Le gène metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, ou MALAT1 code pour un long ARN non codant (lncRNA) dont la maturation aboutit à la formation de Malat1 nucléaire et d'un petit ARN non codant cytoplasmique, le MASCRNA. Même si les fonctions physiologiques de Malat1 et du MASCRNA restent largement inconnues, les niveaux de Malat1 sont, depuis sa découverte, associés aux processus tumoraux. En effet, il a été rapporté par de nombreuses études que les niveaux des transcrits de MALAT1 étaient augmentés dans tous les types de cancers et associés à un mauvais pronostic pour les patients. Or, la prolifération tumorale et la dissémination des métastases surviennent dans un milieu notamment hypoxique. Dans ce contexte, l'hypothèse générale de la présente thèse était que l'expression de Malat1 est modulée par l'hypoxie, et que la réponse tissulaire à l'hypoxie est altérée lorsque cette modulation est bloquée ou absente. En premier lieu, la voie de signalisation régissant l'expression de MALAT1 pendant l'hypoxie a été caractérisée par la technique de gène rapporteur. Dans des essais cellulaires, la modulation de la transcription de MALAT1 a été augmentée par l'hypoxie, et contrôlée par le facteur induit par l'hypoxie HIF-1α, lui-même activé par une cascade signalétique impliquant l'AMPK. Nous avons ensuite évalué l'importance de Malat1 dans la réponse à l'hypoxie, avec un focus particulier sur deux tissus dont les fonctions sont très sensibles à l'oxygène, soit le poumon, où Malat1 est fortement exprimé de façon constitutive, et le tissu adipeux brun, dont l'activité thermogénique dépend de l'oxygénation. Dans ces deux tissus, l'exposition de souris à l'hypoxie (10% O₂) a aussi augmenté les niveaux de Malat1. L'absence de Malat1 par invalidation génétique a protégé les poumons de l'hyperréactivité induite par l'hypoxie en augmentant le volume alvéolaire et l'extraction de l'oxygène. De plus, une corrélation négative entre les niveaux d'expression du MASCRNA et le déclin des fonctions respiratoires de patients atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) a été observée, suggérant que la transcription accrue de MALAT1 est délétère pour la physiologie pulmonaire. Dans le tissu adipeux brun, autant l'hypoxie que l'absence de Malat1 ont favorisé le ralentissement de l'activité de la chaine respiratoire mitochondriale, suggérant que Malat1 stimule la thermogenèse. Par essais de gène rapporteur, nous avons démontré que Malat1 inhibe la dégradation de la région 3'UTR de Prdm16, un coactivateur transcriptionel essentiel à la réponse thermogénique du tissu adipeux brun. Ce mécanisme de stabilisation a augmenté les niveaux protéiques de Prdm16, et pourrait ainsi contribuer aux effets positifs de Malat1 sur le tissu adipeux brun. En conclusion, en s'appuyant sur les mécanismes déjà décrits dans la littérature, cette thèse démontre que l'hypoxie augmente les niveaux de Malat1, et établit des liens de causalités entre les phénotypes observés en absence de Malat1 et les fonctions potentielles de ce lncRNA dans la réponse tissulaire aux niveaux d'oxygène de l'organisme, notamment sur la physiologie pulmonaire ainsi que le métabolisme du tissu adipeux brun. Ce travail ouvre la voie à de nombreux travaux qui permettront d'affiner nos observations, mais également de mettre en lumière de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de la MPOC. / Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1, is a conserved, long non-coding RNA (lncRNA) whose processing results in the formation of mature nuclear MALAT1 and small cytoplasmic MASCRNA. Although the physiological functions of MALAT1 and MASCRNA are unknown, MALAT1 has been associated with tumor development. Indeed, numerous studies reported that the levels of MALAT1 are increased in all types of cancers and associated with poor prognosis. Both tumor proliferation and metastasis involve hypoxic milieu and signaling. In this context, the main hypothesis of the present thesis was that hypoxia increases MALAT1 transcription, and that cellular and tissular responses to hypoxia are altered in the absence of Malat1. Using a gene reporter technique, we first found that MALAT1 expression was increased by hypoxia through the activation of the transcription factor hypoxia-inducible factor HIF-1α by AMPK signaling. We next evaluated in mice the contribution of Malat1 in the response to hypoxia, with special attention to two tissues notable sensibility to oxygen status, namely the lung, which constitutively expresses high levels of Malat1, and brown adipose tissue, a thermogenic organ driven by uncoupled respiration. In mice exposed to hypoxia (10% O₂), Malat1 expression was increased in both tissues. Genetic ablation of Malat1 protected mice against hypoxia-induced lung hyperresponsiveness through increased alveolar volume and enhanced oxygen extraction. In addition, a robust correlation between MASCRNA levels and the decline of lung function in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) was observed, suggesting that increased MALAT1 transcription is deleterious to lung physiology. In brown adipose tissue, Malat1 deficiency by itself resulted in hypometabolism, an effect similarly observed after exposure to hypoxia, suggesting a central role for Malat1 in mitochondrial activity. Using a gene reporter assay, we further found that Malat1 inhibited the degradation of the 3'UTR region of Prdm16, a transcriptional coactivator essential to the thermogenic program of brown adipose tissue. This stabilizing mechanism stimulated Prdm16 protein levels, which could have contributed to positive effects of Malat1 on this tissue in mice. In conclusion, hypoxia increased Malat1 expression and its absence in two tissues altered their adaptive responses to low oxygen levels. Thus, the work presented in this thesis highlighted causal links between the phenotypes observed in the absence of Malat1 and the potential functions of this lncRNA in tissue responses to hypoxia, notably on lung physiology and brown adipose tissue metabolism. Finally, although more mechanistic and translational studies are required to build upon our observations, our findings suggest new potential therapeutic targets against CODP.

De récentes données suggèrent un rôle clé des longs ARNs non codants (lncRNAs) dans le développement et l’apparition de certaines maladies. Les lncRNAs se sont avérés difficiles à étudier en raison de leur faible niveau d’expression souvent tissu-spécifique, du manque de conservation de leur séquence, et du manque d’outils d’analyse spécifiques. Nous avons émis l’hypothèse que les méthodes d’étude des ARNs messagers peuvent être adaptées aux lncRNAs. Pour valider cette hypothèse, nos objectifs sont : 1-l’utilisation des nouvelles approches dérivées du système CRISPR/Cas9 pour activer et inhiber l’expression génique et 2-l’utilisation des méthodes conventionnelles de surexpression pour étudier les lncRNAs. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes concentrés sur un nouveau lncRNA, appelé Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA). Ce lncRNA est nécessaire au maintien des cellules souches embryonnaires, mais aussi à leur différenciation vers le lignage neural. Résultats : la nouvelle approche CRISPR-a/i permet d’activer/inhiber le promoteur de Tuna et de réguler l’expression endogène de celui-ci. Ce système s’étant révélé efficace pour Tuna, cela suggère qu’il peut être appliqué à l’étude d’autres lncRNAs. D’autre part, la particularité de cet ARN est qu’il contient une région conservée entre les espèces d’environ 200 nucléotides, correspondant à un ORF pour un peptide de 48 acides aminés. En utilisant des méthodes conventionnelles de marquage par FLAG, on démontre que Tuna code pour ce peptide. Par ailleurs, en supprimant un site de liaison à la protéine HUR dans la région 3’UTR, on altère l’expression du peptide. Cela suggère que ce site est important pour la régulation de la traduction du peptide encodé par Tuna. En conclusion, nos résultats montrent que certaines méthodes d’étude des ARNs messagers sont transposables aux lncRNAs. Cependant, du fait des caractéristiques propres à ces derniers, d’autres approches sont à envisager pour mieux saisir leurs mécanismes. En perspective, ces méthodes vont permettre de mieux comprendre la fonction de Tuna dans les différents états cellulaires où il est exprimé.

NEAT2 est un long ARN non-codant surexprimé dans plusieurs cancers. Toutefois, les études actuelles ne sont qu’associatives et ne permettent pas d’établir de lien direct de cause à effet ainsi que son mécanisme d’action dans la carcinogenèse. Dans cette étude, nous avons déterminé le rôle de NEAT2 et de ses domaines fonctionnels dans la prolifération et le métabolisme énergétique des hépatocytes. La prolifération était diminuée significativement (14-35%) lorsque l’expression de NEAT2 a été rendue génétiquement faible ou inexistante dans les modèles d’hépatocytes humains et de fibroblastes embryonnaires de souris. À l’opposé, la prolifération cellulaire était significativement augmentée (27-33%) dans les hépatocytes murins surexprimant les segments NEAT2 et mascRNA. Le domaine mascRNA entraîne également une augmentation significative de l’entrée de glucose dans la cellule. En somme, ces résultats démontrent l’importance de mascRNA dans la prolifération cellulaire et le métabolisme du glucose des hépatocytes. / NEAT2 is a long ncRNA overexpressed in a various type of cancer. However, whether NEAT2 directly impacts on carcinogenesis remains poorly investigated. Here, we report the role of NEAT2 and its functional domains on proliferation and energy metabolism of hepatocytes. In this study, we show a significant decrease in proliferation (14-35%) after knocked-down or knockout of NEAT2 expression in both human hepatocytes and mouse embryonic fibroblasts. On the other hand, we observed a significant increase in proliferation (27-33%) in mice hepatocytes overexpressing NEAT2 and the mascRNA domain. The overexpression of the mascRNA domain also resulted in a significant increase in cellular glucose uptake, suggesting a role in glucose utilization. Our study highlights the significance of NEAT2 and its mascRNA domain in cellular proliferation and glucose metabolism. These data suggest an important role for the mascRNA domain in the regulation of hepatocyte proliferation by NEAT2.

Le développement embryonnaire est un processus complexe finement régulé spatio-temporellement par de nombreux acteurs, qu’ils soient ADN, ARN ou protéines. De récents résultats suggèrent un rôle clef dans le développement et les maladies pour une sous-catégorie des ARNs impliqués dans ces mécanismes, les longs ARNs non-codants (lncRNAs). Caractérisés par leur incapacité à produire des protéines, ils sont difficiles à étudier par leur manque de conservation en séquence et leur expression tissu-spécifique. Ici, nous étudions un lncRNA conservé, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), nécessaire au maintien de l’état pluripotent des cellules souches et essentiel à leur différenciation en neurones. Toutefois, les mécanismes dans lesquels cet ARN est impliqué restent inconnus. Pour y répondre, nous avons analysé des données de séquençage d’ARN de différenciation neuronale d’ESCs murines. Nous avons identifié deux nouvelles isoformes spécifiquement exprimées dans les ESCs, sht.Tuna et alt.Tuna. Cette dernière est le résultat de l’épissage alternatif de l’exon 1 de Tuna. Cet épissage alternatif est également observé chez l’humain, démontrant une conservation du traitement de l’ARN entre la souris et l’Homme. Ces deux isoformes sont plus courtes d’environ 1,5kb à l’extrémité 3’ que le transcrit prédit de Tuna (full.Tuna). En effet, l’isoforme full. Tuna n’a pas pu être détectée dans les ESCs, et la surexpression de sht.Tuna a permis d’améliorer la reprogrammation vers l’état pluripotent. Ceci suggère que le rôle de Tuna est mécanistiquement différent dans les ESCs et les neurones. D’autre part, Tuna présente une région hautement conservée (~200bp) contenant un potentiel cadre de lecture pour un peptide de 48 acides aminés, détectable par surexpression de constructions tagguées FLAG. La mutation du codon AUG de cette séquence codante a abrogé l’effet de l’ARN sur la reprogrammation. Ceci implique un rôle du peptide dans l’acquisition de la pluripotence. Par ailleurs, Tuna a été détecté dans les fractions poly-ribosomales et cytoplasmiques d’ARN, supportant son éventuel potentiel codant. Ensemble, ces résultats démontrent que l’épissage alternatif et le potentiel codant d’un locus propre à un lncRNA est complexe et que cet ARN pourrait avoir de multiples fonctions dépendantes de l’état cellulaire / Embryonic development is a complex process finely regulated in time and place by numerous actors such as DNA, RNA, and proteins. Emerging evidence suggests a key role in development and disease for a subcategory of RNAs implicated in those mechanisms, the long non-coding RNAs (lncRNAs). Characterized by their incapacity to produce proteins, they have proven to be challenging to study due to the lack of sequence conservation and their tissue-specific expression. Here, we focus on a conserved lncRNA, Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA), that is required for maintaining embryonic stem cells (ESCs) in an undifferentiated state but is also essential for their differentiation towards a neuronal cell fate. However, the mechanism behind this dual role remains largely unknown. To address this, we analyzed available RNA-seq data on mouse ESC differentiation towards neurons. We identified two novel isoforms specifically expressed in ESCs, sht.Tuna and alt.Tuna. The latter isoform was the result of alternative splicing of the exon 1 of Tuna. This alternative splicing was also observed in human ESCs demonstrating a conserved processing of the RNA between mouse and human cells. Both new isoforms were ~1.5kb shorter at the 3'-end than the predicted full transcript of Tuna (full.Tuna). In fact, we failed to detect the full.Tuna isoform in ESCs, and overexpression of sht.Tuna isoform enhanced reprogramming to a pluripotent stem cell state. This suggests that the role of Tuna is mechanistically different in ESCs than in neurons. Besides, Tuna also contains a highly conserved region (~200bp) harboring a predicted 48-amino-acids coding sequence that is detectable upon overexpression if FLAG-tagged. Mutating the start codon of this peptide's coding sequence abrogated the enhanced reprogramming effect. This infers a role for the peptide in the acquisition of a pluripotent state. Moreover, Tuna was detected in poly-ribosomal and cytoplasmic RNA fractions further supporting a peptide coding potential. Taken together, our results demonstrate that alternative splicing and coding potential of a particular lncRNA locus is complex and that a lncRNA may have multiple functionality depending on cell state.

On sait maintenant depuis quelques décennies que seule une petite fraction du génome est constituée de séquences codantes pour des protéines et que la majorité de l'ADN non codant, jadis considéré comme « poubelle », assure d'importantes fonctions biologiques. Avec ce nouveau paradigme, notre perception de l'expression et la régulation génique est passée d'une vision axée sur les protéines à une vision plus centrée sur les ARN, tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. L'avènement des techniques de séquençage à haut débit comme le RNA-Seq (séquençage ARN) a fortement contribué à la démystification de cette partie « non codante » de l'ARN. Outre le triumvirat de gènes d'ARNt, d'ARNr et d'ARNm, les génomes abritent de nombreux loci qui codent pour de petits ARN régulateurs non canoniques repartis dans de nombreuses classes. Les microARN (miARN) et les fragments dérivés des ARNt (tRFs) sont les deux classes de petits ARN non codants (ARNnc) les plus abondants et partageant des similarités dans leurs mécanismes. Bien que souvent éclipsés par les protéines, ils sont au cœur de la régulation post-transcriptionnelle et sont des acteurs émergents de la relation hôte-pathogène. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans ce thème et traitent des relations hôtes-pathogènes sous l'angle des petits ARNnc à travers deux projets (#1 et #2) complémentaires qui ambitionnent d'apporter une lecture et des perspectives nouvelles. Dans le projet #1, nous avons travaillé avec le virus à ARN Ebola (EBOV), un agent pathogène connu pour provoquer une fièvre hémorragique mortelle, qui a été responsable de plusieurs épidémies en Afrique et demeure encore aujourd'hui une menace pour la santé publique mondiale. En combinant RNA-Seq, PCR quantitative et analyses computationnelles, nous avons obtenu le premier transcriptome détaillé des miRNA (miRNome) d'une lignée de cellules hépatiques humaines infectées par l'une des trois souches variantes de EBOV dont Mayinga, Makona et Reston. Lors de l'infection par EBOV, il y'a une expression différentielle de seulement 1/5 du miRNome de l'hôte au cours du temps avec une modulation spécifique des miR-122-5p, miR-148a-3p et miR-21-5p. Les données obtenues mettent en relief, au-delà des manifestations cliniques jusque-là connues, de nouvelles différences substantielles entre les souches vis-à-vis de leur effet sur le miRNome. Dans une seconde phase, avec la même approche, nous avons découvert, caractérisé et validé deux miARN viraux codés par les génomes EBOV (Mayinga et Makona). Ces deux miARN viraux peuvent potentiellement cibler des gènes impliqués dans le phénotype hémorragique, la régulation de la réplication virale et la modulation de la défense immunitaire de l'hôte. Le projet #2 s'inscrit dans un contexte où nous avions découvert fortuitement l'existence d'espèces d'ARN inférieures à 16 nt (appelés ici vsRNA pour very small RNA) qui s'avèrent fonctionnels chez les eucaryotes alors qu'ils étaient souvent retirés des jeux de données de séquençage, car considérés comme étant des « produits de dégradation ». Nous avons étendu notre analyse RNA-Seq aux bactéries pour caractériser les vsRNAs de Escherichia coli K-12 MG1655 et cinq autres souches bactériennes. L'étude est complétée par l'analyse des vésicules dérivées de la membrane externe (Outer Membrane Vesicles ; OMVs) produites par E. coli K-12 MG1655 en raison de leurs rôles déterminants pour améliorer des chances de survie, la régulation des interactions microbiennes et la promotion de la pathogenèse. Les résultats montrent l'existence de vsRNAs variés et très abondants avec les tRFs comme un biotype majeur, notamment ceux dérivés de l'ARNt isoleucine (Ile-tRF). En guise de preuve de concept de la fonctionnalité de ces vsRNAs de type tRFs, nous avons étudié en détail le très abondant et thermodynamiquement stable Ile-tRF. Nos analyses montrent qu'il est modulé sélectivement par le stress environnemental et peut être transféré via les OMVs (où il est particulièrement enrichi) aux cellules humaines HCT116 où il favorise l'expression des ARNm codant pour des membres de la famille des MAP-kinase. Notre étude est la toute première chez E. coli à rapporter l'existence de tRF abondants, trouvés dans des vésicules (OMVs) et assumant des fonctions potentielles chez l'hôte. L'Ile-tRF est également le premier tRF fonctionnel de 13 nt rapporté chez les bactéries. / For several decades now, it has been known that only a small fraction of the genome is made up of protein-coding sequences and that the majority of non-coding DNA, historically considered as "junk", carries out important biological functions. With this new paradigm, our perception of gene expression and regulation has shifted from a protein-centered view to a more RNA-centered view in both prokaryotes and eukaryotes. The advent of high-throughput sequencing techniques such as RNA sequencing (RNA-Seq), has strongly contributed to the demystification of this "non-coding" part of RNA. Besides the triumvirate of tRNA, rRNA, and mRNA genes, genomes harbor numerous loci that encode small non-canonical regulatory RNAs distributed in many classes. MicroRNAs (miRNAs) and tRNA-derived fragments (tRFs) are the two most abundant classes of small non-coding RNAs (ncRNAs) and share similarities in their mechanisms. Although often overshadowed by proteins, they are at the heart of post-transcriptional regulation and are emerging players in the host-pathogen relationship. This thesis addresses the host-pathogen relationship from the perspective of small ncRNAs through two complementary projects (#1 and #2) that aim to provide new insights and perspectives. In project #1, we worked with the Ebola RNA virus (EBOV), a pathogen known to cause a deadly hemorrhagic fever, which has been responsible for several epidemics in Africa and remains a global public health concern to this day. By combining RNA-Seq, quantitative PCR and computational analyses, we obtained the first detailed miRNA transcriptome (miRNome) of a human liver cell line infected with one of the three variant strains of EBOV including Mayinga, Makona and Reston. During EBOV infection, there is a differential expression of only 1/5 of the host miRNome over time with specific modulation of miR-122-5p, miR-148a-3p and miR-21-5p. The data obtained highlight, beyond the previously known clinical manifestations, substantial new differences between the strains with respect to their effect on the miRNome. In a second phase, using the same approach, we discovered, characterized and validated two viral miRNAs encoded by the EBOV genomes (Mayinga and Makona). These two viral miRNAs can potentially target genes involved in the hemorrhagic phenotype, the regulation of viral replication and the modulation of host immune defense. Project #2 was developed in a context where we had fortuitously discovered the existence of RNA species smaller than 16 nt (called here vsRNA for very small RNA) that were functional in eukaryotes but were often removed from sequencing datasets because they were considered as "degradation products". We have extended our RNA-Seq analysis to bacteria in order to characterize vsRNAs from Escherichia coli K-12 MG1655 and five other bacterial strains. The study is completed by the analysis of Outer Membrane Vesicles (OMVs) produced by E. coli K-12 MG1655 because of their critical roles in enhancing survival, regulating microbial interactions and promoting pathogenesis. The results show the existence of diverse and highly abundant vsRNAs with tRFs as a major biotype, especially those derived from isoleucine tRNA (Ile-tRF). As a proof of concept of the functionality of these tRF-like vsRNAs, we have studied in detail the highly abundant and thermodynamically stable Ile-tRF. Our analyses show that it is selectively modulated by environmental stress and can be transferred via OMVs (where it is particularly enriched) to human HCT116 cells where it promotes the expression of mRNAs encoding members of the MAP-kinase family. Our study is the first ever in E. coli to report the existence of abundant tRFs found in vesicles (OMVs) with potential functions in the host. Ile-tRF is also the first functional 13 nt tRF reported in bacteria.

Le cholangiocarcinome intra hépatique (CCI) est une tumeur hépatique primitive développée aux dépens des canaux biliaires. Son pronostic est mauvais avec les traitements actuels qui augmentent peu la survie des patients. Sa cancérogénèse est complexe impliquant de nombreuses voies de signalisation dont la voie TGFβ. L’hypothèse du projet est l’implication des ARN longs non-codants (ARNlnc) comme médiateurs de la voie TGFβ dans le développement du CCI. Les objectifs de notre travail étaient d’identifier des ARNlnc régulés par le TGFβ et potentiels biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques. Nous avons identifié une signature transcriptomique spécifique du TGFβ après stimulation de lignées cellulaires de CCI. Parmi les nouveaux gènes cibles, plusieurs ARNlnc ont été identifiés dont CASC15 renommé TLINC pour TGFβ-induced long intergenic non-coding RNA. TLINC aurait un rôle dans le remodelage du microenvironnement impliqué dans la cancérogénèse du CCI notamment par la régulation de l’IL8. Ce rôle pourrait s’exercer par l’interaction avec d’autres ARNlnc déjà identifiés dans le CCI e.g. NEAT1. TLINC est surexprimé dans les tumeurs humaines de CCI et pourrait constituer un biomarqueur diagnostique. Des isoformes circulaires de TLINC mises en évidence dans les tumeurs pourraient être détectables dans le sérum et constituer des biomarqueurs non invasifs. L’analyse transcriptomique d’une cohorte de patients divisée en 2 sous-groupes de pronostic différent a identifié une signature d’ARNlnc prédictive de la survie. L’ARNlnc ANRIL, déjà connu dans d’autres cancers, est un des ARNlnc qui pourrait constituer un biomarqueur pronostique. / Intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) is a primary liver tumor developed from bile ducts. ICC prognosis is poor with current treatments that slightly increase patient survival. ICC carcinogenesis is complex and involves multiple signaling pathways including TGFβ pathway. Our hypothesis relies on the involvement of long non-coding RNA (lncRNA) as mediators of TGFβ pathway in the development of ICC. The aim of the study was to identify and to characterize TGFβ regulated lncRNA as ICC potential diagnostic or prognostic biomarkers. We identified a specific transcriptomic signature after stimulation of ICC cell lines with TGFβ. Among the novel TGFβ target genes, several lncRNAs were identified including CASC15 renamed TLINC standing for TGFβ-induced long intergenic non-coding RNA. TLINC may play a role in the remodeling of an inflammatory microenvironment involved in ICC carcinogenesis, including the regulation of IL8. This role could be exerted by the interaction with other lncRNAs already identified in the ICC e.g. NEAT1. TLINC is overexpressed in human ICC tumors and may represent a relevant diagnostic biomarker. Circular isoforms of TLINC found in tumors may be detectable in serum and be noninvasive biomarkers. Transcriptomic analysis of tumors from a cohort of patients divided into 2 prognostic groups identified a lncRNAs signature predictive for survival. LncRNA ANRIL, already known to be upregulated in other cancers, is one of the lncRNAs that could be a prognostic biomarker in ICC.

L'étude des éléments cis et trans intervenant dans le métabolisme des ARN SINE a pour but de mieux appréhender la biologie des éléments mobiles SINE. Nous avons d'une part déterminé la structure secondaire des ARN des SINE de plante SB1 et SB2. Ces deux ARN qui n'ont pas d'homologie de séquence adoptent des structures secondaires similaires. Suite à cette observation, une étude menée par F.J. Sun et al. a mis en évidence un schéma évolutif commun des ARN SINE dérivés d'ARNt. Dans le cadre de la recherche de facteurs trans, nous avons entrepris la caractérisation de la protéine La, un facteur de liaison à l'ARN. Nous avons identifié chez Arabidopsis deux protéines présentant toutes les caractéristiques de la protéine La : At32 et At79. Nous avons montré que seule At32 assure les fonctions nucléaires de la protéine La. At32 et At79 ont des profils d'expression différents et semblent lier des ARN distincts. Nous proposons donc qu'il existe deux homologues de la protéine La Chez Arabidopsis

Les particules ribonucléoprotéiques (ou RNP) sont à la base de nombreuses fonctions cellulaires fondamentales. La formation de ces particules RNP est un processus très complexe qui nécessite de nombreuses étapes de maturation et de multiples facteurs d'assemblage. Par ailleurs, une structure correcte des particules RNP est essentielle à leur fonction. Il est donc critique de comprendre comment ces particules sont formées dans la cellule. Au cours de ma carrière, je me suis intéressée à plusieurs aspects de ces mécanismes.<br /> Au cours de ma thèse dirigée par Chantal Ehresmann (1990-1994), dans l'équipe de Bernard Ehresmann (UPR 9002 du CNRS) j'ai étudié le mode d'interaction de la protéine ribosomique S8 sur l'ARNr 16S d'E. coli. <br /> Mon travail post-doctoral dans l'équipe de David Tollervey (EMBL, Heidelberg (1994-1996) et Université d'Edimbourg (1996-2001) a porté sur l'étude des mécanismes de maturation, d'assemblage et de dégradation de diverses RNP. J'ai notamment contribué à la caractérisation de l'exosome, un complexe d'exonucléases 3'->5' impliqué dans la maturation et la dégradation de divers ARN chez la levure. J'ai également étudié le rôle de protéines chaperons dans la biogenèse des snoARN (biogenèse des ribosomes), des ARN ribosomiques et des ARNt. <br />En 2001, j'ai été recrutée au grade de chargée de recherche au CNRS dans l'équipe d'Alain Krol où nous étudions les mécanismes de synthèse des sélénoprotéines. L'incorporation de sélénocystéine dans les sélénoprotéines fait appel au recodage co-traductionnel d'un codon UGASec en phase. Chez les eucaryotes, ce mécanisme implique l'assemblage d'un complexe ARN-protéine au niveau d'une structure en tige-boucle ou ARN SECIS (Selenocysteine Insertion Sequence) située dans la région 3' non codante de l'ARNm des sélénoprotéines. La protéine SBP2 se fixe spécifiquement à l'ARN SECIS et recrute les facteurs de la machinerie de biosynthèse. Elle fait également partie de complexes supramoléculaires dans le cytoplasme et le noyau, suggérant un possible assemblage nucléaire de la mRNP SECIS. Nous avons montré que la protéine SBP2 présentait une origine évolutive commune avec des protéines de la famille L7Ae. Ces protéines partagent un domaine de liaison à l'ARN similaire et participent à la construction de plusieurs RNP essentielles telles les sous-unités ribosomiques, les snoRNP (biogenèse des ribosomes), les snRNP (épissage), et les mRNP codant pour les sélénoprotéines. Nos objectifs sont d'élucider les principes d'interaction SBP2/SECIS, d'identifier les composants moléculaires des complexes qui se forment autour du SECIS et de comprendre leur assemblage.<br />En collaboration avec Edouard Bertrand (Montpellier) et Bruno Charpentier et Christiane Branlant (Nancy) nous avons identifié une machinerie d'assemblage des RNP L7Ae conservée de la levure à l'homme et d'importance fondamentale pour la cellule. Elle est constituée d'une protéine adaptatrice et d'un complexe de protéines chaperons. Notre objectif est de comprendre son rôle dans l'assemblage des mRNP de sélénoprotéines.

La machinerie d'assemblage HSP90/R2TP est impliquée dans la biogenèse de complexes essentiels à l'expression génique et à la croissance cellulaire. Le complexe est constitué des protéines PIH1D1, RPAP3 et des AAA+ ATPases RVB1 et RVB2. Le R2TP, via son adaptateur NUFIP, permet l'assemblage de complexes ribonucléoprotéiques tels que les snoRNP à boîtes C/D, et le snRNP U4, tous deux impliqués respectivement dans la maturation des ARNr et ARNm. Le mode d'action du R2TP dans ces processus n'était pas bien compris. Pour étudier cela, une approche de protéomique, avec des tests d'interaction ARN/protéine et protéine/protéine, ainsi qu'une approche structurale, ont été utilisés. Un nouveau modèle a ainsi été établi. Le R2TP permettrait de former des pré-complexes d'assemblage contenant les protéines cœurs du complexe RNP avec des facteurs d'assemblage mais sans l'ARN. Les protéines RVB se détacheraient du R2TP pour rester associées à ce pré-complexe d'assemblage, par la suite, elles permettraient de le stabiliser tout en y incorporant de nouvelles protéines cœurs, et en relargant des facteurs d'assemblage ayant déjà accompli leur fonction dans le processus de biogenèse. Cette fonction de chaperon moléculaire des complexes en cours d'assemblage est très probablement régulée par hydrolyse de l'ATP par les ATPases RVB, et ceci sous le contrôle de co-facteurs, comme potentiellement la protéine BCD1. Dans le cas de l'assemblage des C/D snoRNP, il a été établi un modèle d'assemblage dans lequel le rôle des différents facteurs d'assemblage peut être prédit. ZNHIT3 aurait un rôle dans l'incorporation du snoARN naissant dans le pré-complexe, et NUFIP permettrait de garder la particule immature dans une conformation inactive afin de faciliter l'obtention de la structure active du snoRNP grâce aux RVB. Avec les travaux sur la biogenèse de la particule U4, il a été mis en évidence l'existence d'un pré-complexe cytoplasmique contenant PRP31/NUFIP/R2TP/complexe SMN qui serait important pour l'assemblage de la snRNP U4 avec non seulement les protéines Sm, mais aussi la protéine PRP31. / The HSP90/R2TP machinery is involved in the biogenesis of essential complex for gene expression and cell growth. The complex consists of proteins PIH1D1, RPAP3 and the AAA+ ATPases RVB1 and RVB2. The R2TP, via its NUFIP adaptator, allows assembly of ribonucleoprotein complexes like box C/D snoRNP, and the U4 snRNP, both involved in the maturation of mRNA and rRNA respectively. The mode of action of R2TP in these processes is not well understood. In this study, a proteomic approach, with tests of interaction RNA/protein and protein/protein and a structural approach, were used. A new model has been established. The R2TP would form an assembly pre-complex containing RNP core proteins with assembly factors but not RNA. RVB proteins detach from R2TP to remain associated with the assembly pre-complex, and then, would stabilize it while incorporating new core proteins. They would also release assembly factors that already have accomplished their function in the biogenesis process. This function of molecular chaperone complex during assembly is most likely regulated by ATP hydrolysis by the RVB ATPases, and this under the control of co-factors as potentially BCD1 protein. In the case of the assembly of box C/D snoRNP, it was established an assembly model in which the roles of the various assembly factors can be predicted. ZNHIT3 has a role in the incorporation of the nascent snoRNA in the pre-complex and NUFIP would keep the immature particle into an inactive conformation to facilitate the formation of the active structure of the snoRNP through RVB. With the study of the biogenesis of the U4 particle, it was revealed the existence of a cytoplasmic pre-complex containing PRP31/NUFIP/R2TP/SMN complex that would be important for the assembly of the U4 snRNP with not only Sm protein but also the PRP31 protein.

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique. / In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome.