S. aureus est une bactérie pathogène opportuniste de l’homme qui pose un grave problème de santé publique. Le pouvoir pathogène de S. aureus est conféré par un très grand nombre de facteurs de virulence, dont l’expression est finement régulée à de multiples niveaux. Les effecteurs de cette régulation sont à la fois des protéines et des ARN non codants (ARNnc) aussi appelés ARN régulateurs. Je me suis concentré au cours de ma thèse sur la classe majoritaire qui sont les ARNnc qui régulent la traduction d’ARNm. Ils sont impliqués dans de complexes réseaux de régulation qui permettent de contrôler la physiologie de la cellule ainsi que sa virulence. Pour élargir nos connaissances de ces réseaux, j’ai développé deux approches méthodologiques, appelées MAPS et Grad-seq, que j’ai appliquées in vivo chez S. aureus en utilisant RsaA et RsaC comme modèles. L’application du MAPS a permis d’identifier de nouvelles cibles directes pour RsaA et des cibles potentielles pour RsaC. L’approche Grad-Seq est un outil puissant mais demande encore des ajustements. J’ai également pu déterminer un rôle probable pour l’ARNnc RsaC dans la régulation de l’homéostasie oxydo-réductive de S. aureus, en lien avec la résistance au stress oxydatif et avec la persistance lors de l’internalisation par les ostéoblastes. / S. aureus is an opportunistic pathogen of the human species which can express a large array of virulence factors whose expression is under tight regulation at multiple levels. The regulation can be done by proteins and by particular molecules of RNA called non-coding RNA (ncRNA). I focused during my thesis on the main category of ncRNA in S. aureus, which are regulating the translation of mRNA. These ARNs are involved in complex regulatory networks, impacting the physiology of the bacterial cell and its virulence. To understand further these networks, I developped two methodological approaches in vivo in S. aureus, called MAPS and Grad-seq, which were applied using RsaA and RsaC as models of studies. MAPS allowed to find new direct targets of RsaA and plausible targets for RsaC. The Grad-Seq method showed to be a powerful tool but still needs refinements. I also could determine a possible role for RsaC in the regulation of oxydo-reductive homeostasis, in direct link with oxydative stress resistance and persistance during internalisation by osteoblasts.

Les ARNnc sont impliqués dans la régulation de l’expression de gènes chez les Procaryotes, les Archées et les Eucaryotes. Cette régulation peut être effectuée au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Elle fait parfois intervenir des modifications des histones comme la méthylation ou l’acétylation. J’ai étudié le gène TIR1 dont l’expression est fortement réduite lorsqu’un ARNnc codant antisens nommé TIR1axut est stabilisé. J’ai montré que cette régulation est dépendante de l’histone déacétylase Hda1. De plus, j’ai montré que l’acétylation de H3K14 et H3K18 ne sont pas directement impliquées dans la régulation de TIR1 mais qu’un résidu polaire est nécessaire pour la répression de TIR1 en présence de l’ARNnc antisens. En outre, j’ai mis en évidence que la répression de TIR1 par son XUT est en parti post-transcriptionnel, mais ne fait pas varier la stabilité de l’ARNm. Finalement, j’ai tenté en vain de comprendre le ciblage de l’activité histone déacétylase de Hda1 le long de TIR1 en cherchant la présence d’hybride ARN/ADN grâce à un anticorps reconnaissant ce type de structure. / NcRNAs are involved in gene regulation in Prokaryotes, Eukaryotes and Archaea. This regulation could be transcriptional or post-transcriptional. Histone modifications could be involved such as methylation or acetylation. I studied TIR1 gene whose expression is highly reduced when an antisense ncRNA called TIR1axut is stabilized. I showed that this regulation is Hda1-dependant. In addition to that, I showed that H3K14ac and H3K18ac are not directly responsible for TIR1 repression but a polar residue is required for a proper silencing of TIR1 in a XUT depending manner. Moreover, I showed that TIR1 repression is due to a post-transcriptional effect but does not affect mRNA stability. Finally, I tried in vain to understand Hda1 targeting on TIR1 searching for RNA/DNA hybrids using an antibody that recognizes such structures.

Chez les eucaryotes, le génome est organisé en chromatine, une structure nucléoprotéique essentielle pour la régulation de l’expression génique ainsi que pour le maintien de la stabilité du génome. Les ciliés sont d’excellents organismes modèles pour étudier les mécanismes généraux qui maintiennent l’intégrité du génomes eucaryote. Chez Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par des événements massifs et reproductibles d’élimination d’ADN. D’une part, des éléments répétés (transposons,régions minisatellites), de plusieurs kilobases de long, sont imprécisément éliminés.D’autre part, 45000 séquences courtes et uniques, appelées IES, sont précisément éliminées au nucléotide près. Une classe de petits ARN, appelé scnRNAs, est impliquée dans la régulation epigénétique de l’élimination d’ADN, mais comment les scnRNA contrôlent l’élimination d’ADN reste mystérieux. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle une organisation particulière de la chromatine, en particulier des modifications post-traductionelles des histones associées à des formes répressives de la chromatine, est impliquée dans le processus d’élimination d’ADN. Nous avons montré que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 9 et la lysine 27 (H3K9me3 et H3K27me3)apparaît transitoirement dans le noyau somatique en développement au moment où se produisent les événements d’élimination d’ADN. Nous avons identifié la protéine de type Polycomb, Ezl1, et montré qu’elle est une histone methyltransferase qui présente une dualité de substrat et catalyse à la fois la mise en place de K9me3 et K27me3 sur l’histone H3. Nous avons montré que la déposition de H3K9me3 et H3K27me3 dans le noyau en développement requiert les scnRNAs. Des analyses de séquençage haut débit ont montré que Ezl1 est requise pour l’élimination des longues séquences répétées germinales, suggérant que les scnRNA guident la déposition des marques d’histones au niveau de ces séquences. Au contraire des régions répétées du génome, les IES montrent une sensibilité différente aux scnRNAs et à Ezl1, suggérant que plusieurs voies partiellement chevauchantes sont impliquées dans leur élimination. Notre étude montre que des caractéristiques intrinsèques des séquences d’ADN, telles que leur taille, peut contribuer à la définition des séquences germinales à éliminer. De manière intéressante, nous avons aussi montré que Ezl1 est requise pour la répression transcriptionnelle des éléments transposables. Nous suggérons que les voies H3K9me3et H3K27me3 coopèrent et contribuent à préserver le génome somatique de Paramecium des parasites génomiques. / Eukaryotic genomes are organized into chromatin, a complex nucleoprotein structureessential for the regulation of gene expression and for maintaining genome stability.Ciliates provide excellent model organisms with which to gain better understandinginto the regulation of genome stability in eukaryotes. In the ciliate Parameciumtetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome ischaracterized by massive and reproducible programmed DNA elimination events. Longregions of several kilobases in length, containing repeated sequences and transposableelements are imprecisely eliminated, whereas 45,000 short, dispersed, single-copyInternal Eliminated Sequences (IESs) are precisely excised at the nucleotide level. Aspecific class of small RNAs, called scnRNAs, is involved in the epigenetic regulation ofDNA deletion. How scnRNAs may guide DNA elimination in Paramecium remains tobe discovered. Here, we investigated whether chromatin structure, in particular histonepost-translational modifications known to be associated with repressive chromatin,might control DNA elimination. We showed that trimethylated lysine 9 and 27 onhistone H3 (H3K9me3 and H3K27me3) appear in the developing somaticmacronucleus when DNA elimination occurs. We identified the Polycomb-groupprotein, Ezl1, and showed that it is a dual histone methyltransferase that catalyzes bothH3K9me3 and H3K27me3 in vitro and in vivo. Genome-wide analyses show thatscnRNA-mediated H3K9me3 and H3K27me3 deposition is necessary for theelimination of long, repeated germline DNA. Conversely, single copy IESs displaydifferential sensitivity to depletion of scnRNAs and Ezl1, unveiling the existence ofpartially overlapping pathways in programmed DNA elimination. Our study revealsthat cis-acting determinants, such as DNA length, also contribute to the definition ofgermline sequences to delete. We further showed that Ezl1 is required fortranscriptional repression of transposable elements. We suggest that H3K9me3 andH3K27me3 pathways cooperate and contribute to safeguard the Paramecium somaticgenome against intragenomic parasites.

Répression des genes par le dépôt de la marque H3K27me3. Divers cofacteurs contrôlent sa fonction dans des cellules de différentes origines, comme les gametes. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des modèles murins ou un tag a été introduit dans les gènes Ezh2 et Ezh1, j'ai isolé des extraits nucléaires de testicules adultes entiers et identifié un nouveau polypeptide interagissant avec PRC2. Ce dernier est spécifiquement exprimé dans les gonades et sa fonction est inconnue. J'ai confirmé son interaction avec PRC2 et montré qu'il pourrait recruter PRC2 à la chromatine. Grâce à un modèle de souris knock-out, j'ai démontré que la protéine est nécessaire pour la fertilité féminine, alors que son ablation apporte une augmentation globale de la marque associée à PRC2, dans les cellules germinales masculines avec peu de conséquences sur la fertilité. J'ai également contribué à la caractérisation de l'interaction entre le long ARN non-codant HOTAIR et PRC2. Nombreux ARNnc ont été proposés pour moduler l'action des complexes modifiant la chromatine. Avec l'aide d'un nouveau système de recrutement artificiel d'ARN, l'expression induite par HOTAIR provoque une répression transgénique indépendamment de PRC2. La surexpression forcée de HOTAIR a également peu d'impact sur le transcriptome dans des cellules cancéreuses. En conclusion, la liaison PRC2 à l'ARN n'est pas requise pour le ciblage de la chromatine. / The Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) plays an essential role in development by maintaining gene repression through the deposition of H3K27me3. A variety of cofactors have been shown to control its function in cells of various origins however little is known about PRC2 regulation during gametogenesis. During my PhD, I took advantage of murine models where Ezh2 and Ezh1 were knocked-in, I isolated nuclear extracts from whole adult testis and, identified a new polypeptide interacting with PRC2. This protein is specifically expressed in gonads, is of unknown function and does not contain any conserved domain. I have confirmed its interaction with PRC2, identified the domain of interaction with PRC2 and shown that it could tether PRC2 to chromatin. Thanks to a knockout mouse model, I demonstrated that the protein is required for female fertility, whereas its ablation brings to a global increase of H3K27me3 PRC2-associated mark in male germ cells with little consequences on male fertility. I also contributed to the characterization of the interplay between the long non-coding RNA (lncRNA) HOTAIR and PRC2 complex. Many lncRNAs have been proposed to modulate chromatin-modifying complexes action on chromatin. With the help of novel RNA-tethering system, HOTAIR inducible expression causes transgene repression independently from PRC2. Forced overexpression of HOTAIR also has little impact on transcriptome in breast cancer cells. Generally, PRC2 binding to RNA is not required for chromatin targeting. Taken together these results shed light to the mechanism of a new-identified cofactor regulating PRC2 in the gonads and contribute to dissect PRC2-RNA relationship at molecular level.

Le phénomène d'empreinte génomique parentale se traduit par une expression différentielle des deux allèles de certains gènes, en fonction de leur origine parentale. Nos travaux ont abouti à la découverte de nombreux gènes de petits ARN non-codants de Mammifères (ARN C/D et microARN) soumis à l'empreinte génomique parentale, et à une première caractérisation de leur expression. Alors que la plupart des ARN C/D participent à la biogenèse des ARN ribosomiques et des petits ARN nucléaires, ceux que nous décrivons en semblent incapables ; les microARN, quant à eux, sont habituellement des répresseurs post-transcriptionnels de gènes spécifiques : parmi les microARN que nous décrivons, deux pourraient ainsi réprimer un rétrotransposon. Les fonctions éventuelles de ces gènes de petits ARN non-codants (dans le contrôle du développement, la répression de ce rétrotransposon, et le mécanisme de l'empreinte génomique parentale) sont discutées.

Chez les métazoaires, la mobilisation des éléments transposables est régulée par de petits ARN non codants appelés piARN pour "PIWI interacting RNA". Cette répression est très étudiée dans la lignée germinale adulte où elle est particulièrement efficace. Néanmoins, la mobilisation de ces éléments doit être régulée tout au long du développement de la lignée germinale, qui transmet l’information génétique à travers les générations. Durant ma thèse, j’ai utilisé le modèle D. melanogaster pour étudier la répression des éléments transposables au cours du développement de la lignée germinale femelle. J’ai ainsi pu montrer qu’une répression fonctionnelle par les piARN existe dès la fin de l’embryogenèse et que les gènes liés à la régulation chez l'adulte sont également nécessaires pour la répression au cours du développement. L’analyse de données de séquençage haut débit m’a permis de mettre en évidence la production de novo de piARN fonctionnels dans les gonades en formation. De plus, comme dans les ovaires adultes, j'ai pu remarquer une répression incomplète, ressemblant à la variégation, à tous les stades du développement. Des expériences de lignage cellulaire suggèrent fortement qu'une mémoire épigénétique précoce est initiée dans les cellules germinales embryonnaires et maintenue jusqu'au stade adulte. L'implication de l'Heterochromatin Protein 1a (HP1a) dans la production des piARN télomériques montrée par séquençage des piARN pourrait expliquer ce phénomène . Les données présentées ici montrent que piARN et leurs partenaires protéiques sont les composants d'un système de répression épigénétique continu tout au long de la vie des cellules germinales. / In metazoan germ cells, transposable element activity is repressed by small noncoding PIWI-associated RNAs (piRNAs). Numerous investigations in Drosophila have enlightened the mechanism of this repression in the adult germline. However, very little is known about piRNA-mediated repression during germline development. Nevertheless, to maintain the integrity of the genome, repression should occur throughout the lifespan of germ cells. During my PhD, I show that piRNA-mediated repression is active in the female germline, from late embryonic to pupal primordial germ cells, and that genes related to the adult piRNA pathway are required for repression during development. rhino-dependent piRNAs, exhibiting the molecular signature of the piRNA pathway "ping-pong" amplification step, are detected in larval gonads, arguing for de novo biogenesis of functional piRNAs during development. I also show that production of telomeric piRNAs depends on Heterochromatin Protein 1a (HP1a). Furthermore, as in adult ovaries, I observe an incomplete, bimodal and stochastic repression resembling variegation at all developmental stages. Clonal analyzes of this incomplete silencing strongly suggest that a cellular memory of an early repression decision is initiated in embryonic germ cells and further maintained until the adult stage. Taken together, the data presented here show that piRNAs and their associated proteins are epigenetic components of a continuous repression system throughout germ cell development.

Parmi les petits ARN non codants, les fragments dérivant d’ARNt (tRF) ont été identifiés dans tous les embranchements de la vie. Cependant, très peu de donnée existe sur les tRF de plantes. Les populations de tRF issues de plusieurs banques de petits ARN (différents tissus, plantes soumises à des stress abiotiques, ou fractions immunoprécipitées avec la protéine ARGONAUTE1) ont été analysées. Les populations sont essentiellement constituées de tRF-5D ou des tRF-3T (clivage dans la boucle D ou T respectivement) et elles varient d’une banque à l’autre. Par une approche in silico suivie de tests de clivage in vitro, des RNases T2 d’A. thaliana (RNS) ont été identifiées comme étant capables de cliver les ARNt dans la région de l’anticodon, de la boucle D et de la boucle T. Lors de l’étude de l’expression des RNS, nous avons observé que deux d’entre elles sont fortement exprimées à un stade de maturation tardif des siliques. Ainsi, la population en tRF issue de stades de développement avancés des siliques a été analysée. Des expériences de carences en phosphate nous ont permis de démontrer l’implication d’une des RNS dans la genèse de tRF dans A. thaliana. Au final, nos données ouvrent de nouvelles perspectives quant à l’implication des RNS et des tRF comme des acteurs majeurs dans l’expression des gènes chez les plantes. / Among the small ncRNAs, tRNA-derived RNA fragments (tRFs) were identified in all domains of life. However, only few data report on plants tRFs. Short tRF were retrieved from A. thaliana small RNA libraries (various tissues, plants submitted to abiotic stress or argonaute immunoprecipitated fractions). Mainly tRF-5D or tRF-3T (cleavage in the D or T region respectively) were found, and fluctuations in the tRF population were observed.Using in vitro approaches, A. thaliana RNase T2 endoribonucleases (RNS) were shown to cleave tRNAs in the anticodon region but also in the D or T region. Through a whole study of RNS expression, we show that two RNS are also strongly expressed in the siliques at a late stage of development. Thus, we analyzed the tRF population of this particular developmental stage. Upon phosphate starvation, we demonstrate also the implication of one RNS in the production of tRFs in planta. Altogether, our data open new perspectives for RNS and tRFs as major actors of gene expression inplants.

Les TAS (Telomeric Associated Sequences) sont des régions sub-télomériques répétées non codantes formant un locus hétérochromatique chez Drosophila melanogaster. Il existe deux grandes familles de TAS, les TAS-R et les TAS-L possédant une structure et des propriétés différentes. Durant cette thèse, j'ai montré que les TAS dériveraient d'une séquence commune appelée TLL rapprochant ainsi les TAS-R et les TAS-L. Par ailleurs, une étude des populations de drosophiles récoltées récemment dans la nature a permis de montrer qu'il existe une pression de sélection pour la présence du TAS-X dans ces souches alors que celui peut être perdu quand les drosophiles sont maintenues dans les laboratoires pendant plusieurs générations. Le TAS-X pourrait avoir un rôle différent dans la nature. Par ailleurs, j'ai montré que les locus TAS permettent l'établissement de la répression des séquences qui s'y insèrent par la transmission de ses propriétés épigénétiques. Ce type de mécanisme pourrait être généralisé aux autres locus producteurs de piRNA du génome qui assurerait ainsi la répression d'un nouvel élément qui arriverait dans une " trappe génomique ". / TAS (Telomeric Associated Sequences) are heterochromatic subtelomeric region made of non coding repeated sequences in Drosophila melanogaster. There are two TAS families : TAS-R and TAS-L, with different structures and properties. In this study, we are showing that the TAS could have derived from a common sequence called TLL suggesting that TAS-R and TAS-L are more related than previously thought. Moreover, analysis of drosophila populations recently collected from the wild have shown that there is selection pressure for the presence of TAS-X in those lines, while this locus can be lost when flies are maintened in laboratory conditions for several generations. Thus TAS-X could have a special role in the wild. I have also shown that TAS loci transfer their epigenetic properties to the sequences that land in their loci, thereby establishing their repression. This kind of mechanism could be generalized to the other genomic piRNA producing loci that would ensure the repression of a novel element landing in a « genomic trap ».

L'environnement des organismes vivants est par définition fluctuant, toutes variations aléatoires du milieu de vie constituent un stress pour les cellules. Au fil de l'évolution, une forte pression de sélection a façonné le fonctionnement cellulaire jusqu'aux réponses complexes élaborées par les organismes vivants. Mes travaux s'inscrivent autour des mécanismes moléculaires de la réponse au stress et plus particulièrement les stress génotoxiques. La première partie de l'étude décrit finement la réplication de l'ADN en condition de stress réplicatif. Ainsi, nous avons montré que les pools de dNTPs sont limitants pour la progression des fourches de réplication en phase S normale et en stress, et que leurs niveaux conditionnent le programme temporel de réplication. De plus, nous avons mis en évidence un mécanisme d'adaptation au stress réplicatif et aux dommages constitutifs dans des mutants caractérisés par de l'instabilité génétique (CIN) via l'activation du checkpoint de dommage conduisant à l'expansion des pools de dNTPs. Pour finir, nous montrons que l'augmentation des niveaux de dNTPs facilite la réplication en présence de lésions de l'ADN, d'une manière indépendante des ADN polymérases translésionnelles. Le second projet apporte de nouveaux éléments sur le rôle de Crt10 in vivo, préalablement identifié comme un régulateur transcriptionnel des gènes de la Ribonucléotide Réductase (RNR). Nos données indiquent que les mutants crt10Δ ont des niveaux de dNTP similaires à ceux des cellules sauvages, et que cette mutation a un très faible impact sur l'expression des gènes RNR, malgré un phénotype de vitesse de progression des fourches accrue. Nous montrons que le mutant crt10Δ est caractérisé par un défaut d'entrée en phase S et d'initiation des origines de réplication. L'origine de ce défaut pourrait résider dans les fonctions de Crt10 impliquant la régulation de la biosynthèse des ribosomes au sein du complexe Rtt101-Mms1. Le troisième projet identifie MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) comme un acteur de la voie de terminaison des ARN non codants. MRX s'associe à des loci recrutant également le complexe de terminaison Nrd1-Nab3-Sen1 à l'échelle du génome entier. L'inactivation de RAD50 se traduit par une perte d'efficacité de terminaison et l'accumulation de transcrits bicistroniques, ainsi qu'une dérégulation du niveau d'ARNs non codants instables (CUT) et de leurs gènes associés. Tout comme Sen1, MRX pourrait intervenir dans la résolution des collisions entre les machineries de transcription et de réplication. / A fluctuating environment is a powerful mean of selection for living organisms, which evolved complex signaling networks to integrate these variations and direct swift and efficient cellular responses. The aim of my work is the identification and characterization of molecular mechanisms involved in the tolerance of replicative stress and DNA damage. First, we show that changes in dNTP pools affect several aspects of replication dynamics in budding yeast. dNTP levels are limiting for normal S-phase progression and determine the temporal program of replication during a replicative stress. Interestingly, we also observed that chromosomal instability (CIN) mutants display expanded dNTP pools due to the constitutive activation of the DNA damage checkpoint. Since increased dNTP levels promote forks progression in the presence of DNA lesions, we propose that CIN mutants adapt to chronic replicative stress by upregulating dNTP pools. Secondly, we bring new lights on the role of Crt10 in vivo, which has been initially identified as a negative regulator of Ribonucleotide Reductase (RNR) genes expression. Deletion of CRT10 neither leads to expanded dNTP pools, nor to a massive deregulation of RNR genes, although crt10Δ cells exhibit faster fork progression. The crt10Δ mutant accumulates at the G1/S transition and exhibits a strong defect of origin firing that could account for its replication phenotype. Moreover, we observed a global decrease in ribosome biogenesis in crt10Δ. The physical interaction of Crt10 with several members of the ribosome biogenesis pathway and its role in the Rtt101-Mms1 complex suggest that Crt10 may regulate ribosome levels in vivo. At last, we identified MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) as a bona fide member of the transcription termination of non-coding RNA (ncRNA). ChIP-seq reveals that MRX localized at the same loci than the Nrd1-Nab3-Sen1 complex in vegetative growth. rad50Δ cells exhibit transcriptional read-through and upregulation of unstable cryptic transcripts (CUTs) leading to a misregulation of their associated gene. Finally, MRX seems to be involved in the resolution of branched structures emanating from collision between transcription and replication machineries, as it is the case for Sen1.

Pseudomonas brassicacearum a la particularité de générer une diversité intraclonale aussi bien in vitro qu'en conditions naturelles dans la rhizosphère de plantes. Ce phénomène de variation phénotypique commun chez les bactéries est un processus d'adaptation aux environnements changeants. Des données de transcriptomique issues de puces à ADN, contenant aussi bien des séquences codantes que non codantes, nous ont permis d'identifier les gènes dont l'expression est altérée et surtout de relier ce phénomène à l'expression d'ARN non codants régulateurs (ARNnc) de type Rsm qui sont sous le contrôle du système à deux composants GacS/GacA. Nous avons montré que des mutations ponctuelles dans les gènes gacS ou gacA sont à l'origine de cette variation phénotypique et que l'expression de l'un des trois gènes rsmX, rsmY ou rsmZ permet de restaurer le phénotype de la souche sauvage. L'importance de ces ARNnc dans la survie de la bactérie aux fluctuations de son environnement est dénotée par la duplication de rsmX en un gène que nous avons nommé rsmX-2, dont la fonction a été validée. Nos données suggèrent une activation exclusive des gènes rsmX-1 et rsmX-2 par GacA et l'intervention de régulateurs additionnels dans le cas de rsmY et rsmZ. Au vu de la redondance fonctionnelle de ces quatre ARNnc, nous avons investigué leur niveau d'expression et leur stabilité dans différentes conditions de culture et montré des différences pour les quatre ARNnc. En réponse à une carence en nutriments, l'expression des ARNnc Rsm est fortement activée et atteint son maximum quand le ppGpp est détecté dans le milieu, suggérant un lien entre le système Gac/Rsm et la réponse « stringente ». / The plant-beneficial bacterium Pseudomonas brassicacearum forms phenotypic variants in vitro as well as in planta during root colonisation under natural conditions. Transcriptome analysis of typical phenotypic variants using microarrays containing coding as well as non-coding DNA fragments showed differential expression of several genes relevant to secondary metabolism and of the small non-coding RNA (ncRNA) genes rsmX, rsmY and rsmZ, which was characterized by down-regulation. Naturally occurring mutations in the GacS/GacA two-component system accounted for phenotypic switching. The importance of these ncRNAs in the survival of the bacteria to changing environments is denoted by the duplication of rsmX gene, which we called rsmX-2 and whose function has been validated. Our data suggest an exclusive activation of rsmX-1 and rsmX-2 genes by GacA and the involvement of additional regulators in the case of rsmY and rsmZ. Given the functional redundancy of these ncRNAs, we investigated their expression level and stability in different culture conditions and showed differences for the four ncRNAs. In response to nutrient depletion, the four ncRNAs expression is strongly activated and reaches its maximum when the ppGpp is detected in bacterial cells, suggesting a link between the Gac/Rsm system and the "stringent" response. Determining the level of each Rsm ncRNA, which is defined by a balance between synthesis and degradation of each transcript, shows the maintenance of a very important pool of RsmZ compared to other ncRNAs.