Les anomalies de TP53, que sont la délétion génique associée ou non à des mutations somatiques, demeurent un facteur de résistance au traitement dans le Myélome Multiple (MM) malgré l’introduction de nouveaux agents thérapeutiques. Pour contourner les anomalies de TP53, nous avons étudié la possibilité d’activer p73, un membre de la famille de p53, qui n’est pas fréquemment muté dans les cancers. Nous avons étudié l’expression, la méthylation et la régulation de TP73 dans une collection de lignées de MM sauvages ou déficientes pour p53. Nous montrons que TP73 est rarement exprimé et surtout dans les lignées TP53 sauvage. Nous avons étudié la méthylation de l’ilot CpG situé en amont du gène par MS-PCR et montré que l’absence d’expression correspond à son hyperméthylation, qui peut néanmoins être réversée par la décitabine, un inhibiteur de la méthylation. Malgré l’augmentation d’expression de TP73, la décitabine ne permet pas une expression protéique significative de p73. Pour étudier la régulation de p73, nous avons utilisé des agents alkylants, des inhibiteurs de MDM2 et du protéasome. Nous montrons que les nutlin3a et MG132, ne stabilisent pas p73 mais diminuent son expression constitutive. Les agents alkylants induisent une augmentation de p73 mais uniquement dans les lignées TP53 sauvage et l’extinction de p53 par ARN interférence inhibe cette régulation. Dans les lignées déficientes pour p53, la décitabine augmente l’expression génique mais le melphalan ne permet pas de stabilisation de la protéine. L’ensemble de nos résultats montre que TP73 n’apparaît pas être un bon candidat pour contourner les anomalies de TP53. / TP53 deficiency remains a major adverse event in Multiple Myeloma despite therapeutic progresses. p73, a member of p53 family, is very rarely mutated and has been poorly studied in myeloma. Using human myeloma cell lines with different TP53 status, we assessed methylation, expression and regulation of TP73. We report that TP73 is silenced by methylation and that decitabine increases its expression, which remains however insufficient for significant protein expression. Alkylating drugs increase expression of TP73 only in TP53wt cells and fail to synergize with decitabine in p53 deficient cells. On the other hand, MG132 and nutlin-3a don’t stabilize p73 in response to in TP53wt p73 positive cell lines. TP73 does not appear as a promising target for bypassing p53 deficiency in Multiple Myeloma.

Ces travaux de thèse ont porté sur le développement de formulations innovantes et nanoparticulaire, destinées à améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes (LAM). Cette amélioration de la qualité de vie peut passer par le développement d’une formulation orale de décitabine.Trois stratégies de formulations différentes ont été développées : deux formulations de nanocapsules lipides (LNCs) avec encapsulation ou de décitabine, ou d’une prodrogue de décitabine (décitabine(C12)2) . La troisième stratégie a été le développement de particules de type liposomal, dans lesquelles la décitabine a été encapsulée. Après avoir été caractérisée sur des critères physicochimiques, chacune des stratégies basées sur les LNCs a été évaluée par des essais in vitro pour évaluer la perméabilité intestinale de la décitabine lorsqu’elle a été encapsulée. Une des stratégies a permis d’accroitre la perméabilité, in vitro, de la décitabine. L’activité sur la prolifération cellulaire a ensuite été évaluée sur des cellules humaines de LAM. Il a été démontré que l’encapsulation dans les LNCs améliore l’activité de la décitabine et de la décitabine (C12)2. Après l’ensemble de ces essais, en vue d’évaluer le potentiel avantages de ces formulations pour augmenter la demi-vie plasmatique de la décitabine, leurs stabilités dans du plasma humain a été évaluée. La décitabine (C12)2 libre et encapsulée permettent de limiter la dégradation rapide de la décitabine. Finalement, une étude de pharmacocinétique a été mise en place. L’encapsulation de la décitabine, en synthétisant au préalable une prodrogue permet d’augmenter les concentrations maximales atteintes. / The aim of this phD work was to develop nanoparticle formulations to improve patients’quality of life in case of acute myeloid leukemia (AML). These formulations could, for example, allow an oral administration of decitabine. Three different formulations were developed: two were based on lipid nanocapsules (LNCs) with an encapsulation of decitabine or a decitabine prodrug (decitabine(C12)2). The third strategy was aliposomal formulation with a decitabine encapsulation. After being characterized on physico-chemical parameters, in vitro intestinal permeability studies were performed on LNCs strategies. One strategy was able to enhance decitabine permeability. Cell proliferation studies performed on human AMLcell lines showed that encapsulations into LNCs improve decitabine and decitabine(C12)2 activities. In order to evaluate the potential of these formulations to enhance decitabine plasma half-life, their stabilities in human plasma were then assayed. Free decitabine(C12)2 or encapsulated into LNCs has been shown to limit the rapid decitabine degradation. Finally, pharmacokinetic studies were performed. Decitabine encapsulation into LNCs with a previous decitabine prodrug synthesis was able to increase maximal plasma concentrations.

La résistance à la chimiothérapie constitue un frein majeur à son efficacité. Notre équipe a récemment pu montrer que le masitinib, un nouvel inhibiteur de protéines tyrosine kinases, possède une activité de resensibilisation des cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie lorsqu'il est combiné à certaines chimio-drogues. L'objectif des travaux de cette thèse est de déterminer les voies de signalisation, modulées par l'action du masitinib, qui sont impliquées dans la resensibilisation aux chimiothérapies et amélioration de l'activité anti-tumorale.Dans la première partie de la thèse, nous avons pu identifier la nucléoside kinase dCK (désoxycytidine kinase), protéine activatrice d'un grand nombre de chimiothérapies, comme nouvelle cible du masitinib. Cette première étude nous a permis de mettre en évidence un nouveau concept thérapeutique: le masitinib, un composé chimique de type inhibiteur de protéines tyrosine kinases, peut jouer en même temps le rôle d'activateur de nucléoside kinase.Nous avons pu mettre en évidence dans la deuxième partie de la thèse que le traitement combiné entre l'épi-drogue décitabine et le masitinib peut être plus efficace pour la réexpression de certains gènes non ou peu induits par la décitabine seule.En conclusion, ces travaux nous ont permis de mettre en évidence l'interaction entre un inhibiteur de protéine tyrosine kinases et une nucléoside kinase, dans un concept d'activation enzymatique qui pourra certainement servir de base pour l'élaboration de nouvelles petites molécules chimiques spécifiques de l'activation de dCK ou d'autres nucléosides kinases nécessaires à l'activation des drogues de chimiothérapie. / Resistance to chemotherapy is considered as one of the major blockers of its efficacy. Recently, our team demonstrated that masitinib, a new tyrosine kinases inhibitor, possesse a resensitization activity of cell lines resistant to chemotherapy when associated with chemodrugs.The aim of this work is to determine signaling pathways, modulated by masitinib action, that could explain the resensitization to chemotherapy and improvement of anti-tumoral activity.In the first part of this work, we identified the nucleoside kinase dCK (deoxycytidine kinase), a chemotherapy activating protein, as a new target of masitinib. In summary, this first part of the work allowed us to describe a new and never described concept: masitinib, a small molecule belonging to tyrosine kinases group, can also play a role as nucleoside kinase activator.We were able to demonstrate through the second part of the work that the combined treatment of the epidrug decitabine and masitinib can be more effective than decitabine treatment for the re-expression of some genes non or weakly induced by decitabine when used alone.In conclusion, These data allowed us to introduce an interaction between a tyrosine kinases inhibitor and a nucleoside kinase, as an enzymatic activation new concept. This could be used as a base for the design of new small chemical molecules specific for dCK or other nucleoside kinases essential for the activation of chemodrugs. This concept will obviously help to imagine and evaluate more potential therapeutic combinations of chemodrugs and small chemical molecules to overcome the resistance to chemotherapy dependent on nucleoside kinases.

Dans certains cancers, le ligand nétrine-1 (NTN1) est surexprimé, induisant alors une inhibition de l'apoptose induite par ses récepteurs à dépendance DCC et UNC5H, et promouvant ainsi la progression tumorale. Néanmoins, dans d'autres cancers, l'inhibition sélective de l'apoptose induite par cette voie de signalisation est liée à la perte d'expression de protéines pro apoptotiques effectrices. Dans cette étude, nous avons montré chez l'homme qu'une forte proportion de cancers mammaires et pulmonaires subit des pertes d'expression de DAPK1 et NTN1 liées à l'hyperméthylation de leur promoteur. DAPK1 est une protéine kinase notamment responsable de la transmission du signal proapoptotique des récepteurs à dépendance en absence de leur ligand nétrine-1. L'inhibition de la méthylation de l'ADN à l'aide d'épidrogues telles que la décitabine dans les cancers exprimant faiblement NTN1 restaure l'expression à la fois de DAPK1 et NTN1. Ainsi, la combinaison de traitements décitabine avec des stratégies induisant le silence transcriptionnel de NTN1, ou des anticorps bloquant l'interaction entre le ligand (NTN1) et son récepteur (UNC5B dans le cas présent), induit la potentialisation de la mort cellulaire des tumeurs, et bloque efficacement la croissance tumorale dans différents modèles animaux. Ainsi, combiner l'utilisation d'inhibiteurs de la méthylation de l'ADN avec des agents neutralisant la nétrine-1 pourrait représenter une stratégie pertinente pour combattre ces cancers / In a substantial part of human cancers, netrin-1 (NTN1) is up-regulated and this upregulation is inhibiting apoptosis induced by its so-called dependence receptors DCC and UNC5H and thus promotes tumor progression. However, in other cancers, the selective inhibition of this dependence receptor death pathway relies on the silencing of pro-apoptotic effector proteins. We show here that a large fraction of human breast and lung tumors exhibits simultaneous DNA methylation-dependent loss of expression of NTN1 and of DAPK1, a serine threonine kinase known to transduce the netrin-1 dependence receptor pro-apoptotic pathway. The inhibition of DNA methylation by drugs such as decitabine in netrin- 1-low cancer cells restores the expression of both NTN1 and DAPK1. Consequently, the combination of decitabine with NTN1 silencing strategies or with an anti-netrin-1 neutralizing antibody potentiates tumor cell death and efficiently blocks tumor growth in different animal models. Thus, combining DNA methylation inhibitors with netrin-1 neutralizing agents may be a valuable strategy for combating cancer

Les glycosides cardiotoniques sont des inhibiteurs des pompes sodium / potassium utilisés pour le traitements des insuffisances cardiaques, qui détiennent également des activités anticancéreuses et épigénétiques récemment caractérisées. Toutefois, dans l’objectif de repositionner ces médicaments comme traitement anticancéreux, les mécanismes sousjacents aux activités anticancéreuses et épigénétiques des glycosides cardiotoniques restent à être déterminés. Dans nos travaux, nous révélons que la proscillaridine A est le glycoside cardiotonique qui détient des activités anticancéreuses et épigénétiques les plus puissantes dans des lignées de cancer du côlon, de leucémies et de sarcomes pédiatrique. De plus, nous avons identifié que l’activité anticancéreuse de la proscillaridine A corrèle positivement avec le niveau d’expression protéique du proto-oncogène MYC dans un panel de 14 lignées cellulaires cancéreuses. Dans les lignées cellulaires exprimants un haut niveau de MYC telles que les lignées leucémiques, la proscillaridine A agit comme un inhibiteur de MYC et module sa stabilité protéique ainsi que la régulation transcriptionnelle et translationnelle de ces cibles. Cette inhibition est induite par la baisse significative de l’expression des enzymes épigénétiques les lysines acétyltransférases (KATs), qui contrôlent l’ajout des résidus d’acétylcoenzyme A sur les histones et sur d'autres protéines dont MYC. La baisse d’expression des KATs résultent à une baisse de l’acétylation des résidus de l’histone 3 et à une reprogrammation de l’acétylome des cellules cancéreuses surexprimant MYC. Ces changements au niveau de la chromatine induisent une reprogrammation transcriptionnelle et phénotypique des cellules surexprimant MYC, qui se traduit par une perte de la transcription des programmes oncogéniques et l’induction des programmes associés à la différenciation cellulaire. Pour finir, nous avons évalué le potentiel synergique anticancéreux et épigénétique de la proscillaridine A avec le médicament épigénétique la décitabine dans des lignées cancéreuses exprimants des niveaux différentiels de MYC. Dans une lignée résistante à la proscillaridine A et exprimant de faible niveau de MYC (lignée de cancer de côlon), la décitabine et la proscillaridine A démontrent des activités épigénétiques synergiques tandis que dans une lignée sensible à la proscillaridine A et surexprimant MYC (lignée de sarcome pédiatrique), la décitabine et la proscillaridine A démontrent des activités antiprolifératives synergiques. Dans ces travaux, nous avons donc démontré le potentiel de repositionner la proscillaridine A dans les cancers surexprimant MYC. Également, nous démontrons le potentiel synergique anticancéreux et épigénétique de la proscillaridine A avec la décitabine et nous suggérons d’étudier cette combinaison de médicaments dans les cancers plus résistants à la proscillaridine A. / Cardiac glycosides are sodium/potassium pomps’ inhibitors used for the treatment of heart failure, and whose anticancer and epigenetic activities have been recently characterized. However, in order to repurpose cardiac glycosides as anticancer drugs, mechanistic studies are required to identify the anticancer and epigenetic mechanism of actions. In our experiments, proscillaridin A exhibited the most powerful anticancer and epigenetic activities in colon cancer, leukemia, and sarcoma cell lines. Moreover, we demonstrated that in a panel of 14 cancer cell lines, proscillaridin A anticancer activities positively correlated with MYC protooncogene expression level. In high MYC expressing cell lines such as leukemia, proscillaridin A inhibited MYC expression through protein destabilization and through transcriptomic and translational regulation of MYC targets. Theses inhibitions are induced by the loss of lysine acetylatransferase (KAT) expressions, which are epigenetic enzymes controlling the addition of acetyl-coenzyme A on histones and other proteins such as MYC. KAT inhibitions are responsible for the global loss of histone 3 acetylation and acetylome reprogrammation in high MYC expressing cancer cells. These chromatin changes induced transcriptomic and phenotypic reprogrammation, defined by a loss of the transcription of oncogenic programs and the induction of cell differentiation. To finish, we evaluated the anticancer and epigenetic synergic potential of proscillaridin A in combination with the epigenetic drug the decitabine in cancer cell lines expressing different MYC levels. In a cancer cell line resistant to proscillaridin A treatments and expressing low MYC level (colon cancer cell line), the combination of decitabine and proscillaridin A demonstrated synergistic epigenetic activity although, in a cell line sensitive to proscillaridin A treatments and expressing high MYC level (sarcoma cell line), the combination of decitabine and proscillaridin A exhibited synergistic anti-proliferative activity. To conclude, we highlighted the potential of repurposing proscillaridin A as an anticancer treatment in high MYC expressing cells. Furthermore, we demonstrated the anticancer and epigenetic synergistic potential of proscillaridin A in combination with decitabine and we propose to study the drug combination in cancers that are resistant to proscillaridin A treatment.