus-Axotomie konnte eine Axonkollaterale dokumentiert werden, die sich in einem fortgeschrittenen Degenerationsprozess befand. Die beschriebene intraretinale Axonkollaterale konnte erstmalig bei der adulten Albinoratte beschrieben werden. Zwei und drei Wochen post lesionem konnten in zwei Versuchen Nervenfasern dokumentiert werden, die durch eine auffallende Schleifenbildung gekennzeichnet waren. Resümierend konnte auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene nachgewiesen werden,dass geschädigte retinale Ganglienzellen in der adulten Ratte zu axonalem Wachstum ohne neuroprotektive und neuropermissive Unterstützung fähig sind. Die beobachteten regenerativen Leistungen sind vermutlich auf das Wirken von Neurotrophinen in der Retina oder im Sehnerv selbst zurückzuführen. / The present light and electron microscopic study was undertaken to determine whether axotomized retinal ganglion cells are able to reestablish intraretinal axons without experimental neuroprotective support. 37 adult albino rats (WISTAR-Prob) were used. In a first step, the optic nerve was intraorbitally exposed and crushed for 30 s at about 5 mm from the ocular bulb. A second experiment was conducted in order to stain newly formed intraretinal axonal elements after postlesion times of either three and ten days, two, three, four, eight, and twelve weeks, or six and twelve month. Retrograde labelling was achieved using biotinylated dextran amine (BDA),followed by visualization with diaminobenzidine as chromogen. The following structures were detected light microscopically: · axonal swellings, · spine-like processes, · intraretinal axonal sprouts showing growth cones, · two types of axonal collaterals, and · aberrant axonal fibers forming so-called looping axons. On the basis of light microscopy selected areas of the retina were examined electron microscopically. Axonal swellings were typified by their shape as spindle-shaped, ballon-shaped or broad-basic polypous. Also spine-like processes, which might serve the reestablishment of a functional balance within the retinal network, were detected. Intraretinal axonal sprouts, showing pear-shaped growth cones at their endings, could be demonstrated for the first time on the ultrastructural level. Aberrant processes, most of them orientated from the optic disc to the retinal periphery, were found at survival times of ten days as well as after two, three and four weeks. At all survival stages investigated the growth cones showed a plump or ovoid morphology and ranged in size between 5 to 10 µm. Usually, they were found to originate from nerve fiber fascicles located in close neigbourhood to the axons but also to blood vessels of the inner retina. The light microscopical typification of growth cones was confirmed at the ultrastructural level, particularly as accumulated mitochondria and growth cone-specific vesicles were detected. Probably, axonal sprouts and growth cones represent a temporal attempt of retinal ganglion cells to regenerate after transection of the optic nerve. Two axon collaterals were detected in the inner retina. In the first case, three weeks postlesion, an axon was found to branch immediately behind the axon hillhock of a type III ganglion cell. This kind of collateralization is indicative of a regenerative response as it has been previously reported by other authors who found so-called axon-like processes. In a second case, two weeks postlesion, an axon appeared to bifurcate orthogonally from a fiber fascicle sending off several collaterals on its way. Furthermore, a degenerating axon collateral was seen eight weeks after optic nerve lesion. The types of axon collaterals presented in this study were described for the first time in the albino rat. So-called looping axons typically characterized by their circular course were found in the inner retina two and three weeks postlesion. In conclusion, the light and electron microscopical results demonstrate that axotomized retinal ganglion cells of the adult rat retain the capability for axonal outgrowth without any neuroprotective and neuropermissive support. Since no experimental growth-promoting measures had been taken, it might be speculated whether the observed regenerative processes were due to intrinsic neurotrophic factors in the retina or the optic nerve themselfes.

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome. / Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. At present, there is no cure for glaucoma, and current therapies are often inadequate. Loss of vision in glaucoma results from the death of retinal ganglion cells, the neurons that send visual information from the retina to the brain. The principal mechanism leading to retinal ganglion cell damage during glaucoma is not well understood, however, putative culprits have been proposed including excitotoxicity, neurotrophin deprivation, mechanical compression, ischemia, reactive astrocytes and oxidative stress. It is well established that retinal ganglion cell loss during glaucoma is caused by apoptotic programmed cell death, however, the precise mechanisms that lead to apoptotic death of adult retinal ganglion cells are poorly defined. To address this point, I put forth the central hypothesis that the identification of signaling pathways involved in apoptotic retinal ganglion cell death would offer therapeutic avenues to slow or prevent retinal ganglion cell death during ocular neuropathies such as glaucoma. In the first part of my thesis, I characterised the role of Apoptosis Stimulating Protein of p53 family (ASPP) proteins, which are regulators of p53, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. p53 is a nuclear transcription factor implicated in cellular functions ranging from transcription to apoptosis. ASPP family members ASPP1, ASPP2 and iASPP are p53 binding proteins that belong to a family of protein regulators of p53-dependent apoptotic death. However, the role of ASPP family members in retinal ganglion cell death is unknown. As ASPP1 and ASPP2 are pro-apoptotic, the hypothesis of our first study was that the knockdown of ASPP1 and ASPP2 gene expression would lead to retinal ganglion cell survival after an optic nerve lesion. We used a well-characterized experimental model of neuronal apoptosis induced by optic nerve axotomy in Sprague Dawley rats. The results of this study (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) demonstrated that p53 is implicated in retinal ganglion cell death, and that targeted knockdown of ASPP1 and ASPP2 by short interference ribonucleic acid promotes retinal ganglion cell survival. The knockdown of ASPP2 correlates with a reduction in the levels of pro-apoptotic p53 regulated targets PUMA and Fas/CD95. In the second part of my thesis, I characterized the role of the anti-apoptotic member of the ASPP family, iASPP, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. The hypothesis of this second study is that the overexpression of iASPP would promote retinal ganglion cell survival after axotomy. The data (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) demonstrate that the targeted knockdown of iASPP by short interference ribonucleic acid exacerbates retinal ganglion cell death, and that the overexpression of iASPP by adeno-associated virus promotes retinal ganglion cell survival. The overexpression of iASPP correlates with a reduction in protein levels of PUMA and Fas/CD95. In conclusion, the findings presented in this thesis contribute to a better understanding of the pathological mechanisms underlying retinal ganglion cell loss by apoptosis and might provide insights into the design of novel neuroprotective treatments for neurodegenerative diseases such as glaucoma.

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome. / Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. At present, there is no cure for glaucoma, and current therapies are often inadequate. Loss of vision in glaucoma results from the death of retinal ganglion cells, the neurons that send visual information from the retina to the brain. The principal mechanism leading to retinal ganglion cell damage during glaucoma is not well understood, however, putative culprits have been proposed including excitotoxicity, neurotrophin deprivation, mechanical compression, ischemia, reactive astrocytes and oxidative stress. It is well established that retinal ganglion cell loss during glaucoma is caused by apoptotic programmed cell death, however, the precise mechanisms that lead to apoptotic death of adult retinal ganglion cells are poorly defined. To address this point, I put forth the central hypothesis that the identification of signaling pathways involved in apoptotic retinal ganglion cell death would offer therapeutic avenues to slow or prevent retinal ganglion cell death during ocular neuropathies such as glaucoma. In the first part of my thesis, I characterised the role of Apoptosis Stimulating Protein of p53 family (ASPP) proteins, which are regulators of p53, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. p53 is a nuclear transcription factor implicated in cellular functions ranging from transcription to apoptosis. ASPP family members ASPP1, ASPP2 and iASPP are p53 binding proteins that belong to a family of protein regulators of p53-dependent apoptotic death. However, the role of ASPP family members in retinal ganglion cell death is unknown. As ASPP1 and ASPP2 are pro-apoptotic, the hypothesis of our first study was that the knockdown of ASPP1 and ASPP2 gene expression would lead to retinal ganglion cell survival after an optic nerve lesion. We used a well-characterized experimental model of neuronal apoptosis induced by optic nerve axotomy in Sprague Dawley rats. The results of this study (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) demonstrated that p53 is implicated in retinal ganglion cell death, and that targeted knockdown of ASPP1 and ASPP2 by short interference ribonucleic acid promotes retinal ganglion cell survival. The knockdown of ASPP2 correlates with a reduction in the levels of pro-apoptotic p53 regulated targets PUMA and Fas/CD95. In the second part of my thesis, I characterized the role of the anti-apoptotic member of the ASPP family, iASPP, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. The hypothesis of this second study is that the overexpression of iASPP would promote retinal ganglion cell survival after axotomy. The data (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) demonstrate that the targeted knockdown of iASPP by short interference ribonucleic acid exacerbates retinal ganglion cell death, and that the overexpression of iASPP by adeno-associated virus promotes retinal ganglion cell survival. The overexpression of iASPP correlates with a reduction in protein levels of PUMA and Fas/CD95. In conclusion, the findings presented in this thesis contribute to a better understanding of the pathological mechanisms underlying retinal ganglion cell loss by apoptosis and might provide insights into the design of novel neuroprotective treatments for neurodegenerative diseases such as glaucoma.

La stimulation électrique directe (SED), pour une heure, améliore la régénération de nerfs périphériques chez le rat après la réparation. Cliniquement, ceci augmenterait le temps opératoire, rehaussant les risques de complications périopératoires. Objectif: Cette étude examine si la stimulation électrique transcutanée (SETC) est aussi efficace à améliorer la régénération de nerfs périphériques que la stimulation électrique directe. Méthode: Le nerf sciatique droit de 28 souris a été axotomisé. Une réparation par microsuture est effectuée. Quatre groupes sont étudiés : (1) sham; (2) suture seulement; (3) suture et SED; (4) suture et SETC. La stimulation est appliquée pour 1 heure à 20 Hz. Les souris sont étudiées pour un total de 12 semaines. La récupération sciatique est évaluée aux semaines 0, 1, 2 et aux 2 semaines par la suite par analyse de démarche sur la poutre. Résultats: La cinématique post-récupération démontre un index fonctionnel sciatique et angle de décollement significativement améliorés pour les groupes SED et SETC aux semaines 8, 10 et 12. Conclusions: 12 semaines après l’axotomie du nerf sciatique, la récupération fonctionnelle est significativement améliorée avec la SED et la SETC. Donc, la SETC est aussi bénéfique pour la promotion de la régénération nerveuse et réinnervation musculaire fonctionnelle que la SED. / Direct electrical stimulation (DES) for one hour increases the rate of peripheral nerve regeneration in rats after nerve repair. Clinically, this would lengthen surgery time, increasing risks of perioperative complications. Purpose: This study examines whether transcutaneous electrical stimulation (TCES) is as effective at improving peripheral nerve regeneration as direct electrical stimulation. Methods: The right sciatic nerve was axotomized in 28 mice. End-to-end microsuture repair was undertaken. Four groups were studied: (1) sham; (2) suture only; (3) suture and DES; (4) suture and TCES. Stimulation was applied for 1 hour, at 20 Hz. The mice were studied for a total of 12 weeks. Hind-limb recovery was evaluated at weeks 0, 1, 2 and then every 2 weeks by walking-track analysis. Results: Post recovery kinematic showed significantly improved functional sciatic index and foot-base angles at weeks 8, 10 and 12 for both DES and TCES groups. Conclusions: 12 weeks after sciatic nerve axotomy, functional recovery was improved significantly in both DES and TCES groups. Therefore, TCES is as beneficial in promoting nerve regeneration and functional muscle reinnervation as is DES.

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