We have previously shown that the arcuate organization of cell fates within the ventral midbrain critically depends upon the morphogen, Sonic Hedgehog (SHH), which is secreted from a signaling center located along the ventral midline, called the floor plate (FP). Thus, it is ultimately the specification of the FP that is responsible for the patterning and specification of ventral midbrain cell fates. Interestingly, we have found that the chick midbrain FP can be divided into medial (MFP) and lateral (LFP) regions on the basis of gene expression, mode of induction and function. Overexpression of SHH alone is sufficient to recapitulate the entire pattern of ventral cell fates, although remarkably it cannot induce MFP, consistent with the observation that the MFP is refractory to any perturbations of HH signaling. In contrast, overexpression of the winged-helix transcription factor FOXA2/HNF3[beta]robustly induced the MFP fate throughout ventral midbrain while blocking its activity resulted in the absence of the MFP. Thus, by analyzing the differences between SHH and FOXA2 blockade and overexpression, we were able to attribute functions to each the LFP and the MFP. Notably, we observed that FOXA2 overexpression caused a bending of the midbrain neurepithelium that resembled the endogenous median hinge-point observed during neurulation. Additionally, FOXA2 misexpression led to a robust induction of DA progenitors and neurons that was never observed after SHH expression alone. In contrast, we found that all other ventral cell types required HH signaling directly, at a distance and early on in the development of the midbrain when its tissue size is relatively small. Additionally, HH blockade resulted in increased cell-scatter of the arcuate territories and in the disruption of the regional boundaries between the ventral midbrain and adjacent tissue. Thus, we bring new insight into the mechanism by which midbrain FP is specified and ascribe functional roles to its subregions. We propose that while the MFP regulates the production of dopaminergic progenitors and the changes in cellshape required for bending and shaping the neural tube, the LFP appears to be largely responsible for cell survival and the formation of a spatially coherent pattern of midbrain cell fates. / text

RIC-8B é um fator trocador de nucleotídeo de guanina (GEF) predominantemente expresso em neurônios olfatórios maduros de camundongos adultos. Trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório mostraram que RIC-8B interage com Gαolf e Gγ13, duas subunidades de proteína G que estão enriquecidas nos cílios dos neurônios olfatórios, onde participam da transdução do sinal de odorantes. In vitro, RIC-8B é capaz de amplificar a sinalização de receptores olfatórios através de Gαolf, no entanto, seu papel fisiológico ainda é desconhecido. Para determinar a função desempenhada por essa proteína in vivo, nós utilizamos a tecnologia de Gene Trap com o objetivo de produzir um camundongo knockout para Ric-8B. Apesar de a expressão de Ric-8B ser restrita a poucos tecidos no camundongo adulto, descobrimos que homozigotos para a mutação em Ric-8B são inviáveis e morrem por volta do dia embrionário E10,5. Além disso, são menores e apresentam evidente falha no fechamento do tubo neural na região cranial (exencefalia). Utilizamos o gene repórter β-galactosidase expresso pelo alelo mutado para determinar o padrão de expressão de Ric-8B em embriões durante o desenvolvimento. Observamos que, no estágio E8,5, Ric-8B é expresso nas pregas neurais da região cefálica e na notocorda. De E9,5 a E12,5, a expressão de Ric-8B é detectada predominante no assoalho da placa. Esse padrão de expressão se assemelha ao de outro gene importante para a embriogênese, Sonic hedgehog (Shh). SHH é um morfógeno diretamente responsável pela padronização dorsoventral do sistema nervoso central e sua sinalização depende de cílio primário. Cílio primário é uma organela baseada em microtúbulos que se projeta da superfície da maioria das células de mamíferos e funciona como um centro de sinalização intracelular. Nossos dados mostram que fibroblastos embrionários Ric-8B-/- formam cílios primários, assim como alguns tecidos do embrião. Além disso, não encontramos alterações na sinalização de Shh em embriões homozigotos mutantes. No entanto, observamos que esses embriões apresentam apoptose aumentada em células migratórias da crista neural cranial. Shh é importante para a sobrevivência de células da crista neural migratória, sugerindo um possível papel para Ric-8B a downstream da sinalização de SHH. / Ric-8B is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) which is predominantly expressed in mature olfactory sensory neurons in adult mice. We have previously shown that RIC-8B interacts with both Gαolf and Gγ13, two G protein subunits, which are enriched in olfactory cilia and are required for odorant signal transduction. In vitro, RIC-8B is able to amplify odorant receptor signaling through Gαolf, however, its physiological role remains unknown. To determine the role played by RIC-8B in vivo we used the Gene trap technology to generate a Ric-8B knockout mouse. We found that, despite the limited distribution of Ric-8B gene expression in adult mice, Ric-8B homozygous mutants are not viable and die around the E10,5 stage. Mutant embryos are also smaller and fail to close the neural tube at the cranial region (exencephaly). We used the activity of the β-galactosidase reporter gene to determine the pattern of expression of the Ric-8B gene in heterozygous embryos. At E8,5 the Ric-8B gene is expressed in the notochord and neural folds of the cephalic regions. From E9,5 to E12,5 Ric-8B is predominantly expressed in the floor plate, in a pattern that strongly resembles the one shown by Sonic hedgehog (Shh). SHH is a morphogen directly responsible for the dorsoventral patterning of the central nervous system and its signaling depends on primary cilia. Primary cilia are microtubule-based organelles that protrude from the surface of mammalian cells and act as a signaling center. We show that Ric-8B-/- embryonic fibroblasts and some embryonic tissues grow primary cilia normally. In addition, we did not find alterations in the SHH signaling of homozygous mutants. Instead, we found an increased apopotosis in migratory cells of the cranial neural crest in these embryos. Shh is an important factor to survival of neural crest cells, suggesting a role for RIC-8B downstream of the SHH signaling.

Chez les bilatériens, les connexions permettant de relier la partie droite et gauche du système nerveux central (SNC) sont appelées commissures cérébrales. Comprendre les mécanismes moléculaires permettant la mise en place de ces circuits constituent un enjeu majeur en neurobiologie du développement. Le guidage des commissures cérébrales repose sur des paires de ligands-récepteurs telles que Netrine-1/DCC et Slits/Robos. Nétrine et Slits sont exprimés au niveau de la plaque du plancher tandis que leurs récepteurs respectifs, DCC et Robo1/2, sont exprimés dans les neurones et axones commissuraux de la moelle épinière et du tronc cérébral au cours du développement. L'étude des souris déficientes pour ces gènes a permis d'établir un modèle : Nétrine-1, agirait à distance afin d'attirer les axones commissuraux par gradient vers la ligne médiane ventrale, puis, les Slits permettraient de repousser les axones en dehors de la plaque du plancher. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des modèles génétiques murins afin d'étudier in vivo la mise en place des commissures et la migration des neurones précérébelleux. Nous avons inactivé de façon spécifique l'expression des molécules Nétrine-1, Slits et Robo1/2 dans différentes régions du SNC. Nous avons montré que la présence de Nétrine-1 dans la plaque du plancher n'était pas nécessaire à l'attraction des axones commissuraux mais que la source principale de Nétrine-1 était la glie radiaire. Nous avons aussi montré que le couple Slit/Robo n'était pas essentiel à la migration des neurones précérébelleux. Ces données remettent en cause le modèle classiquement proposé et suggèrent l'existence de d'autres mécanismes moléculaires de guidage. / In all bilaterians, the connections linking the left and the right part of the central nervous system (CNS) are called the commissures. Understanding molecular mechanisms involved in the formation of these circuits is a major issue in developmental neurobiology. The guidance of commissural projections lay on two major couples of ligand- receptors: Netrin-1/DCC and Slits/Robos. Netrin-1 and Slits are expressed in the floor plate whereas their respective receptors, DCC and Robo1/2, are present in the neurons and commissural axons of the spinal cord and the hindbrain during the development. Analysis of mice deficient for these genes lead to establish a model: a Netrin-1 gradient would act through long distances in order to attract commissural axons to the ventral midline, then Slits would repulse axons outside the floor plate. During my thesis, I used genetic mouse models to study the setting of commissural axons and the migration of precerebellar neurons in vivo. We have specifically inactivated the expression of Netrin-1 Slits and Robo1/2 genes in different region of the CNS. We showed that floor plate-derived Netrin-1 was not necessary for the attraction of commissural axons and that the principal source of Netrin-1 was the radial glia. We also showed that the Slit/Robo couple was not essential for the migration of precerebellar neurons. These results reassess the model firstly provided and suggest the presence of other molecular mechanisms involved in commissural axon guidance.

RIC-8B é um fator trocador de nucleotídeo de guanina (GEF) predominantemente expresso em neurônios olfatórios maduros de camundongos adultos. Trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório mostraram que RIC-8B interage com Gαolf e Gγ13, duas subunidades de proteína G que estão enriquecidas nos cílios dos neurônios olfatórios, onde participam da transdução do sinal de odorantes. In vitro, RIC-8B é capaz de amplificar a sinalização de receptores olfatórios através de Gαolf, no entanto, seu papel fisiológico ainda é desconhecido. Para determinar a função desempenhada por essa proteína in vivo, nós utilizamos a tecnologia de Gene Trap com o objetivo de produzir um camundongo knockout para Ric-8B. Apesar de a expressão de Ric-8B ser restrita a poucos tecidos no camundongo adulto, descobrimos que homozigotos para a mutação em Ric-8B são inviáveis e morrem por volta do dia embrionário E10,5. Além disso, são menores e apresentam evidente falha no fechamento do tubo neural na região cranial (exencefalia). Utilizamos o gene repórter β-galactosidase expresso pelo alelo mutado para determinar o padrão de expressão de Ric-8B em embriões durante o desenvolvimento. Observamos que, no estágio E8,5, Ric-8B é expresso nas pregas neurais da região cefálica e na notocorda. De E9,5 a E12,5, a expressão de Ric-8B é detectada predominante no assoalho da placa. Esse padrão de expressão se assemelha ao de outro gene importante para a embriogênese, Sonic hedgehog (Shh). SHH é um morfógeno diretamente responsável pela padronização dorsoventral do sistema nervoso central e sua sinalização depende de cílio primário. Cílio primário é uma organela baseada em microtúbulos que se projeta da superfície da maioria das células de mamíferos e funciona como um centro de sinalização intracelular. Nossos dados mostram que fibroblastos embrionários Ric-8B-/- formam cílios primários, assim como alguns tecidos do embrião. Além disso, não encontramos alterações na sinalização de Shh em embriões homozigotos mutantes. No entanto, observamos que esses embriões apresentam apoptose aumentada em células migratórias da crista neural cranial. Shh é importante para a sobrevivência de células da crista neural migratória, sugerindo um possível papel para Ric-8B a downstream da sinalização de SHH. / Ric-8B is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) which is predominantly expressed in mature olfactory sensory neurons in adult mice. We have previously shown that RIC-8B interacts with both Gαolf and Gγ13, two G protein subunits, which are enriched in olfactory cilia and are required for odorant signal transduction. In vitro, RIC-8B is able to amplify odorant receptor signaling through Gαolf, however, its physiological role remains unknown. To determine the role played by RIC-8B in vivo we used the Gene trap technology to generate a Ric-8B knockout mouse. We found that, despite the limited distribution of Ric-8B gene expression in adult mice, Ric-8B homozygous mutants are not viable and die around the E10,5 stage. Mutant embryos are also smaller and fail to close the neural tube at the cranial region (exencephaly). We used the activity of the β-galactosidase reporter gene to determine the pattern of expression of the Ric-8B gene in heterozygous embryos. At E8,5 the Ric-8B gene is expressed in the notochord and neural folds of the cephalic regions. From E9,5 to E12,5 Ric-8B is predominantly expressed in the floor plate, in a pattern that strongly resembles the one shown by Sonic hedgehog (Shh). SHH is a morphogen directly responsible for the dorsoventral patterning of the central nervous system and its signaling depends on primary cilia. Primary cilia are microtubule-based organelles that protrude from the surface of mammalian cells and act as a signaling center. We show that Ric-8B-/- embryonic fibroblasts and some embryonic tissues grow primary cilia normally. In addition, we did not find alterations in the SHH signaling of homozygous mutants. Instead, we found an increased apopotosis in migratory cells of the cranial neural crest in these embryos. Shh is an important factor to survival of neural crest cells, suggesting a role for RIC-8B downstream of the SHH signaling.

Yes / A full-scale composite floor plate was tested to investigate the flexural behavior and in-plane effects of the floor slab in a grillage of composite beams that reduces the tendency for longitudinal splitting of the concrete slab along the line of the primary beams. This is important in cases where the steel decking is discontinuous when it is orientated parallel to the beams. In this case, it is important to demonstrate that the amount of transverse reinforcement required to transfer local forces from the shear connectors can be reduced relative to the requirements of Eurocode 4. The mechanism under study involved in-plane compression forces being developed in the slab due to the restraining action of the floor plate, which was held in position by the peripheral composite beams; while the secondary beams acted as transverse ties to resist the forces in the floor plate that would otherwise lead to splitting of the slab along the line of the primary beams. The tendency for cracking along the center line of the primary beam and at the peripheral beams was closely monitored. This is the first large floor plate test that has been carried out under laboratory conditions since the Cardington tests in the early 1990s, although those tests were not carried out to failure. This floor plate test was designed so that the longitudinal force transferred by the primary beams was relatively high (i.e., it was designed for full shear connection), but the transverse reinforcement was taken as the minimum of 0.2% of the concrete area. The test confirmed that the primary beams reached their plastic bending resistance despite the discontinuous decking and transverse reinforcement at the minimum percentage given in Eurocode 4. Based on this test, a reduction factor due to shear connectors at edge beams without U-bars is proposed.

Le laboratoire d’Embryologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires contrôlant le développement embryonnaire et utilise comme système expérimental l’embryon de xénope. En collaboration le laboratoire du Dr Daniel Christophe, nous avons abordé l’étude du gène XHRT1 chez le xénope. Ce gène est l’orthologue du gène HRT-1/Hey1/Hesr-1/HERP2/CHF2 de souris. Celui-ci, avec deux autres protéines apparentées (HRT2 et HRT3) forme une sous-famille de facteurs de transcription de type bHLH-O qui se différencient des autres facteurs bHLH-O par l’absence d’un motif carboxy-terminal de séquence « WRPW » et par la présence d’un nouveau motif carboxy-terminal conservé de séquence « TEI/VGAF ». Le rôle de ces facteurs HRT dans le développement est encore actuellement mal connu. Dans un premier temps, nous avons déterminé le profil d’expression de XHRT1 au cours de l’embryogenèse. Nous avons observé que ce gène est fortement exprimé au stade neurula dans le plancher du tube neural, et que plus tardivement celui-ci est exprimé dans différentes régions du système nerveux, dans les somites et le dans le pronéphros. Comme attendu pour un membre de la famille des facteurs bHLH-O, nous avons également observé que l’expression précoce de HRT1 au niveau du plancher du tube neural est bien régulée par la voie de signalisation Notch. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle et au mode d’action du facteur XHRT1 dans le développement du plancher du tube neural. Nous avons pu montrer que XHRT1 agit comme répresseur transcriptionnel et que cette répression nécessite la présence du domaine bHLH et de séquences en aval de celui-ci. Nous avons montré en embryon que la surexpression précoce de XHRT1 induit un blocage de l’expression des marqueurs du mésoderme et une augmentation de marqueur du plancher du tube neural, ce qui est en accord avec le modèle selon lequel la voie de signalisation Notch interviendrait dans le choix de la destinée des cellules de la région médiane en inhibant la différenciation des cellules en notocorde et en favorisant leur différenciation en cellules du plancher du tube neural. XHRT1 n’étant cependant activé qu’à partir du stade neurula, nous avons conclu que les effets observés n’étaient probablement pas dus à XHRT1 mais à un autre facteur bHLH-O apparenté exprimé plus précocement dans les cellules de la ligne mediane de l’embryon. Afin d’éviter ces effets non spécifiques précoces, nous avons utilisé un vecteur d’expression de XHRT1 permettant un contrôle temporel de l’activité de la protéine. Nous avons ainsi montré que l’activation de XHRT1 au stade neurula dans l’ectoderme inhibe la différenciation des cellules précurseurs neurales en neurones et qu’il pourrait ainsi jouer un rôle important dans le développement du plancher du tube neural. Nos résultats ont montré également que XHRT1 est capable d’homo- et hétérodimériser in vivo avec les facteurs Xhairy1 et Xhairy2b coexprimés avec XHRT1 dans le plancher du tube neural. Enfin, nous avons montré que les propriétés de dimérisation de XHRT1 sont dépendantes non seulement du domaine bHLH, mais aussi du domaine Orange et des séquences situées en aval, séquences jouant un rôle important dans le choix du partenaire. Des travaux récents ayant montré que la voie de signalisation Notch joue un rôle important dans le développement du rein, nous avons voulu déterminer l’importance de XHRT1 dans le développement du pronéphros. Nos résultats ont montré que XHRT1 ainsi que d’autres facteurs bHLH-O sont exprimés de manière dynamique, d’abord dans le glomus puis dans la partie dorso-antérieure de l’ébauche du pronéphros à l’origine des tubules proximaux, et que leur expression est régulée positivement par Notch. La surexpression de XHRT1 à la fin de la neurulation inhibe la formation du canal et du tubule distal, tandis que l’inhibition de la traduction de la protéine entraîne une réduction de l’expression de marqueurs spécifiques des tubules proximaux et du glomus. Ces résultats démontrent que XHRT1 joue un rôle important comme médiateur de la voie de signalisation Notch dans le pronéphros.

Le laboratoire d’Embryologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires contrôlant le développement embryonnaire et utilise comme système expérimental l’embryon de xénope. En collaboration le laboratoire du Dr Daniel Christophe, nous avons abordé l’étude du gène XHRT1 chez le xénope. Ce gène est l’orthologue du gène HRT-1/Hey1/Hesr-1/HERP2/CHF2 de souris. Celui-ci, avec deux autres protéines apparentées (HRT2 et HRT3) forme une sous-famille de facteurs de transcription de type bHLH-O qui se différencient des autres facteurs bHLH-O par l’absence d’un motif carboxy-terminal de séquence « WRPW » et par la présence d’un nouveau motif carboxy-terminal conservé de séquence « TEI/VGAF ». Le rôle de ces facteurs HRT dans le développement est encore actuellement mal connu. <p>Dans un premier temps, nous avons déterminé le profil d’expression de XHRT1 au cours de l’embryogenèse. Nous avons observé que ce gène est fortement exprimé au stade neurula dans le plancher du tube neural, et que plus tardivement celui-ci est exprimé dans différentes régions du système nerveux, dans les somites et le dans le pronéphros. Comme attendu pour un membre de la famille des facteurs bHLH-O, nous avons également observé que l’expression précoce de HRT1 au niveau du plancher du tube neural est bien régulée par la voie de signalisation Notch.<p>Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle et au mode d’action du facteur XHRT1 dans le développement du plancher du tube neural. Nous avons pu montrer que XHRT1 agit comme répresseur transcriptionnel et que cette répression nécessite la présence du domaine bHLH et de séquences en aval de celui-ci. Nous avons montré en embryon que la surexpression précoce de XHRT1 induit un blocage de l’expression des marqueurs du mésoderme et une augmentation de marqueur du plancher du tube neural, ce qui est en accord avec le modèle selon lequel la voie de signalisation Notch interviendrait dans le choix de la destinée des cellules de la région médiane en inhibant la différenciation des cellules en notocorde et en favorisant leur différenciation en cellules du plancher du tube neural. XHRT1 n’étant cependant activé qu’à partir du stade neurula, nous avons conclu que les effets observés n’étaient probablement pas dus à XHRT1 mais à un autre facteur bHLH-O apparenté exprimé plus précocement dans les cellules de la ligne mediane de l’embryon. Afin d’éviter ces effets non spécifiques précoces, nous avons utilisé un vecteur d’expression de XHRT1 permettant un contrôle temporel de l’activité de la protéine. Nous avons ainsi montré que l’activation de XHRT1 au stade neurula dans l’ectoderme inhibe la différenciation des cellules précurseurs neurales en neurones et qu’il pourrait ainsi jouer un rôle important dans le développement du plancher du tube neural. Nos résultats ont montré également que XHRT1 est capable d’homo- et hétérodimériser in vivo avec les facteurs Xhairy1 et Xhairy2b coexprimés avec XHRT1 dans le plancher du tube neural. Enfin, nous avons montré que les propriétés de dimérisation de XHRT1 sont dépendantes non seulement du domaine bHLH, mais aussi du domaine Orange et des séquences situées en aval, séquences jouant un rôle important dans le choix du partenaire.<p>Des travaux récents ayant montré que la voie de signalisation Notch joue un rôle important dans le développement du rein, nous avons voulu déterminer l’importance de XHRT1 dans le développement du pronéphros. Nos résultats ont montré que XHRT1 ainsi que d’autres facteurs bHLH-O sont exprimés de manière dynamique, d’abord dans le glomus puis dans la partie dorso-antérieure de l’ébauche du pronéphros à l’origine des tubules proximaux, et que leur expression est régulée positivement par Notch. La surexpression de XHRT1 à la fin de la neurulation inhibe la formation du canal et du tubule distal, tandis que l’inhibition de la traduction de la protéine entraîne une réduction de l’expression de marqueurs spécifiques des tubules proximaux et du glomus. Ces résultats démontrent que XHRT1 joue un rôle important comme médiateur de la voie de signalisation Notch dans le pronéphros. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished