Depuis des décennies, les antibiotiques sont utilisés dans l'industrie avicole, non seulement pour la prévention et la lutte contre les infections bactériennes, mais aussi pour favoriser la croissance animale. Cependant, une pression sélective due à la surutilisation et à la mauvaise utilisation des antibiotiques contribue au développement de la résistance des bactéries aux antibiotiques, ce qui constitue une menace croissante pour la santé publique mondiale. Par conséquent, la production de poulets de chair sans antibiotiques est de plus en plus populaire dans le monde en raison aussi de la demande des consommateurs et il est nécessaire de développer des alternatives potentielles aux antibiotiques à utiliser dans le secteur de la volaille. De nombreux défis doivent être surmontés dans la production de poulets de chair sans antibiotiques et plusieurs études ont été menées pour rechercher des agents naturels aux effets bénéfiques. L'objectif général de cette thèse est d'étudier le potentiel des antimicrobiens d'origine bactérienne, à savoir la reutérine, la microcine J25 et l'acide lactique, comme alternatives aux antibiotiques à utiliser dans l'industrie de l'élevage du poulet. Le premier objectif spécifique était d'isoler et de caractériser les souches de Lactobacillus reuteri du tractus intestinal des poulets de chair. Au total, 800 souches bactériennes ont été isolées à partir de poulets de chair et examinées pour leur capacité à produire de la reutérine. Trois souches, à savoir L. reuteri C1-8, L. reuteri C1-14 et L. reuteri C1-18 ont été identifiées et ont montré une large gamme de spectre inhibiteur. L. reuteri C1-14 a présenté l'activité inhibitrice la plus élevée après 1 h de fermentation anaérobie dans la solution de glycérol. Les trois L. reuteri ont survécu à une condition simulée de l'estomac et en présence de suc intestinal. L. reuteri C1-14 a montré une sensibilité à la plupart des antibiotiques cliniquement importants. Sur la base de tous les critères considérés, L. reuteri C1-14 a été sélectionnée comme la souche la plus prometteuse à utiliser comme probiotique dans l'industrie avicole. Dans le deuxième objectif spécifique de cette thèse, différents composés antimicrobiens d'origine bactérienne, à savoir la reutérine, la microcine J25 et l'acide lactique, ont été évalués seuls ou en combinaison pour leur activité antimicrobienne. En utilisant le test en damier de microdilution, les combinaisons reutérine + acide lactique et reutérine + microcine J25 ont montré un effet synergique, rendant ces composés efficaces à des concentrations 4 fois inférieures à celles utilisées seules. Pulvérisé sur des carcasses de poulet réfrigérées, le mélange reutérine + acide lactique a réduit les comptes de Salmonella spp. de 2.02 log CFU/g, tandis que la reutérine + microcine J25 et l'acide peracétique ont induit une réduction de 0.83 et 1.13 log CFU/g, respectivement. Appliqués en pulvérisation après refroidissement, ces mélanges pourraient contribuer à la salubrité des aliments en diminuant le nombre de Salmonella sur les carcasses de poulet. Dans le troisième objectif spécifique, l'efficacité de deux consortia synergiques contenant de la reutérine (5 mM) et de l'acide lactique (0.78% v/v) ou de la microcine J25 (0.08 µM) sur le microbiote et les attributs sensoriels des cuisses de poulet crues ont été évaluées. Sur la base des numérations viables totales, la combinaison de reutérine et d'acide lactique ou de microcine J25 a ralenti la croissance du microbiote d'altération, prolongeant ainsi la durée de conservation de 2 à 3 jours. Des baisses significatives de la qualité sensorielle (y compris l'odeur, la couleur et l'apparence générale) se sont produites dans le groupe non traité, tandis que de légers changements sont survenus dans les groupes de consortia au cours de la même période. La reutérine combinée à l'acide lactique ou à la microcine J25 semble fournir une approche prometteuse pour contrôler la croissance des microorganismes d'altération dans la viande de poulet. Enfin, le dernier objectif spécifique était dédié à l'évaluation des effets de la reutérine + microcine J25 et L. reuteri dans l'eau potable sur les performances de croissance, le microbiote intestinal et les profils de métabolites microbiens chez les poulets de chair. Les résultats ont montré que les oiseaux recevant un antibiotique et 5 mM de reutérine + 0.08 µM de microcine J25 présentaient un gain de poids corporel plus important (environ 6.19% et 4.56%, respectivement) que le traitement témoin négatif (P <0,05), tandis que la supplémentation de L. reuteri n'a pas eu d'effet significatif sur les performances de croissance des poulets de chair. L'influence sur la structure globale des communautés bactériennes par la reutérine + microcine J25 était similaire à un traitement antibiotique. Pour les métabolites microbiens, la supplémentation en reutérine + microcine J25 a eu un effet positif sur les concentrations d'acides gras à chaîne courte dans les caeca, ce qui n'a pas été observé pour les groupes témoins. En résumé, ces résultats fournissent la preuve que la supplémentation en reutérine + microcine J25 peut probablement favoriser un environnement intestinal favorable à l'hôte en modifiant la composition microbienne et les métabolites, ce qui a eu un effet positif sur les performances de croissance et un grand potentiel comme alternative antibiotique efficace pour la production de poulets de chair. / For decades, antibiotics have been used in the poultry industry, not only for the prevention and treatment of bacterial infections, but also for promoting animal growth. However, a selective pressure by overuse and misuse of antibiotics contributes to the development of antibiotic resistance, posing a rising global public health threat. Therefore, antibiotic-free broiler chicken production is becoming increasingly popular worldwide due to consumers' demand and there is need to develop potential alternatives to antibiotics for use in the poultry sector. Numerous challenges need to be overcome in producing antibiotic-free broilers. Many studies have been carried out to look for natural agents with beneficial effects. The general objective of this thesis is to investigate the potential of bacterial-derived antimicrobials, namely reuterin, microcin J25 and lactic acid as alternatives to antibiotics for use in the broiler chicken industry. The first specific objective was to isolate and characterize Lactobacillus reuteri strains from the intestinal tract of broiler chickens. A total of 800 bacterial strains were isolated from broilers and screened for reuterin-producing ability. Three strains, namely L. reuteri C1-8, L. reuteri C1-14 and L. reuteri C1-18 were identified and shown to display a wide range of inhibitory spectrum. L. reuteri C1-14 exhibited the highest inhibitory activity after 1 h of anaerobic fermentation in a glycerol solution. All three L. reuteri survived simulated stomach and intestinal juice conditions. L. reuteri C1-14 showed susceptibilities to most clinically important antibiotics. Based on all criteria considered, L. reuteri C1-14 was selected as the most promising strain to be used as a probiotic in the poultry industry. For the second specific objective of this thesis, different bacterial-derived antimicrobial compounds, namely reuterin, microcin J25 and lactic acid, were evaluated alone or in combination, for their antimicrobial activity. Using the microdilution checkerboard assay, the combinations reuterin + lactic acid and reuterin + microcin J25 showed a synergic effect, making these compounds effective at concentrations 4 times lower than that used alone. Sprayed onto chilled chicken carcasses, reuterin + lactic acid mixture reduced Salmonella spp. counts by 2.02 Log CFU/g, whereas reuterin + microcin J25 and peracetic acid induced 0.83 and 1.13 Log CFU/g reductions, respectively. Applied as a post-chill spray, these mixtures could contribute to improve the food safety of poultry products by decreasing Salmonella counts on chicken carcasses. In the third specific objective, the efficacy of two synergetic consortia containing reuterin (5 mM) and lactic acid (0.78% v/v) or microcin J25 (0.08 µM) on microbiota and sensory attributes of raw chicken legs were evaluated. Based on total viable counts, the combination of reuterin and lactic acid or microcin J25 slowed down the growth of spoilage microbiota, thereby extending the shelf life of 2 to 3 days. Significant drops in sensory quality (including odor, color and overall appearance) occurred in the nontreated group, while slight changes occurred in the consortia groups over the same period. Reuterin combined with lactic acid or microcin J25 seems to provide a promising approach to control the growth of spoilage microorganisms on chicken meat. Finally, the last specific objective was dedicated to the evaluation of the effects of reuterin + microcin J25 and L. reuteri in drinking water on growth performance, intestinal microbiota and microbial metabolite profiles in broiler chickens. The results showed that birds received antibiotic and 5 mM reuterin + 0.08 µM microcin J25 exhibited greater body weight gain (about 6.19% and 4.56%, respectively) than negative control treatment (P < 0.05), while supplementing L. reuteri did not significantly affect broiler growth performance. The influence on the overall structure of bacterial communities by reuterin + microcin J25 was similar to antibiotic treatment. For microbial metabolites, supplementation with reuterin + microcin J25 positively affected the short chain fatty acids concentrations in the caeca than did the control groups. In summary, these results provide evidence that supplementation with reuterin + microcin J25 can likely improve the intestinal environment by changing microbial composition and metabolites, which had a positive effect on the growth performance and great potential as an efficient antibiotic alternative for broiler chicken production.

L'infection microbienne est une des causes des maladies menaçant la vie. Elle est conventionnellement traitée par des antibiotiques. Cette pratique a entraîné l'émergence de la résistance aux antimicrobiens (RAM), qui est associée à un taux de mortalité croissant. Afin de contrer le problème, les cellules microbiennes doivent être retirées de la zone de cible sans que l’agent microbienne libère des sous-produits. Les désinfectants, tels que l'eau de Javel et le chlore, tout en étant très efficace à large spectre antimicrobien, ne conviennent pas dans certaines circonstances. Ces composés sont chimiquement réactifs, ils peuvent donc corroder les surfaces en contact et laisser des composés toxiques. D'autre part, les antibiotiques conventionnels, bien qu'ils ne présentent pas ces propriétés indésirables de désinfectants, ont généralement un spectre d'action plus étroit et sont plus sujets au développement du RAM. Entre les désinfectants et les antibiotiques, il existe des composés à base d'argent qui, tout en ayant une activité antimicrobienne à large spectre, sont relativement sans danger pour les cellules de mammifères. Le mécanisme de l'action antimicrobienne des composés d’argent classiques est basé sur la libération d'ions argent dans le milieu. L'argent est un métal coûteux et se dégrade en libérant des ions. De plus, l'exposition à des niveaux élevés d'ions d'argent est un danger pour la santé et l'environnement et donc doit être évitée. Par conséquent, incorporer étroitement des atomes d'argent dans une structure moléculaire résistante à la corrosion, tout en gardant l'activité antimicrobienne, permettrait d'utiliser l'argent comme agent antimicrobien dans des applications exigeant un composé d'argent résistant à la corrosion avec de faibles niveaux de libération d'argent dans l'environnement. Pour atteindre cet objectif, un nouveau composé d'argent, AgNbO3, a été synthétisé et caractérisé en termes de taille, de morphologie, de comportement de sédimentation, de corrosion et d'activité antimicrobienne. Il a été démontré que tout en ayant un taux de libération d'argent diminué de plus de 150 fois par rapport aux particules Ag2O de référence, l'activité antimicrobienne des nanoparticules AgNbO3, quantifiée par la concentration minimale inhibitrice (MIC), était similaire dans le cas des milieux aqueux. L'étude du mécanisme d'action a indiqué que le composé exerce son action antimicrobienne par contact avec des cellules microbiennes. / Microbial infections are the main causes of life threatening diseases and are conventionally treated by antibiotic agents. This practice has resulted in the emergence of antimicrobial resistance (AMR), which is associated with ever-increasing rate of mortality. In order to counter the issue, the microbial cells should be removed from targeted areas without releasing toxic byproducts behind. Disinfectants, such as bleach and chlorine, while being very effective broad-spectrum antimicrobial, are not suitable in some circumstances. These compounds are chemically reactive; thus, they can corrode the surfaces in contact and can leave behind toxic compounds particularly in reaction with organic matter. On the other hand, the conventional antibiotics, while not having these undesired properties of disinfectants, have generally narrower spectrum of action and are more prone to the development of AMR. In between of disinfectants and antibiotics there are silver-based compounds, which while having broad-spectrum antimicrobial activity, are relatively safe to mammalian cells. There are, however, some challenges associated with the usage of the conventional silver compounds as antimicrobial agent, arising from the mechanism of antimicrobial action through the release of silver ions to the medium. Silver is an expensive metal and degrades in while releasing ions. Moreover, exposure to high levels of silver ions is a health an environmental hazard and should be avoided. Therefore, tightly incorporating silver atoms in a corrosion-resistant molecular level structure with keeping the antimicrobial activity would enable feasibility of using silver as an antimicrobial agent in applications that require corrosion resistant silver compound with low levels of silver release to the environment. To achieve this goal, a new silver compound, AgNbO3, was synthesized and characterized in terms of its size, morphology, sedimentation behavior, corrosion, and antimicrobial activity. It was demonstrated that while having a diminished silver release rate of more than 150 fold compared to the reference Ag2O particles, the antimicrobial activity of AgNbO3 nanoparticles, quantified by minimum inhibitory concentration (MIC), was similar in the case of aqueous media. Investigating the mechanism of action indicated that the compound exerts its antimicrobial action via contact with microbial cells.

Thèse de doctorat : Neurosciences : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 47 p.

Les progrès rapides en microbiologie alimentaire et en recherche d'antimicrobiens ont contribué à façonner le paradigme de l'industrie alimentaire depuis plus d'un siècle. Cependant, face à l'évolution des préférences alimentaires des consommateurs pour des produits naturels et au renforcement des lois sur la salubrité des aliments, la conservation des aliments continue d'être un défi de taille et l'exploration d'antimicrobiens naturels pour la conservation des aliments est plus que jamais au cœur des préoccupations. L'identification de composés antimicrobiens d'origine végétale (PDACs) vise à élargir le spectre de l'activité antimicrobienne par rapport à celui des agents de conservation existants. Malgré un grand nombre d'études sur l'activité antimicrobienne des sous-produits d'origine végétale et leur potentiel en tant que substituants potentiels aux antimicrobiens alimentaires chimiques, des obstacles conceptuels clés restent à surmonter. Par exemple, les études actuelles portent principalement sur le mécanisme d'administration des composés bioactifs et par conséquent, demeure une preuve de concept plutôt que d'être accepté par l'industrie alimentaire dans son ensemble. De plus, l'activité antimicrobienne de la plupart des composés antimicrobiens d'origine végétale est faible et souvent très variable selon le microsystème alimentaire. Le problème de variabilité de l'efficacité des antimicrobiens naturels d'origine végétale entre les études in vitro et in vivo restent un sujet de discussion. Les processus et les techniques désignés pour améliorer l'activité antimicrobienne des antimicrobiens naturels sont spécifiques et, au mieux, applicables aux produits de niche. En outre, les approches assistées par microorganismes, bien que prometteuses, sont pour la plupart des approches top-down, dont l'applicabilité et la modularité du printest la relation structure-activité. Il est plausible que l'amélioration de la puissance des antimicrobiens d'origine végétale puisse augmenter leur activité et les rendre comparables aux antimicrobiens synthétiques existants utilisés dans l'industrie alimentaire. L'objectif global de cette thèse était d'améliorer le pouvoir antimicrobien d'extraits de plantes grâce à un processus biochimique durable tel que la fermentation. Les objectifs spécifiques comprenaient la sélection de bactéries lactiques adaptées grâce à l'évolution adaptative en laboratoire (ALE) et la comparaison de leurs paramètres de croissance et indicateurs métaboliques à ceux de bactéries lactiques non adaptées. Ensuite, l'activité antimicrobienne des extraits aqueux de plantes a été quantifiée et comparée à des extraits de plantes fermentés avec des bactéries lactiques non adaptées et adaptées. Enfin, une analyse UPLC-QTOF-ESI-MS d'extraits de plantes fermentées a été effectuée pour identifier les composés antimicrobiens potentiels. Dans la première partie de cette étude, un milieu YED constitué de 0,9 % p/v d'extrait de levure et 0,5 % p/v de dextrose a été développé pour remplacer le milieu De Man, Rogosa and Sharpe (MRS). Le milieu YED additionné d'un extrait aqueux de plante (peau de grenade, POM ou extrait d'olive, OL), a été utilisé pour adapter L. plantarum et L. reuteri afin de permettre une survie et un développement des bactéries malgré des teneurs inhibitrices en composés phytochimiques. Les bactéries L. plantarum et L. reuteri adaptées ont montré, comparativement à leurs homologues non adaptées, un potentiel métabolique et une vitalité améliorée. Les bactéries lactiques adaptées ont réduit le pH du milieu plus significativement et accumulé relativement plus d'acides dans le milieu (acidité titrable, g.L⁻¹ d'acide lactique) que les bactéries non adaptées. Pour finir, les bactéries lactiques non adaptées ont performé également mieux que les bactéries non adaptées sur tous les indicateurs (constante de vitesse de croissance (μ, h⁻¹), constante d'interaction (K), taux de croissance dans le milieu (n) et population microbienne totale) de cette étude. Suite à l'adaptation réussie, l'effet de l'ALE sur le métabolisme de L. plantarum et L. reuteri a été évalué. Le changement de 'fitness' du microorganisme affecte l'énergie et le stress métabolique. ALE a permis la sélection de souches relativement plus résistantes aux composés phytochimiques présents dans le milieu de croissance. Le métabolisme des bactéries lactiques adaptées était significativement différent de celui des bactéries lactiques non adaptées. Les bactéries lactiques adaptées ont accumulé des concentrations significativement plus élevées en acides aminés à chaîne basique et ramifiée que les bactéries lactiques non adaptées. Une tendance similaire a été observée pour les acides lactique et pyruvique. Plus de malate et de citrate ont été consommés par les bactéries lactiques adaptées, suggérant un changement considérable du métabolisme énergétique sous stress. Les extraits végétaux fermentés avec les bactéries lactiques adaptées avaient significativement plus de proanthocyanidin monomériques et oligomériques et une teneur en polyphénols plus élevée. La consommation plus élevée en glucides par les bactéries lactiques adaptées suggère également que l'adaptation peut avoir un rôle à jouer dans la survie et le métabolisme énergétique sous la contrainte. Enfin, les bactéries lactiques adaptées étaient plus résistantes au chloramphénicol, à la tétracycline et à l'érythromycine que les bactéries lactiques non adaptées. Globalement, les bactéries lactiques adaptées pourraient être différenciées des bactéries lactiques non adaptées par leur activité métabolique (acides aminés libres et acides organiques), leur catabolisme (degré de polymérisation et polyphénols totaux) et leur réponse phénotypique (métabolisme des sucres et sensibilité aux antibiotiques), faisant allusion à la possibilité d'une mémoire de réponse au stress hystérétique. Pour le troisième objectif, quinze extraits de plantes ont été fermentés avec les bactéries lactiques adaptées et leur activité antimicrobienne comparée aux extraits non fermentés (contrôle) et fermentés avec les bactéries lactiques non adaptées. Les paramètres critiques de fermentation tels que le type d'extrait de plante, la souche de fermentation (bactéries lactiques adaptées, bactéries lactiques non adaptées, non fermenté (contrôle)), la durée de fermentation (24, 48 et 96 heures) et la souche d'essai ont été étudiés. L'activité antimicrobienne d'extraits fermentés avec des bactéries lactiques adaptées a également été comparée à celle des extraits non fermentés modifiés avec du surnageant sans cellules (CFS) de bactéries lactiques adaptées cultivées en milieu YED. L'activité bactéricide des extraits fermentés a été analysée avec une version modifiée du test time-kill contre E. coli ATCC 25922 et B. subtilis ATCC 6633. Le choix de souche de fermentation suivi du type d'extraits de plantes a eu l'effet le plus significatif sur la valeur de destruction (réduction logarithmique de la population des souches d'essai). Les résultats pour 24 heures d'exposition contre E. coli et B. subtilis ont montré que les extraits de résidus de cassis, de jus de noni et de yerba mate ont été les plus bénéfiques avec une fermentation avec des bactéries lactiques adaptées. Pour 12 et 6 heures d'exposition à 10 mg/ml les extraits fermentés avec des bactéries lactiques adaptées ont été significativement plus efficaces que les extraits de plantes non fermentés et fermentés avec des bactéries lactiques non adaptées. Il était à noter que, contrairement à la plupart des PDACs, les extraits fermentés avec des bactéries lactiques adaptées étaient tout aussi efficaces contre les deux souches à l'essai à de faibles concentrations suggérant une potentielle activité à large spectre. L'amélioration significative de l'activité des extraits de plantes fermentés par des bactéries lactiques adaptées contre les souches E. coli et B. subtilis a justifié d'autres tests antimicrobiens. Ainsi pour le quatrième objectif, l'effet de la fermentation (témoin non fermenté vs non adaptées (L. plantarum et L. reuteri)), de la souche de fermentation (non adaptée vs adaptée (OL-AD et POM-AD) et de la durée d'exposition (24 h et 12 h) a été évalué. Les extraits de noni et de yerba mate fermentés avec les bactéries lactiques adaptées ont présenté l'augmentation la plus significative de l'activité bactéricide. Les extraits de plantes fermentés ont montré une activité antimicrobienne significativement meilleure (p <0,05) que les témoins non fermentés pour une durée d'exposition de 24 h. Pour la durée d'exposition réduite (12 h), les extraits fermentés avec des bactéries lactiques adaptées ont affiché des valeurs de mortalité considérablement plus élevées (réduction logarithmique de la population de la souche d'essai) que les extraits fermentés avec les bactéries lactiques non adaptées. Les classes Gram-positif et Gram-négatif étaient également sensibles et une augmentation de la sensibilité des souches Gram-négatif aux extraits fermentés par des bactéries lactiques adaptées a été observée. La teneur en proanthocyanidin des extraits n'a pas changé de façon significative après fermentation, bien que les concentrations en flavon-3-ols monomériques et les proportions de dimères et trimères (de la fraction flavon-3-ols oligomériques) étaient plus élevées pour la plupart des extraits fermentés par les bactéries lactiques adaptées. La concentration en polyphénols totaux pour les extraits fermentés était également plus élevée après fermentation. Suite à l'amélioration réussie de l'activité des PDACs, une caractérisation préliminaire de huit extraits de plantes par UPLC - ESI - QTOF - MS a été effectuée pour détecter et identifier d'éventuels composés antimicrobiens. Les traitements des chromatogrammes et l'identification des composés se sont faites avec le logiciel MZmine, les résultats ont été exprimés par rapport au témoin non fermenté en mettant l'accent sur l'impact de la fermentation (fermenté vs non fermenté) et de l'inoculation (adaptée vs non adaptée). Plusieurs composés ont été identifiés et détectés (coumaric acid, 5-O-galloylquinic acid, gallic acid, ellagic acid, 6-geranylnaringenin, lactucin, R-catechol, pinosylvin, rutin, cinnamtannin-A2, 4-hydroxybenzaldehyd), suggérant un impact perceptible de la fermentation et de l'adaptation. Les composés antibactériens étaient présents en forte abondance dans les extraits fermentés avec des bactéries lactiques adaptées (par rapport au témoin non fermenté). Enfin, de nombreux composés ont été détectés mais n'ont pas été identifiés et il est possible que certains de ces composés aient une activité antimicrobienne. L'activité antimicrobienne est limitée par la composition biochimique inhérente des composés et leur interaction avec l'environnement immédiat. L'activité antimicrobienne globale peut être due à une activité individuelle, une synergie ou un antagonisme avec d'autres composés. Les travaux présentés ici fournissent une approche combinant le potentiel de la fermentation en tant que processus de biotransformation et l'évolution adaptative en laboratoire pour améliorer la puissance des composés antimicrobiens d'origine végétale.

Développé dans le contexte mondial de lutte aux souches microbiennes résistantes aux antibiotiques, ce projet de maîtrise a pour but d’isoler et de caractériser un opéron de synthèse d’une molécule naturelle potentiellement bioactive, un tétramate polycyclique macrolactame (PTM), provenant d’une souche de streptomycète peu caractérisée mais dont le génome a été récemment séquencé. L’objectif principal est de transférer l’opéron dans une souche spécialisée de Escherichia coli pour son expression et sa caractérisation. Nous avons observé que la souche d’intérêt, Streptomyces fulvissimus ATCC27431 / DSM40593, produisait effectivement une molécule capable d’inhiber la croissance d’une levure. Nous n’avons cependant pas été en mesure de réaliser l’isolation et le transfert hétérologue de l’opéron, malgré l’utilisation de trois approches différentes. La première approche consistait à obtenir directement les gènes de l’opéron via une amplification PCR à partir d’ADN génomique de S. fulvissimus. La seconde approche comportait l’assemblage de gènes synthétisés chimiquement pour reconstituer l’opéron sur deux plasmides. La dernière approche impliquait la création puis le criblage d’une librairie d’ADN génomique de S.fulvissimus basée sur le fosmide pCC1FOS dans l’hôte E. coli. Les résultats inattendus issus du séquençage de quelques fosmides ont justifié le séquençage complet de l’ADN génomique de la souche ATCC 27431 / DSM 40593. Les contigs obtenus montrent que notre souche diffère de la souche de S. fulvissimus dont le génome a été publié, ce qui suggère que le génome publié a été incorrectement associé à cette souche. Nos résultats montrent également que l’opéron de biosynthèse du PTM n’est pas présent, en tout ou en partie, dans ces contigs et que ces derniers ne s’alignent pas parfaitement avec l’ADN d’aucune souche connue de streptomycète, ce qui implique que nous avons séquencé, pour la première fois, l’ADN de cette souche de S. fulvissimus. L’analyse bio-informatique des contigs nous a permis de mettre en évidence chez cette bactérie des voies de biosynthèse de molécules naturelles potentiellement bioactives qui pourraient être d’intérêt pour des études futures. / In the context of the worldwide fight against drug-resistant microbes, this project aims to isolate and characterize a putative gene cluster for the synthesis of a bioactive molecule, a polycyclic tetramate macrolactam (PTM), from a poorly characterized but recently sequenced strain of Streptomyces1 . The main goal is to transfer the gene cluster in a specialised strain of Escherichia coli for its expression and characterization. We observed that the strain of interest, identified as Streptomyces fulvissimus DSM 40593 / ATCC 27431, indeed synthesized a molecule capable of inhibiting the growth of yeast. However, we have not been able to isolate or transfer the gene cluster even though we employed three different strategies. The first strategy involved PCR amplification of the gene cluster directly from S. fulvissimus’ genomic DNA. The second strategy involved the chemical synthesis and enzymatic assembly of the gene cluster on two plasmids. The final strategy involved the construction and screening of a S. fulvissimus genomic DNA library with the pCC1FOS fosmid in the E. coli host. DNA sequencing of a few fosmids generated unexpected results and justified the sequencing of the complete genome of Streptomyces fulvissimus ATCC 27431 / DSM 40593. The assembled DNA contigs differed from the sequence of the Streptomyces strain whose genome was previously published and suggest that the latter was probably mislabeled. Our contigs show that the PTM biosynthetic gene cluster is absent from our strain’s genome, and they do not align perfectly with the sequence of any published genome, which suggests that we sequenced the genome of the S. fulvimissus strain ATCC 27431 / DSM 40593 for the first time. Bioinformatics analysis allowed the detection of genes potentially involved in the biosynthesis of bioactive molecules that could be of interest in future studies.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2007. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 113-121.

Plusieurs études ont rapporté l'activité antimicrobienne et anti-oxydante d'extraits de sous-produits végétaux. Le recours à l'utilisation de ces extraits dans les produits alimentaires pourrait constituer une stratégie innovante et prometteuse. Les résidus de fruits et légumes peuvent être une source potentielle de composés bioactifs. L'enjeu de cette étude était d'initier des recherches qui pourront aboutir au développement d'agents anti-oxydants-antimicrobiens à partir des sous-produits végétaux destinés à la conservation des aliments, comme une alternative aux produits chimiques synthétiques. L'étude initiale a été d'identifier des extraits de fruits et légumes qui possèdent à la fois de grandes propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes. Enfin, des moyens simples pour augmenter l'activité antimicrobienne de ces extraits ont été étudiés. Environ 160 extraits aqueux de sous-produits de fruits et légumes ont été criblés pour évaluer leur potentiel antimicrobien et anti-oxydant. L'activité antimicrobienne a été déterminée par l'inhibition de la croissance d'Escherichi coli et de Bacillus subtilis. L'activité anti-oxydante a été mise évidence par le test au DPPH (2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl). L'étude a conduit à l'identification des extraits présentant à la fois un potentiel antimicrobien et des propriétés anti-oxydantes. Les propriétés bioactives des extraits sont influencées par le pH de l'extrait, le type de tissu (fruits, feuilles et racines) et le type physiologique des fruits (climactérique). Les résultats ont montré l'existence d'une relation entre les propriétés anti-oxydantes et antimicrobiennes des extraits de plantes. De ce fait, l'indice anti-oxydant-antimicrobien développé pourrait être utile dans le choix des sources végétales bioactives. Les extraits de plantes aux propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes présentent un potentiel comme agent de conservation sécuritaire, bénéfique pour la santé et économique. La considération de la vitesse de piégeage des radicaux (facteur du temps) pour définir l'efficacité réelle (capacité) du système anti-oxydant a été considérée comme la meilleure manière d'exprimer avec plus de fiabilité le pouvoir anti-oxydant réel. La nouvelle expression, le pouvoir antiradicalaire - ARP, produite à partir du test DPPH, peut être plus utile pour identifier l'activité anti-oxydante des échantillons biologiques. Certains échantillons présentaient une valeur ARP élevée tels que les extraits de rambutan, feuille de canneberge, feuille de bleuet, feuille de vigne (sauvage), feuille de framboise, feuille de bétel, avocat, grenade et cherimoya. Les extraits de feuilles possèdent, en général, une valeur d'ARP supérieure à celle des fruits tandis que, les extraits de racines présentent les plus faibles ARP. De plus, cette étude montre également que le nombre moyen d'oxydation du carbone de mélanges complexes tels que des extraits de plantes peut prédire leur pouvoir anti-oxydant, en dépit de la disparité entre les tissus de feuilles et de fruits. Le spectre d'activité anti-radicalaire d'extraits sélectionnés a été exploré. L'activité anti-oxydante a été évaluée par différentes méthodes incluant, capacité anti-oxydante équivalente de Trolox (TEAC), essai de radicaux libres (DPPH), test du pouvoir réducteur d'ion ferrique (FRAP), mesure du potentiel d'oxydoréduction, réduction du peroxyde d'hydrogène, du radical hydroxyle, d'anion superoxyde, d'oxyde nitrique et de l'activité de chélation du fer. Les teneurs totales en composés phénoliques (TPC) et en flavonoïdes (TFC) des extraits ont également été déterminées. Les extraits de feuille de bétel, fruit de bleuet, feuille de cassis, feuille de canneberge ont montré une bonne activité de piégeage des radicaux (essai TEAC); ceux de pomme, oseille, vigne rouge et racine de pissenlit étaient efficaces contre SOA; ceux de feuilles de canneberge, feuille de bleuet, cassis et romarin contre le radical hydroxyle; ceux de bette à carde, panais, brocoli et orange contre H2O2; et ceux de pomme de terre, banane, oseille, feuille d'argousier contre l'oxyde nitrique. Les extraits de feuille et fruit de bleuet, grenade, cassis et feuille de bétel ont montré un bon pouvoir réducteur d'ion ferrique. Les extraits possédant la capacité élevée de chélation du fer étaient: feuille d'argousier, radis, panais, feuille de bétel et mangoustan. L'extrait de feuille de bétel présentait des activités élevées, y compris de fixation du fer et de piégeage de divers radicaux, à l'exception de l'oxyde nitrique, où l'activité était néanmoins modérée. Les essais de TEAC, de DPPH et de FRAP fournissent essentiellement la même réponse concernant l'activité anti-oxydante des extraits de plantes, ce qui suggère que l'un de ces essais serait suffisant pour évaluer leur capacité anti-radicalaire. / Cette étude suggère également que l'activité anti-oxydante d'une substance, déterminée par un ou plusieurs essais, ne donne pas une image complète de son efficacité contre les diverses espèces de radicaux oxygénés; et elle montre que la détermination du spectre de l'activité anti-radicalaire serait nécessaire. L'activité antimicrobienne des extraits de plantes sélectionnés a été évaluée en détail par turbidimétrie en milieu liquide et par diffusion en milieu solide (gel). L'activité antimicrobienne a été exprimée dans la première méthode par l'inhibition de la croissance (GI), par la concentration minimale inhibitrice (MIC) et par une nouvelle expression, dénommée index antimicrobien (AMI). Dans la seconde méthode, l'activité a été exprimée en zone d'inhibition. L'AMI prend en compte les trois phases de croissance des bactéries. Bien que les méthodes turbidimétriques soient fiables dans l'évaluation de l'activité antimicrobienne des substances, la nouvelle expression (AMI) semble être plus significative car, elle comprend l'information sur l'interaction entre la substance et le micro-organisme et sa vitesse de croissance en présence de cette substance. De plus, l'AMI démarque l'activité des échantillons, même ceux qui sont très actifs. Le spectre d'activité antimicrobienne des extraits de plantes sélectionnés a été également étudié. Seulement quelques extraits ont montré un spectre d'activité antimicrobienne assez large. En effet, seul l'extrait de feuille de bétel a un large spectre d'activité contre les bactéries, les levures et les champignons, suivis des extraits de grenade et de fruits d'argousier qui semblent être efficaces contre les bactéries et les levures. L'extrait de cassis est effectivement une substance antibactérienne. Finalement, différentes stratégies pour améliorer l'activité antimicrobienne d'extraits anti-oxydants-antimicrobiens sélectionnés ont été explorées. Trois approches, incluant l'extraction par solvants sélectifs, le mélange binaire des extraits et l'addition de composés végétaux, ont été étudiées. L'activité anti-oxydante-antimicrobienne et le profil phytochimique ont été analysés. Le résultat montre que l'eau chaude peut être utilisée comme solvant pour l'extraction d'agents anti-oxydants-antimicrobiens d'origine végétale, bien qu'un solvant polaire extrait en préférence les substances phénoliques et modestement les substances non polaires comme les terpénoïdes. Toutefois, compte tenu du rendement et de l'activité des extraits, l'eau semble être appropriée, et elle peut être considérée comme un solvant efficace pour les fruits qui sont riches en substances phénoliques. Néanmoins, d'autres solvants sélectifs doivent être considérés pour l'extraction des substances actives non-polaires issues de matière première végétale comme les feuilles. Certaines augmentations de l'activité antimicrobienne sont possibles par le mélange de deux extraits de plantes ou par l'addition de composés végétaux. On a aussi observé que la composition des mélanges peut être importante, car les interactions synergiques ou antagonistes se retrouvent dans certaines proportions. Le mélange des extraits de grenade et cassis d'une part et le mélange des extraits de thé vert et pomme de cajou d'autre part ont montré une amélioration d'activité. L'ajout de glyoxal de méthyle et mono-caprine a également produit une augmentation de l'activité des extraits de plantes. L'addition de glyoxal de méthyle à 25 % (p/p) a amélioré l'activité des extraits de grenade et de cassis. Dans l'ensemble, ce travail a exploré le potentiel des extraits des sous-produits de fruits et de légumes comme agent anti-oxydant-antimicrobien. Les extraits de plantes montrant des potentiels anti-oxydants et antimicrobiens regroupent: olive, canneberge, noni, feuille de bétel, cassis, grenade, citronnelle, épinard, raisin vert (vin), cassis (résidu), aubergine, ramboutan, prune indienne, feuille de canneberge, feuille de romarin, feuille de vigne (sauvage), thé vert, mangoustan et feuille de framboise. Cependant, de cette liste, seuls quelques extraits (feuille de bétel, grenade, résidus de cassis) présentent un large spectre d'activité anti-oxydante et antimicrobienne. En outre, cette étude a introduit de nouvelles expressions pour l'activité anti-oxydante (ARP) et antimicrobienne (AMI) des mélanges complexes tels que les extraits de plantes. Ces expressions peuvent être utiles pour le criblage de matériels d'origine végétale dans la recherche de ces activités. Un autre enseignement de cette étude est que l'amélioration de l'activité antimicrobienne des extraits de plantes ne peut pas être possible simplement par le mélange d'extraits, en raison des interactions potentielles entre les composants des extraits. La connaissance de la composition phytochimique est essentielle pour comprendre de telles interactions, dans la sélection des mélanges et pour déterminer les approches possibles pour améliorer l'activité antimicrobienne. / Les sous-produits de végétaux peuvent être une source potentielle d'antioxydant-antimicrobiens pour une application dans la conservation des aliments, comme alternative aux agents synthétiques, mais beaucoup de travaux sont encore nécessaires pour atteindre ce but, ce qui nécessiterait une approche systémique. / There is a growing interest in the development of strategies to use agricultural and industrial residues as a source of high value-added, including bioactive products. The residues of fruits and vegetables may be a potential source of bioactive compounds. The major objective of this work is to conduct studies to pave the way for the development of antioxidant-antimicrobials from plant by-products for use in food preservation, as alternative to synthetic chemicals. The starting point was the identification of extracts of fruit and vegetable extracts exhibiting high antimicrobial and antioxidant properties. The selected extracts were then characterized for their spectrum of antioxidant and antimicrobial activities. Finally, simple ways of enhancing the antimicrobial activity of the selected extracts were examined. Aqueous extracts of about 160 fruit and vegetable by-products were evaluated for their potential as antimicrobial and antioxidant agents. The growth inhibiting activity of all the 160 extracts were tested against Escherichia coli, and Bacillus Subtilis; and the antioxidant activity was determined by DPPH radical scavenging assay. The pH of the extract, type of tissue (fruit, leaf and root) and physiological type of fruits (climacteric) had impact on the bioactive properties. There was some relationship between antioxidant and antimicrobial properties of the plant extracts. The proposed antioxidant-antimicrobial index may be useful in the selection of plant sources of bio-actives. Consideration of rate of radical quenching (time factor) to define actual efficacy (capacity) of antioxidant system was found to be a better and reliable way of expressing the real antioxidant power. The new expression, antiradical power - ARP, generated from DPPH assay may be more useful in identifying the antioxidant activity of biological samples. Some samples exhibited high ARP value such as rambutan, cranberry leaf, blueberry leaf, grape leaf (wild), raspberry leaf, betel leaf, avocado, pomegranate and custard apple. Leaf extracts possess, in general, higher ARP than fruits, and root extracts possess low ARP. In addition, this study also suggests that average carbon oxidation number of complex mixtures such as plant extracts may portend their antioxidant power, in spite of the disparity between leaf and fruit materials. In chapter 4, plant extracts selected from the original 160 were investigated for their spectrum of anti-radical activity. The antioxidant activity was evaluated by Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), DPPH free radical assay (DPPH), ferric reducing power assay (FRAP), redox potential measurement, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide anion, nitric oxide and iron chelating activities. Their total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) were also determined. Betel leaf, blueberry fruit and black currant and cranberry leaf showed high radical scavenging activity (TEAC assay); apple, sorrel, red grape and dandelion root were effective against SOA; cranberry leaf, blueberry leaf, black currant and Rosemary against hydroxyl radical; rainbow chard, parsnip, broccoli and orange against H2O2; and potato, banana, sorrel, sea buckthorn leaf against nitric oxide. Blueberry leaf and fruit, pomegranate, black currant and betel leaf showed high ferric ion reducing power. The extracts showing high iron binding capacity were: sea buckthorn leaf, radish, parsnip, betel leaf and mangosteen. Betel leaf extract exhibited high activities, including iron binding and scavenging of various radicals except nitric oxide, where the activity was moderate. TEAC, DPPH and FRAP assays provide essentially the same response with respect to the antioxidant activity of plant extracts, suggesting that any one of them would be adequate to evaluate their anti-radical capacity. This study also suggests that antioxidant activity of a substance, determined by one or more related assays, does not give the complete picture of its effectiveness against various species of oxygen radicals; and emphasizes that determination of the spectrum of the anti-radical activity would be necessary. In chapter 5, the antimicrobial activity of selected plant extracts was evaluated in detail by turbidimetric methods in liquid medium, and by well-diffusion method in gel medium. The antimicrobial activity was expressed in the former by growth inhibition, minimum inhibitory concentration - MIC and by a new expression, the antimicrobial index – AMI; and in the latter, expressed by zone of inhibition. AMI takes into account all the three growth phases of the bacteria. Although the turbidimetric methods were in good agreement in the assessment of the activity of the substances, the new expression, AMI, appears to be more meaningful since it carries the information regarding interaction between the substance and the microorganism and the growth rate in the presence of that substance. In addition, AMI demarcates the activity of samples, even those found to be highly active. Furthermore, the spectrum of antimicrobial activity of selected plant extracts was also examined. Only a few extracts showed some broad spectrum in their activities. In effect, only betel leaf extract showed a broad spectrum of antimicrobial activity against bacteria, yeasts and fungi; whereas pomegranate and sea buckthorn fruit extracts appear to be effective against both bacteria and yeasts. Black currant extract is effectively an antibacterial substance. In chapter 6, various ways of enhancing the antimicrobial activity of selected antioxidant-antimicrobial extracts were explored. Three approaches, including selective solvent extraction, binary blending of extracts and addition of plant compounds were investigated. Antioxidant, antimicrobial activity and the profile of phytochemical classes were analyzed. The results showed that hot water could be used for solvent extraction of antioxidant-antimicrobials from plant materials, albeit a polar solvent that extracts phenolic substances preferably and only modestly non-polar substances such as terpenoids. However, considering the yield of the extracts and the activity, water appeared to be an effective solvent solvent for fruit sources that are rich in phenolic substances. Other selective solvents must be considered for extraction of active non-polar substances for plant sources such as leaves. Some enhancement in antimicrobial activity was possible by either mixing plant extracts or by the addition of plant compounds. It was also observed that the composition of blends or mixtures might be important, since synergistic or antagonistic interactions occurred at certain proportions. Pomegranate and black currant extract blends and green tea and cashew apple extract blends showed enhancement in activity. The addition of methyl glyoxal and mono-caprin also showed enhancement in the activity of plant extracts. Methyl glyoxal at 25 % (w/w) addition improved the activity of pomegranate and black currant extracts. Overall, this work explored the potential of extracts of fruit and vegetable by-products as anti-oxidant-antimicrobials. Some plant extracts having potential as antioxidant-antimicrobial agents. They include: olive, cranberry, noni, betel leaf, black currant, pomegranate, lemon grass, spinach, green grape (wine), black currant (residue), egg plant, rambutan, Indian plum, cranberry leaf, rosemary leaf, grape leaf (wild), green tea, mangosteen and raspberry leaf. However, the list is reduced to a few (betel leaf, pomegranate, black currant residue), should broad antioxidant and antimicrobial activities are taken into account. In addition, this study introduces new expressions for antioxidant (ARP) and antimicrobial (AMI) activities of complex mixtures such as plant extracts, and they can be useful in the screening of plant materials for these activities. The knowledge of the phytochemical composition is essential to understand such interactions, in the selection of mixtures and to determine possible approaches to enhance the antimicrobial activity. Plant by-product can be a potential source of antioxidant-antimicrobial for use in food preservation, as alternative to synthetic agents, but much work is needed to realize this goal, and that would require a systemic approach.

Les benzodiazépines et quinoxalines sont des structures très importantes en chimie médicinale et on les retrouve dans un grand nombre de médicaments commercialisés et cliniquement importants. En plus de démontrer une grande diversité d’activités biologiques et de bonnes propriétés pharmacocinétiques, ces hétérocycles benzo-fusionnés sont capables de mimer plusieurs types de motifs peptidiques et de structures secondaires de protéines. Ces caractéristiques en font des prototypes moléculaires d’un grand intérêt dans l’industrie pharmaceutique pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques. La première partie du mémoire décrit le développement d’une voie de synthèse pour des 3,4-dihydroquinoxalin2-ones polysubstituées en utilisant la stratégie Ugi-déprotection-cyclisation (UDC). Cette méthode rapide et efficace implique une réaction multicomposante de Ugi suivi d’une déprotection simultanément à une cyclisation par substitution nucléophile aromatique. L’étude de la réaction multicomposante a démontré que la formation préliminaire de l’imine était nécessaire pour éviter la présence d’un produit secondaire important, le produit de la réaction multicomposante de Passerini. Une fois cette première étape optimisée, la déprotection et lacyclisation ont également été analysées pour identifier les meilleures conditions réactionnelles. Finalement, les conditions optimales identifiées ont été utilisées pour la production d’une chimiothèque de 3,4-dihydroquinoxalin2-ones qui sera employée dans de futurs tests biologiques. La deuxième partie du mémoire décrit le transfert sur support solide de la synthèse de 1,4-benzodiazépin-3-ones par la stratégie UDC en solution. Différentes résines ont été testées et il a été observé que la réaction de Ugi et la déproctection fonctionnaient très bien sur la plupart d’entre elles. Par contre, l’étape de cyclisation était beaucoup plus difficile. Suite à l’évaluation de plusieurs conditions en solution, l’utilisation des meilleures conditions sur support solide a permis l’obtention d’une 1,4-benzodiazépin-3-one. Il reste encore de l’optimisation à faire, mais ces travaux jettent les fondations pour la synthèse de benzodiazépines sur support solide en utilisant la stratégie UDC. / Benzodiazepines and quinoxalines are very important structures in medicinal chemistry and they can be foundin a great number of marketed and clinically important drugs. In addition to their wide spectrum of biological activities and good pharmacokinetic properties, these benzo-fused heterocycles are able to mimic several types of peptide motifs and protein secondary structures. These characteristics make them very attracting scaffolds in the pharmaceutical industry for the development of new therapeutic agents.The first part of the thesis describes the development of a synthetic route for polysubstituted 3,4-dihydroquinoxalin-2-ones using the Ugi-deprotection-cyclization (UDC) strategy. This convenient and efficient method involves a Ugi multicomponent reaction followed by simultaneous deprotection and cyclization byaromatic nucleophilic substitution. A first study of the multicomponent reaction showed that preformation of the imine was necessary to avoid the presence of an important side product resulting from the Passerini multicomponent reaction. Once this first step optimized, the deprotection and cyclization were also analyzed to identify the best reaction conditions. Finally, the optimal conditions identified for the different steps were used for the production of a chemical library of 3,4-dihydroquinoxalin-2-ones which will be involved in future biological tests. The second part of the thesis describes the transfer on solid support of the 1,4-benzodiazepin-3-one synthesis by UDC. Different resins were tested and the results showed that the Ugi reaction and deproctection worked very well on most of them. However, the cyclization step was much more difficult. Following the evaluation of several conditions in solution for the cyclization, the use of the best conditions on solid support allowed the preparation of a 1,4-benzodiazepin-3-one derivative. There is still optimization to do for the cyclization step butthis work pave the way for the synthesis of benzodiazepines on solid support by UDC and the preparation of polysubstituted 1,4-benzodiazepin-3-one libraries.

Les biofilms sont responsables de plus de 75 % des infections microbiennes humaines entraînant un problème de santé publique important lorsqu’ils croissent sur des surfaces médicales synthétiques. Une stratégie novatrice pour lutter contre les infections est basée sur l’emploi de biomatériaux fonctionnels ou de revêtements polymériques aux propriétés antiadhésives présentant une activité antimicrobienne comme le "Medical Antibacterial Antiadhesive Coating" (MAAC) qui est composé en partie de nanoparticules de silice fonctionnalisées. Malgré les progrès récents dans le dépistage des agents infectieux et l’implémentation de mesures visant à améliorer la sécurité transfusionnelle dans les banques de sang, le risque de contamination des produits sanguins ne peut être réduit à zéro. L’objectif principal de ce projet de recherche visait à évaluer les performances antimicrobiennes et antiadhésives du revêtement MAAC appliqué à la surface de matériaux polymériques à usage médical Les objectifs secondaires touchaient la compréhension des mécanismes de fonctionnement, ainsi que l’évaluation de la cytotoxicité in vitro du revêtement MAAC. À la lumière des résultats obtenus, une adhérence bactérienne réduite a été observée pour des sections de PVC enduites de MAAC par rapport au contrôle. Le nombre de S. aureus adhéré au PVC-BTHC et PVC-DEHP a diminué d'environ 63 % et 99 % respectivement après 24 heures de contact en bouillon nutritif. Toujours en milieu nutritif, le MAAC appliqué en surface de matériaux polymériques a démontré une activité antibactérienne significative (≥ 1 log). Des performances plus modestes ont été observées en matrices complexes de culots globulaires ou de concentrés plaquettaires, qui semblent être associées principalement à la densité cellulaire et teneur élevée en protéines des matrices limitant les interactions entre le MAAC et les bactéries. La viabilité des cellules L929 en présence du MAAC a été supérieure à 90%. Le MAAC semble donc un bon candidat pour contribuer aux efforts de prévention des risques associés à la transfusion de produits contaminés.. / The biofilms are responsible for over 75% of human microbial infections causing a significant public health concern when grown on synthetic medical surfaces. An innovative strategy to fight against infections link to medical devices is based on the use of functional biomaterials or polymeric coatings with non-stick properties exhibiting antimicrobial activity such as “Medical Antibacterial Antiadhesive Coating” (MAAC) based on functionalized silica nanoparticles. Despite recent advances in the detection of infectious agents and the implementation of measures to improve transfusion safety in blood banks, the risk of contamination of blood products cannot be reduced to zero, which could fall below the detection limit currently in place. The main objective of this research project was to evaluate the antimicrobial and non-stick performance of the MAAC coating applied to the surface of polymeric materials for medical use. The secondary objectives concerned the understanding of the action mechanisms, as well as the evaluation of the in vitro cytotoxicity of the MAAC coating. In light of the results obtained, a reduced bacterial adhesion was observed for PVC sections coated with MAAC compared to the control. The number of S. aureus adhered to PVC-BTHC and PVC-DEHP decreased by approximately 63% and 99% respectively after 24 hours of contact in nutrient broth. Still in a nutrient medium, MAAC applied to polymeric materials demonstrated significant antibacterial activity (≥ 1 log). Reduce performances were observed in complex matrices of red blood cells or platelet concentrates, which seem to be associated mainly with cell density and high protein content of the matrices limiting the interactions between MAAC and bacteria. The viability of L929 cells in the presence of MAAC was greater than 90%. MAAC therefore appears to be a good candidate for contributing on efforts to prevent the risks associated with the transfusion of contaminated products.

Au cours des dernières décennies, les antimicrobiens naturels d'origine bactérienne, telles que les bactériocines et la reutérine, ont reçu une attention considérable entant que conservateurs alimentaires ou comme alternatives aux antibiotiques pour les secteurs humain et animal. L'approbation des bactériocines et de la reutérine entant que bio-conservateurs ou assainisseurs par les organismes réglementaires repose non seulement sur les preuves d'efficacité mais également sur des données crédibles de cytotoxicité et de comportement dans l'environnement gastro-intestinal. Bien que les activités antimicrobiennes des bactériocines et de la reutérine soient largement documentées dans la littérature, très peu de données sont disponibles sur leur biodisponibilité dans les matrices biologiques et sur leur toxicité pour les différentes applications. Par conséquent, l'objectif général de cette thèse est d'évaluer, à travers différents modèles in vitro, la stabilité gastro-intestinale, l'activité biologique et la toxicité des bactériocines et de la reutérine en vue de leur utilisation dans différentes applications alimentaire, médicale et vétérinaire. Le premier objectif spécifique était de produire, purifier et évaluer l'activité antimicrobienne des bactériocines et de la reutérine seules et en combinaison contre un large panel de organismes pathogènes et d'altération d'intérêt pour les différents secteurs. Cinq consortia synergiques différents ont été identifiés, dont trois -microcine J25 + l'acide citrique + l'acide lactique, microcine J25 + reutérine + acide citrique, et microcine J25 + reutérine + acide lactique- ont montré une activité significative contre Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC6962 (indice FIC = 0,5). Deux autres combinaisons- pédiocine PA-1 + acide citrique+ acide lactique, et reutérine + acide citrique + acide lactique- ont montré des effets partiellement synergiques contre Listeria ivanovii HPB28 (indice FIC = 0,75). Le deuxième objectif spécifique était d'évaluer la stabilité gastro-intestinale de la reutérine à l'aide d'un modèl simulant des conditions digestives chez l'humain ainsi que l'activité hémolytique et la cytotoxicité in vitro de la reutérine par dosage au rouge neutre et dosage colorimétrique à la lactate déshydrogénase (LDH) en utilisant la lignée cellulaire Caco-2. La reutérine s'est révélée biologiquement très stable los du transit gastro-intestinal. L'exposition des cellules Caco-2 à différentes concentrations de réutérine n'a montré aucun effet négatif sur la viabilité ni sur l'intégrité des cellules à des concentrations allant jusqu'à 1080 mM. De plus, aucune hémolyse n'a été observée sur les cellules sanguines exposées à des concentrations allant jusqu'à 270 mM de reutérine. En conséquence, cette étude nous a permis de démontrer que la réutérine peut être utilisée de façon très sécuritaire à des concentrations n'excédant pas 270 mM, dans différentes applications. Le troisième objectif était d'évaluer la stabilité gastro-intestinale et l'activité de la microcine J25, de la pédiocine PA-1, de la bactofencine A et de la nisine à l'aide de modèles in vitro. De plus, la cytotoxicité et l'activité hémolytique de ces bactériocine sont été étudiées sur des cellules Caco-2 et des érythrocytes de rat, respectivement. Nos résultats ont montré que la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine sont dégradées à différents niveaux lors du transit gastro-intestinal, tandis que la microcine J25 n'est que partiellement dégradée. D'autre part, les études réalisées sur les cellules Caco-2 n'ont montré aucun effet cytotoxique jusqu'à des concentrations de 400 µg/mL. L'étude sur les érythrocytes de rat a montré un effet, hémolytique significatif lorsque la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine sont utilisées à des concentrations supérieures à 50 µg/mL, tandis que la microcine J25 n'a montré aucun effet hémolytique Dans le quatrième objectif, la toxicité cutanée de la reutérine, de la microcine J25, de la pédiocine PA-1, de la bactofencine A et de la nisine Z a été étudiée in vitro en utilisant des tests de libération de rouge neutre et de LDH sur des cellules NHEK. Les potentiels de sensibilisation et d'irritation cutanée de ces mêmes bactériocine sont également été déterminés en utilisant respectivement le test h-CLAT et le modèle épidermique humain EpiDerm™. Les essais réalisés sur les cellules NHEK ont montré que l'exposition de ces cellules aux bactériocines et à la reutérine à des concentrations allant à 400 µg/mL et 80 mg/mL respectivement, n'a entrainé aucun effet cytoxique. De plus, la microcine J25 et la reutérine n'ont montré aucune sensibilisation cutanée à des concentrations allant à 100 µg/mL et 40 mg/mL, respectivement, tandis que la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine Z ontprovoqué une sensibilisation à des concentrations supérieures à 100 µg/mL. La viabilité des tissus n'a pas été affectée en présence de bactériocines et de reutérine à des concentrations allant jusqu'à 200 µg/mL et 40 mg/mL, respectivement. L'ensemble de ces résultats montre que certaines bactériocines et la reutérine pourraient être incorporées en toute sécurité comme ingrédient antimicrobien dans différentes préparations topiques destinées à des applications humaines et animales Finalement, le dernier chapitre de la thèse a été consacré au développement et à la caractérisation de différents hydrogels à activité antimicrobienne et ayant comme principe actif des bactériocines ou de la réutérine. La reutérine, la pédiocine PA-1 et la microcine J25 ont été incorporées dans des formules d'hydrogel développées à partir de biopolymères à base de chitosan (1,5% , 2,5%) ou de carboxymethle cellulose (CMC 3% , 5%). Les hydrogels développés ont été caractérisés en termes d'aspect général, de viscosité, d'activité antimicrobienne et de stabilité pendant lors de l'entreposage à température ambiante. Les résultats obtenus ont montré que le chitosane à 1,5 % et 2,5 % contenant de la microcine J25 ou de la pédiocine PA-1demontré une activité inhibitrice significative durant toute la période d'entreposage. L'effet inhibiteur de la microcine J25 et de la reutérine dans les hydrogels CMC 3% et 5% est resté inchangé tandis que la pédiocine ajouté aux hydrogels de CMC 3% et 5% a perdu son activité dès la première semaine. En termes de viscosité, l'ajout d'antimicrobiens aux hydrogels n'a pas affecté leur viscosité et toutes les formules sont restées stables pendant les quatre semaines d'entreposage. Les résultats obtenus montrent que les formules développées présentent un fort potentiel d'application dans les secteurs alimentaire, médical et vétérinaire. En conclusion, le travail décrit dans cette thèse a permis de générer des résultats uniques sur le comportement, l'activité biologique, la stabilité et la toxicité de plusieurs composés antimicrobiens d'origine bactérienne incluant différentes bactériocines et la reutérine. Différents modèles in vitro récents et protocoles expérimentaux ont alors été utilisés et adoptés pour notre étude. Les résultats obtenus sont très pertinents et sont indispensable dans les démarches d'homologation de ces composés naturels par les différents organismes règlementaires pour différentes applications que ce soit pour le secteur alimentaire, médicale et/ou vétérinaire. En conclusion, le travail décrit dans cette these a permis de générer des résultats uniques sur le comportement, l'activité biologique, la stabilité et la toxicité de plusieurs composés antimicrobiens d'origine bactérienne incluant différentes bactériocines et la reutérine. Différents modèles in vitro récents et protocoles expérimentaux ont alors été utilisés et adoptés pour notre étude. Les résultats obtenus sont très pertinents et sont indispensable dans les démarches d'homologation de ces composés naturels par les différents organismes règlementaires pour différentes applications que ce soit pour le secteur alimentaire, médicale et/ou vétérinaire. / In recent decades, natural antimicrobials produced by bacteria, such as bacteriocins and reuterin, have received considerable attention as food preservatives or as alternatives to antibiotics for the human and animal sectors. Approval of bacteriocins and reuterin as bio-preservatives or sanitizers by regulatory agencies is based not only on evidence of efficacy but also on sufficient data on cytotoxicity and behavior in the gastrointestinal conditions. Although the antimicrobial activities of bacteriocins and reuterin have been widely studied, very little data is available on their behavior in biological matrices and their toxicity for different applications. Therefore, the general objective of this thesis was to evaluate the gastrointestinal stability, the biological activity, and the toxicity of bacteriocins and reuterin using different in vitro models for their intended use in food, medical, and veterinary applications. The first specific objective was to produce, purify and evaluate the antimicrobial activity of bacteriocins and reuterin alone and in combination against a wide range of pathogenic and spoilage organisms of interest to different sectors. Five different synergistic consortia were identified, of which three of them (microcin J25 + citric acid + lactic acid, microcin J25 + reuterin + citric acid, and microcine J25 + reuterin + lactic acid) showed significant activity against Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC 6962 (FIC index = 0.5). Two other combinations (pediocin PA-1 + citric acid + lactic acid, and reuterin + citric acid + lactic acid) showed partially synergistic effect against Listeria ivanovii HPB28 (FIC index = 0.75). The second specific objective was to evaluate the gastrointestinal stability of reuterin using an in vitro simulated digestion conditions in humans. Furthermore, the hemolytic activity, and in vitro cytotoxicity of reuterin using neutral red assay and lactate dehydrogenase (LDH) release assays were determined on assay on the Caco-2 cell line. Reuterin was observed to be very stable biologically during gastrointestinal transit. Moreover, exposure of Caco-2 cells to different concentrations of reuterin showed no negative effect on cell viability or membrane integrity at concentrations up to 1080 mM. In addition, no hemolysis was observed on erythrocytes exposed to concentrations up to 270 mM of reuterin. As a result, this study demonstrated that reuterin can be safely used at concentrations up to 270 mM, in various applications. The third objective was to assess the gastrointestinal stability and activity of microcin J25, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin using in vitro models. In addition, the cytotoxicity and hemolytic activity of these bacteriocins were studied on Caco-2 cells and rat erythrocytes, respectively. According to the results, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin were degraded at different levels during gastrointestinal transit, while microcin J25 was only partially degraded. Moreover, bacteriocins did not show cytotoxic effects on Caco-2 cells at concentrations up to 400 µg/mL. Finally, pediocin PA-1, bactofencin A, and nisin at concentrations higher than 50 µg/mL showed hemolytic potential, while microcin J25 did not cause hemolysis. In the fourth objective, the dermal toxicity of reuterin, microcin J25, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin Z was studied in vitro using neutral red and LDH release assays on NHEK cells. The skin sensitization and irritation potentials of these bacteriocins and reuterin were also determined using the h-CLAT test and the human epidermal model EpiDerm ™, respectively. The results demonstrated that exposure of NHEK cells to these bacteriocins and reuterin at concentrations up to 400 µg/mL and 80 mg/mL, respectively, did not induce any cytotoxic effect. Inaddition, microcin J25 and reuterin showed no skin sensitization at concentrations up to 100 µg/mL and 40 mg/mL, respectively, while pediocin PA-1, bactofencin A and nisin Z caused sensitization at concentrations higher than 100 µg/mL. Tissue viability was not affected in the presence of bacteriocins and reuterin at concentrations up to 200 µg/mL and 40 mg/mL, respectively. Taken together, these results showed that certain bacteriocins and reuterin could be safely incorporated as an antimicrobial ingredient in various topical preparations intended for human and animal applications. Finally, the last chapter of the thesis was devoted to the development and characterization of different antimicrobial hydrogels based on bacteriocins or reuterin. Reuterin, pediocin PA-1, microcin J25 were incorporated into hydrogel formulations developed from biopolymers; chitosan (1.5%, 2.5%) or carboxymethyl cellulose (CMC, 3, 5%). The developed hydrogels were characterized in terms of general appearance, viscosity, antimicrobial activity, and stability during storage at room temperature. The results showed that the 1.5% and 2.5% chitosan containing microcin J25 or pediocin PA-1 have significant inhibitory activity throughout the storage period. The inhibitory effect of microcin J25 and reuterin in the 3% and 5% CMC hydrogels remained unchanged while the pediocin PA-1 added to the 3% and 5% CMC hydrogels totally lost its activity after one week. In terms of viscosity, the addition of antimicrobials to the hydrogels did not affect their viscosity and all formulations remained stable during the four weeks of storage. The results suggested that the formulas developed have great potential for application as sanitizer in the food, medical and veterinary sectors. In conclusion, this thesis has generated unique results on the gastrointestinal behavior, biological activity, stability, and toxicity of several bacterial drived antimicrobials including different bacteriocins and reuterin. Different in vitro models were adopted for this study. The results obtained are very relevant and are essential for the approval process of these natural compounds by the various regulatory agencies for different applications in food, medical or veterinary sector.