Thèse de doctorat : Mathématiques : Mathématiques appliquées : Metz : 2006. / Thèse soutenue sur ensemble de travaux. Bibliogr. p. 133-139.

Thèse de doctorat : Biologie Moléculaire : Nancy 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [87]-101. Publié aussi en version électronique.

On sait maintenant depuis quelques décennies que seule une petite fraction du génome est constituée de séquences codantes pour des protéines et que la majorité de l'ADN non codant, jadis considéré comme « poubelle », assure d'importantes fonctions biologiques. Avec ce nouveau paradigme, notre perception de l'expression et la régulation génique est passée d'une vision axée sur les protéines à une vision plus centrée sur les ARN, tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. L'avènement des techniques de séquençage à haut débit comme le RNA-Seq (séquençage ARN) a fortement contribué à la démystification de cette partie « non codante » de l'ARN. Outre le triumvirat de gènes d'ARNt, d'ARNr et d'ARNm, les génomes abritent de nombreux loci qui codent pour de petits ARN régulateurs non canoniques repartis dans de nombreuses classes. Les microARN (miARN) et les fragments dérivés des ARNt (tRFs) sont les deux classes de petits ARN non codants (ARNnc) les plus abondants et partageant des similarités dans leurs mécanismes. Bien que souvent éclipsés par les protéines, ils sont au cœur de la régulation post-transcriptionnelle et sont des acteurs émergents de la relation hôte-pathogène. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans ce thème et traitent des relations hôtes-pathogènes sous l'angle des petits ARNnc à travers deux projets (#1 et #2) complémentaires qui ambitionnent d'apporter une lecture et des perspectives nouvelles. Dans le projet #1, nous avons travaillé avec le virus à ARN Ebola (EBOV), un agent pathogène connu pour provoquer une fièvre hémorragique mortelle, qui a été responsable de plusieurs épidémies en Afrique et demeure encore aujourd'hui une menace pour la santé publique mondiale. En combinant RNA-Seq, PCR quantitative et analyses computationnelles, nous avons obtenu le premier transcriptome détaillé des miRNA (miRNome) d'une lignée de cellules hépatiques humaines infectées par l'une des trois souches variantes de EBOV dont Mayinga, Makona et Reston. Lors de l'infection par EBOV, il y'a une expression différentielle de seulement 1/5 du miRNome de l'hôte au cours du temps avec une modulation spécifique des miR-122-5p, miR-148a-3p et miR-21-5p. Les données obtenues mettent en relief, au-delà des manifestations cliniques jusque-là connues, de nouvelles différences substantielles entre les souches vis-à-vis de leur effet sur le miRNome. Dans une seconde phase, avec la même approche, nous avons découvert, caractérisé et validé deux miARN viraux codés par les génomes EBOV (Mayinga et Makona). Ces deux miARN viraux peuvent potentiellement cibler des gènes impliqués dans le phénotype hémorragique, la régulation de la réplication virale et la modulation de la défense immunitaire de l'hôte. Le projet #2 s'inscrit dans un contexte où nous avions découvert fortuitement l'existence d'espèces d'ARN inférieures à 16 nt (appelés ici vsRNA pour very small RNA) qui s'avèrent fonctionnels chez les eucaryotes alors qu'ils étaient souvent retirés des jeux de données de séquençage, car considérés comme étant des « produits de dégradation ». Nous avons étendu notre analyse RNA-Seq aux bactéries pour caractériser les vsRNAs de Escherichia coli K-12 MG1655 et cinq autres souches bactériennes. L'étude est complétée par l'analyse des vésicules dérivées de la membrane externe (Outer Membrane Vesicles ; OMVs) produites par E. coli K-12 MG1655 en raison de leurs rôles déterminants pour améliorer des chances de survie, la régulation des interactions microbiennes et la promotion de la pathogenèse. Les résultats montrent l'existence de vsRNAs variés et très abondants avec les tRFs comme un biotype majeur, notamment ceux dérivés de l'ARNt isoleucine (Ile-tRF). En guise de preuve de concept de la fonctionnalité de ces vsRNAs de type tRFs, nous avons étudié en détail le très abondant et thermodynamiquement stable Ile-tRF. Nos analyses montrent qu'il est modulé sélectivement par le stress environnemental et peut être transféré via les OMVs (où il est particulièrement enrichi) aux cellules humaines HCT116 où il favorise l'expression des ARNm codant pour des membres de la famille des MAP-kinase. Notre étude est la toute première chez E. coli à rapporter l'existence de tRF abondants, trouvés dans des vésicules (OMVs) et assumant des fonctions potentielles chez l'hôte. L'Ile-tRF est également le premier tRF fonctionnel de 13 nt rapporté chez les bactéries. / For several decades now, it has been known that only a small fraction of the genome is made up of protein-coding sequences and that the majority of non-coding DNA, historically considered as "junk", carries out important biological functions. With this new paradigm, our perception of gene expression and regulation has shifted from a protein-centered view to a more RNA-centered view in both prokaryotes and eukaryotes. The advent of high-throughput sequencing techniques such as RNA sequencing (RNA-Seq), has strongly contributed to the demystification of this "non-coding" part of RNA. Besides the triumvirate of tRNA, rRNA, and mRNA genes, genomes harbor numerous loci that encode small non-canonical regulatory RNAs distributed in many classes. MicroRNAs (miRNAs) and tRNA-derived fragments (tRFs) are the two most abundant classes of small non-coding RNAs (ncRNAs) and share similarities in their mechanisms. Although often overshadowed by proteins, they are at the heart of post-transcriptional regulation and are emerging players in the host-pathogen relationship. This thesis addresses the host-pathogen relationship from the perspective of small ncRNAs through two complementary projects (#1 and #2) that aim to provide new insights and perspectives. In project #1, we worked with the Ebola RNA virus (EBOV), a pathogen known to cause a deadly hemorrhagic fever, which has been responsible for several epidemics in Africa and remains a global public health concern to this day. By combining RNA-Seq, quantitative PCR and computational analyses, we obtained the first detailed miRNA transcriptome (miRNome) of a human liver cell line infected with one of the three variant strains of EBOV including Mayinga, Makona and Reston. During EBOV infection, there is a differential expression of only 1/5 of the host miRNome over time with specific modulation of miR-122-5p, miR-148a-3p and miR-21-5p. The data obtained highlight, beyond the previously known clinical manifestations, substantial new differences between the strains with respect to their effect on the miRNome. In a second phase, using the same approach, we discovered, characterized and validated two viral miRNAs encoded by the EBOV genomes (Mayinga and Makona). These two viral miRNAs can potentially target genes involved in the hemorrhagic phenotype, the regulation of viral replication and the modulation of host immune defense. Project #2 was developed in a context where we had fortuitously discovered the existence of RNA species smaller than 16 nt (called here vsRNA for very small RNA) that were functional in eukaryotes but were often removed from sequencing datasets because they were considered as "degradation products". We have extended our RNA-Seq analysis to bacteria in order to characterize vsRNAs from Escherichia coli K-12 MG1655 and five other bacterial strains. The study is completed by the analysis of Outer Membrane Vesicles (OMVs) produced by E. coli K-12 MG1655 because of their critical roles in enhancing survival, regulating microbial interactions and promoting pathogenesis. The results show the existence of diverse and highly abundant vsRNAs with tRFs as a major biotype, especially those derived from isoleucine tRNA (Ile-tRF). As a proof of concept of the functionality of these tRF-like vsRNAs, we have studied in detail the highly abundant and thermodynamically stable Ile-tRF. Our analyses show that it is selectively modulated by environmental stress and can be transferred via OMVs (where it is particularly enriched) to human HCT116 cells where it promotes the expression of mRNAs encoding members of the MAP-kinase family. Our study is the first ever in E. coli to report the existence of abundant tRFs found in vesicles (OMVs) with potential functions in the host. Ile-tRF is also the first functional 13 nt tRF reported in bacteria.

Les virus Ebola (EBOV) et Marburg (MARV) causent des fièvres hémorragiques chez les primates, y compris l'homme. Le taux de létalité peut atteindre 90% et il n'existe ni vaccin ni traitement contre ces virus. En raison de leurs caractéristiques moléculaires communes, EBOV et MARV sont regroupés au sein de la famille des Filoviridae. Le virion est composé de 7 protéines, dont la VP24, qui joue un rôle important dans l'assemblage et la condensation des nucléocapsides, et pour EBOV, elle est également responsable de l'inhibition de la réponse à l'IFN. Des mutations dans la séquence protéique de VP24 sont impliquées dans le processus d'adaptation chez un nouvel hôte. La protéine VP24 d'EBOV est donc multifonctionnelle. Pour MARV, cette protéine ne semble pas porter les fonctions décrites pour la VP24 d'EBOV. Afin de comprendre le rôle de la VP24 de MARV, nous avons identifié ses partenaires cellulaires par un crible double-hybride en levures. Nous avons mis en évidence l'interaction entre Keap1 et la VP24 de MARV, et confirmé ce résultat en cellules mammifères. Keap1 est une protéine impliquée dans le contrôle de la réponse au stress oxydatif, car elle inhibe le facteur de transcription Nrf2, qui régule l'expression d'enzymes impliquées dans la réduction des ERO. Nos résultats montrent que le domaine de Keap1 liant la VP24 est le même que celui liant Nrf2, et que la VP24 de MARV active Nrf2 pour la synthèse de molécules anti-oxydantes. Nous avons enfin évalué l'impact de la VP24 de MARV sur ERR, une autre cible de Keap1, et mesuré l'activité Nrf2 au cours de l'infection par EBOV. Nos résultats montrent des effets opposés des VP24 d' EBOV et de MARV sur l'activité de Nrf2.

Le virus Ebola, responsable d'une fièvre hémorragique virale létale et le virus de la variole, agent étiologique de la variole, sont des armes biologiques potentielles. Il n'existe pas de traitement ou de prophylaxie autorisés contre le virus Ebola, quelques candidats vaccins étant en cours de développement. Concernant la variole, des vaccins dits de première génération (virus de la vaccine) ont permis l'éradication de la maladie cependant ils sont à l'origine de complications post-vaccinales parfois sévères alors que des vaccins plus récents dits de troisième génération, non-réplicatifs, ont été développés pour leur innocuité mais restent faiblement immunogènes. Nous avons récemment développé plusieurs vecteurs viraux de type virus de la vaccine (VACV) par délétion d'un certain nombre de facteurs de virulence. Nous avons évalué leur innocuité, leur immunogénicité et leur efficacité en tant que candidats vaccins antivarioliques chez la souris puis utilisé l'un de ces vecteurs pour développer un candidat vaccin bivalent antivariolique et anti-virus Ebola. Ces virus de la vaccine délétés sont réplicatifs mais fortement atténués. Ils induisent une réponse en anticorps neutralisants spécifiques anti-vaccine similaire à celle induite par le vaccin antivariolique de première génération et induisent des réponses immunitaires cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques suffisantes pour protéger l'animal d'un challenge létal de cowpoxvirus en intranasal, simulant une infection par le virus de la variole. Le virus délété le plus immunogène et le plus sûr, nommé MVL, a été utilisé pour construire un vecteur viral codant pour la glycoprotéine du virus Ebola (EGP). Le gène entier d'EGP ou une forme chimérique d'EGP (fusion entre l'ectodomaine d'EGP et le domaine transmembranaire de la glycoprotéine B5 du VACV) ont été clonés dans le génome du vecteur viral. Ces deux vecteurs produisent des virus ayant incorporé EGP dans leur enveloppe. Ces deux candidats vaccins recombinants induisent de fortes réponses humorales spécifiques anti-EGP et anti-vaccine chez la souris immunocompétente. En conclusion, nous avons développé plusieurs candidats vaccins antivarioliques aussi immunogènes et efficaces que le vaccin historique et avec une atténuation similaire aux vaccins de troisième génération. L'un de ces candidats (MVL) a été utilisé comme vecteur viral pour exprimer la glycoprotéine hétérologue EGP, contre laquelle il induit une réponse immunitaire humorale forte

Le virus Ebola, responsable d'une fièvre hémorragique virale létale et le virus de la variole, agent étiologique de la variole, sont des armes biologiques potentielles. Il n'existe pas de traitement ou de prophylaxie autorisés contre le virus Ebola, quelques candidats vaccins étant en cours de développement. Concernant la variole, des vaccins dits de première génération (virus de la vaccine) ont permis l'éradication de la maladie cependant ils sont à l'origine de complications post-vaccinales parfois sévères alors que des vaccins plus récents dits de troisième génération, non-réplicatifs, ont été développés pour leur innocuité mais restent faiblement immunogènes. Nous avons récemment développé plusieurs vecteurs viraux de type virus de la vaccine (VACV) par délétion d'un certain nombre de facteurs de virulence. Nous avons évalué leur innocuité, leur immunogénicité et leur efficacité en tant que candidats vaccins antivarioliques chez la souris puis utilisé l'un de ces vecteurs pour développer un candidat vaccin bivalent antivariolique et anti-virus Ebola. Ces virus de la vaccine délétés sont réplicatifs mais fortement atténués. Ils induisent une réponse en anticorps neutralisants spécifiques anti-vaccine similaire à celle induite par le vaccin antivariolique de première génération et induisent des réponses immunitaires cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques suffisantes pour protéger l'animal d'un challenge létal de cowpoxvirus en intranasal, simulant une infection par le virus de la variole. Le virus délété le plus immunogène et le plus sûr, nommé MVL, a été utilisé pour construire un vecteur viral codant pour la glycoprotéine du virus Ebola (EGP). Le gène entier d'EGP ou une forme chimérique d'EGP (fusion entre l'ectodomaine d'EGP et le domaine transmembranaire de la glycoprotéine B5 du VACV) ont été clonés dans le génome du vecteur viral. Ces deux vecteurs produisent des virus ayant incorporé EGP dans leur enveloppe. Ces deux candidats vaccins recombinants induisent de fortes réponses humorales spécifiques anti-EGP et anti-vaccine chez la souris immunocompétente. En conclusion, nous avons développé plusieurs candidats vaccins antivarioliques aussi immunogènes et efficaces que le vaccin historique et avec une atténuation similaire aux vaccins de troisième génération. L'un de ces candidats (MVL) a été utilisé comme vecteur viral pour exprimer la glycoprotéine hétérologue EGP, contre laquelle il induit une réponse immunitaire humorale forte / Ebola virus, causing a lethal haemorrhagic fever and variola virus, the agent of smallpox are potential biological weapons. There is no treatment and no prophylaxis authorised against Ebola, although some vaccine viral vectors were developed these last years. Concerning smallpox, several types of vaccines exist against smallpox (based on vaccinia virus), first generation that allowed the disease eradication but responsible of some post-vaccination complications and some non-replicative 3rd generation vaccines which are safe but not very immunogenic. We have recently developed several vaccinia virus (VACV) vectors by deletion of some virulence genes, and we have evaluated their safety, immunogenicity and efficacy as smallpox vaccine in mice and used one of them as a bivalent vaccine against Ebola and smallpox. These viral vectors are higly attenuated and replicative competent. They induce a neutralizing specific-VACV antibodies response similar to that of the historical vaccine and induce VACV-specific CD8+ and CD4+ immune responses efficient to protect immunocompetent mouse model intranasally infected by cowpox virus, simulating variola virus infection.The most safety and immunogenic vaccinia virus vector, named MVL, has been used to construct a vector encoding the Ebola glycoprotein (EGP) for immunization against Ebola. The native EGP gene or a chimeric EGP gene (a fusion between the EGP ectodomain and the transmembrane domain of the VACV B5 glycoprotein) have been cloned into the viral vector genome. These two recombinant vaccine candidates induce specific humoral immune responses against Ebola and vaccinia virus in immunocompetent mice. In conclusion, we have developed several vaccine candidates against smallpox as immunogenic and protective as the historical vaccine and as safe as 3rd generation vaccines. One of these candidates, MVL, has been used as a viral vector to express the heterologous glycoprotein EGP, against which it induce a strong humoral immune response.

Au cours de l’infection par le virus Ebola (EBOV), plusieurs glycoprotéines solubles sont massivement libérées à partir de cellules infectées mais le rôle précis de ces protéines virales n’a pas encore été identifié. Nous émettons l'hypothèse que l'altération de l’hémostase et du système et vasculaires observée au cours de l'infection à virus Ebola pourrait être, au moins en partie causée par ces glycoprotéines solubles. Ainsi pour la première fois, nous avons identifié les cibles cellulaires de la protéine soluble « shed GP » d’Ebola et nous avons démontré que sa partie glycosylé peut activer les cellules dendritiques et les macrophages non infectés, induisant, par le récepteur TLR4, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Nous démontrons aussi que l'activité de la shed GP est neutralisé lors de l'addition de la MBL, une protéine connue pour interagir avec certains motifs glycosylés présents à la surface de différents micro-organismes. Nous avons également montré que la shed GP active la perméabilité des HUVEC de façon directe et indirecte, via la libération de cytokines. En conclusion, cette étude suggère que la shed GP peut être l'un des principaux facteurs responsables de la stimulation précoce des cellules immunitaires qui produisent alors de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires, des éléments qui, combinés avec la réplication massive du virus et les dommages cellulaires induits par le virus, peuvent conduire à un syndrome de type choc septique et une mortalité élevée. / During Ebola virus (EBOV) infection several soluble glycoproteins are released in high amounts from infected cells but as yet still no clear role has been identified for these viral proteins. We hypothesized that the impairment of coagulation and vascular systems observed during EBOV infection could be, at least in part, due to these soluble glycoproteins.Here, for the first time we identify the cellular targets of EBOV soluble protein shed GP and provide evidence that through its glycosylation, shed GP can activate non-infected dendritic cells and macrophages, inducing, through TLR4, the secretion of pro-inflammatory cytokines. We also demonstrate that shed GP activity is negated upon addition of Mannose-Binding sera Lectin (MBL), a molecule known to interact with sugar arrays present on the surface of different microorganisms. We have also revealed that shed GP activates permeability of HUVECs both directly and indirectly through cytokine release. Overall, this study suggests that shed GP may be one of the principal factors responsible for the early stimulation of immune cells that then produce high amounts of proinflammatory cytokines that, combined with massive virus replication and virus-induced cell damage, can lead to a septic shock-like syndrome and high mortality.

Les fièvres hémorragiques à virus Lassa (LASV) et Ebola (EBOV) représentent un important problème de santé publique en Afrique. Les réponses immunes et la pathogenèse associées à ces maladies sont peu connues. Les cellules NK ont un rôle important dans la réponse immune innée par leurs propriétés cytotoxiques, mais également dans l'induction des réponses adaptatives par leur production de cytokines et leurs interactions avec les cellules dendritiques (DC) et les macrophages. Ce projet s'attache à comprendre le rôle des cellules NK dans le contrôle de la réplication virale et dans l'induction des réponses immunitaires au cours de ces infections. Un modèle in vitro de coculture de cellules NK humaines avec des DC et macrophages autologues a été développé. L'activation des cellules NK et leurs fonctions ont été analysées après l'infection par LASV et EBOV. Par ailleurs, les réponses des cellules NK en réponse à LASV ont été comparées avec celles induites lors de l'infection par le virus Mopeia (MOPV), très proche de LASV mais non pathogène pour l'homme. Les macrophages, mais pas les DC, infectés par LASV ou MOPV induisent l'activation et l'augmentation des capacités cytotoxiques des cellules NK. Toutefois, les cellules NK ne sont pas capables de lyser les cellules infectées et ne produisent pas d'IFN-γ. Les cellules NK s'activent et sont capables de lyser les cellules infectées en présence de macrophages mais également de DC infectés par des LASV mutants. Cependant, les IFN de type I sécrétés en grande quantité en réponse à ces virus ne sont pas impliqués dans l'activation des cellules NK. L'infection par EBOV n'induit qu'une très faible activation des cellules NK en présence de DC ou macrophages et ne conduit pas à la sécrétion de cytokines, ni à la modification du potentiel cytotoxique.Ces résultats permettent d'améliorer la compréhension des réponses immunes et des mécanismes de pathogenèse mis en place lors des fièvres hémorragiques Lassa et Ebola.

Les virus Ebola (EBOV) et Marburg (MARV) causent des fièvres hémorragiques chez les primates, y compris l’homme. Le taux de létalité peut atteindre 90% et il n’existe ni vaccin ni traitement contre ces virus. En raison de leurs caractéristiques moléculaires communes, EBOV et MARV sont regroupés au sein de la famille des Filoviridae. Le virion est composé de 7 protéines, dont la VP24, qui joue un rôle important dans l’assemblage et la condensation des nucléocapsides, et pour EBOV, elle est également responsable de l’inhibition de la réponse à l’IFN. Des mutations dans la séquence protéique de VP24 sont impliquées dans le processus d’adaptation chez un nouvel hôte. La protéine VP24 d’EBOV est donc multifonctionnelle. Pour MARV, cette protéine ne semble pas porter les fonctions décrites pour la VP24 d’EBOV. Afin de comprendre le rôle de la VP24 de MARV, nous avons identifié ses partenaires cellulaires par un crible double-hybride en levures. Nous avons mis en évidence l’interaction entre Keap1 et la VP24 de MARV, et confirmé ce résultat en cellules mammifères. Keap1 est une protéine impliquée dans le contrôle de la réponse au stress oxydatif, car elle inhibe le facteur de transcription Nrf2, qui régule l’expression d’enzymes impliquées dans la réduction des ERO. Nos résultats montrent que le domaine de Keap1 liant la VP24 est le même que celui liant Nrf2, et que la VP24 de MARV active Nrf2 pour la synthèse de molécules anti-oxydantes. Nous avons enfin évalué l’impact de la VP24 de MARV sur ERR, une autre cible de Keap1, et mesuré l’activité Nrf2 au cours de l’infection par EBOV. Nos résultats montrent des effets opposés des VP24 d’ EBOV et de MARV sur l’activité de Nrf2. / Ebola (EBOV) and Marburgvirus (MARV) are responsible for severe hemorrhagic syndrome in primates, including humans. The lethality rate can reach 90%, and no vaccine or treatment is available to counteract these diseases. EBOV and MARV have similar genomic organization and thus are placed in a distinct family, Filoviridae. VP24 is one of the 7 structural proteins which form the virion and has been shown to play an important role in assembly and condensation of viral nucleocapsids. VP24 of EBOV is responsible for prevention of cellular response to IFN. Mutations in EBOV VP24 gene are necessary for the adaptation to a new host. EBOV VP24 thus acts as a multifunctional factor. Available data suggest that MARV VP24 is not implicated in either the counteraction of IFN response, or in the adaptation process. In order to discover new functions for VP24 of MARV, we searched for its interaction with cellular proteins, using a yeast-double hybrid approach. We discovered an interaction between MARV VP24 and Keap1 protein and further confirmed this interaction in mammalian cells. Keap1 is a cellular protein involved in intracellular detection of Reactive Oxygen Species (ROS) and in the control of oxidative stress response. It inhibits the Nrf2 transcription factor, which regulates expression of antioxidant enzymes. Our results indicate that Keap1 binding domain for VP24 is the same as the one involved in Nrf2 binding, resulting in activation of transcriptional activity of Nrf2. Impact of MARV VP24 on ERRa, another target of Keap1, was also measured, as well as Nrf2 activity during EBOV infection. Our results showed that VP24 of EBOV and MARV have opposite effect on Nrf2 activity.