Les ARN sont des molécules aux propriétés diverses interagissant les uns avec les autres dans le but de médier des fonctions spécifiques. L’évaluation de l’abondance relative des ARN est une étape cruciale à la compréhension de la stoechiométrie nécessaire à ces fonctions. Cependant, plusieurs biais et limitations s’imposent avec l’utilisation de différentes techniques d’évaluation, dont le séquençage d’ARN (RNA-Seq), qui sont problématiques dans l’estimation de l’abondance de différents types d’ARN. De récentes études ont exposé les avantages d’un protocole novateur de RNA-Seq qui utilise une rétrotranscriptase thermostable d’intron de groupe II (TGIRT) d’origine bactérienne afin de réduire ces biais. Ce mémoire fait la comparaison entre différentes techniques de RNA-Seq afin d’élucider si l’utilisation de TGIRT en RNA-Seq offre une représentation plus juste du transcriptome. Les comparaisons avec les valeurs d’abondance de différents types d’ARN décrites dans la littérature ainsi qu’obtenues expérimentalement par notre groupe pointent au fait que TGIRT donne une meilleure estimation de l’abondance relative des ARN, et plus particulièrement des ARN hautement structurés. Cette meilleure estimation de l’ensemble de la composition du transcriptome permet de faire des observations sur les rapports d’abondance entre des ARN codants et non-codants fonctionnellement apparentés. Notamment, des ratios d’expression constants entre les ARN non-codants associés à des RNP et les ARNm codants pour leur facteurs protéiques ont été observés. Ceci suggère la présence d’une régulation transcriptionnelle commune nécessaire à la stoechiométrie de ces complexes. Une forte disparité dans l’expression des snoRNA et de leurs gènes hôtes, dépendant du type de snoRNA et de gène hôte a par ailleurs été constatée, corroborant une régulation distincte de la stabilité de ces transcrits. Dans l’ensemble, nos données suggèrent que la méthode TGIRT-Seq est la plus appropriée dans l’évaluation du transcriptome entier et ouvre donc la voie à des analyses plus holistiques par RNA-Seq en donnant une estimation plus juste de l’abondance relative des transcrits d’ARN. / Abstract : RNA are molecules with a wide range of properties that can interact with one another to mediate specific function. The evaluation of RNA abundance is a crucial step in understanding the stoichiometry needed for these functions. However, many limitations and biases come with the use of different techniques, including RNA sequencing (RNA-Seq), which affects the estimation of the abundance of different RNA types. Recent studies have exposed the advantages of a new RNA-Seq protocol using a thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT) of bacterial origin to reduce these biases. This thesis makes the comparison between different RNA-Seq techniques to elucidate if the use of TGIRT in RNA-Seq offers a more representative depiction of the transcriptome. The comparisons with the abundance values given in literature and obtained experimentally by our group agree with the fact that TGIRT gives a better estimation of the relative abundance of RNA, especially highly structured RNA. This better estimation of the transcriptomic landscape allows many observations on the abundance relations between coding and non-coding RNA that are functionally related. Namely, constant expression ratios between RNP associated noncoding RNA and the mRNA that codes for their associated proteins have been observed. This suggests the presence of a common transcriptional regulation which is necessary for the stoichiometry of these complexes. A strong disparity in the expression of snoRNA and their host genes depending on snoRNA and host gene types has also been observed and corroborate a distinct regulation of these transcripts’ stability. In summary, our data suggest that the TGIRT-Seq method is the most appropriate to evaluate the transcriptome and thus opens the way to more holistic RNA-Seq analyses by giving a better estimation of RNA transcripts relative abundance.

Au cours de ces 10 dernières années une nouvelle classe de petits ARN non-codants nommés "tRNA-derived fragments" (tRFs) a été caractérisée. Tandis que le rôle canonique des tRNA est bien connu, les raisons pour lesquels des fragments de tRNA s'accumulent dans la cellule restent inconnues. Actuellement, peu d'informations sont disponibles sur leurs biogenèses et leurs rôles biologiques, mais les preuves montrant leur importance dans la régulation de l'expression des gènes augmente régulièrement. Cependant, peu de données sont disponibles chez les plantes. A l'aide d’expérience de "deep-sequencing" et de northern blot nous avons confirmé l'existence d'une grande population en tRFs d'origine variée. A la suite de ces observations, trois questions sont établies. Tout d'abord, quelles sont les enzymes responsables de la biogenèse des tRFs. Ensuite, où les tRFs sont générés. Enfin, est-ce que les tRFs sont des sous-produits de la dégradation des tRNA ou ont-ils une fonction biologique? / During the last decade, a new class of small non-coding RNAs called tRNA-derived fragments (tRFs) has emerged. Whilst the canonic role of tRNA is well-known, the reason(s) why stable tRFs remains in the cell is unknown. Indeed, the number of tRFs has rapidly increased in various evolutionary divergent organisms. To date, only few data on their biogenesis and on their biological roles is known but their importance in the regulation of gene expression and in cell life is expanding. In plants, the existence of tRFs has also been reported but only few data are available. Using deep-sequencing on various small RNA libraries from Arabidopsis thaliana and Northern blots experiments, we confirmed the existence of a large but specific population of tRFs. Following these observations, three questions are addressed. First, what are the enzymes responsible for tRFs biogenesis, second where are tRFs generated and third, are tRFs merely degredation by-products or do they have biological functions?

Des petits ARN non codants dérivant d'ARN de transfert (tRF) ont été identifiés dans tous les domaines de la vie, et de plus en plus de fonctions importantes leur sont attribuées chez de nombreux organismes. Dans ce travail mené sur la plante modèle Arabidopsis, nous avons d’abord montré que la population en tRF varie en fonction des tissus et des conditions de stress. Concernant leur biogenèse, les endoribonucléases responsables du clivage des ARNt ont été identifiées, il s'agit des RNases T2, RNS1, 2 et 3. Afin de réaliser une étude structure/fonction, une approche d’expression en système de levure a été initiée pour permettre l’obtention de quantité suffisante de RNS1 purifiée. L’étude des fonctions des tRF montre que certains d’entre eux sont associés à AGO1, qu'ils semblent cibler entre-autres des éléments transposables et qu’ils pourraient avoir une localisation nucléaire. Enfin, deux tRF, le tRF-5D (Ala) et le tRF-5D (Asn) inhibent efficacement la traduction in vitro. Une association de tRF-5D (Ala) aux polyribosomes de plantules d'Arabidopsis a pu être visualisée, suggérant que certains tRF puissent agir en tant que régulateur global de la traduction. / Small non-coding RNAs derived from transfer RNAs (tRFs) have been identified in all domains of life, and more and more important functions are attributed to them in many organisms. In this work on the model plant Arabidopsis, we first showed that the tRF population varies according to tissues and stress conditions. With regard to their biogenesis, the endoribonucleases responsible for tRNA cleavage were identified, it is the RNases T2, RNS1, 2 and 3. In order to carry out a structure / function analysis, heterologous expression in yeast has been developed with the hope to get sufficient amount of purified RNS1. The question of tRF functions has also been studied. It has been shown that some tRFs are associated with AGO1, that they often seem to target transposable elements and could have a nuclear localization. Finally, the study of the involvement of the tRFs in the regulation of translation was tackled. Two tRFs, tRF-5D (Ala) and tRF-5D (Asn) efficiently inhibit translation in vitro. An association of tRF-5D (Ala) with polyribosomes of Arabidopsis seedlings could be visualized suggesting that some plant tRFs could as global regulator of the translation process.

Chez les Mammifères femelles, l’extinction transcriptionnelle d’un des deux chromosomes X pendant l’embryogénèse précoce compense le déséquilibre de dose des gènes liés à l’X entre les sexes. L’inactivation aléatoire du chromosome X est mise en place dans la masse cellulaire interne du blastocyste et maintenue jusqu’à l’âge adulte dans le soma. Chez certains Euthériens incluant la souris, les tissus extra-embryonnaires (trophectoderme et endoderme primitif) montrent une inactivation soumise à empreinte du X paternel. Le statut inactif du Xp peut être étudié ex vivo dans les cellules souches trophoblastiques (TS) dérivées du trophectoderme. Nous avons pu sélectionner des cellules TS montrant une réactivation partielle du Xp ou bien une inversion complète du profil d’inactivation. Ceci révèle une plasticité épigénétique accrue de l’inactivation dans le trophectoderme par au soma.L’inactivation aléatoire du chromosome X est récapitulée pendant la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES), qui servent de modèle cellulaire. Ce processus est déclenché par l’accumulation en cis du long ARN non codant Xist qui crée un domaine nucléaire répresseur autour du futur chromosome X inactif. Avant la différenciation, l’accumulation de Xist est réprimée par un autre long ARN non codant, Tsix, qui est transcrit en antisens de Xist. Afin d’adresser la dynamique fonctionnelle des ARN Xist et Tsix, nous avons inséré différents motifs d’étiquetage au locus Xist/Tsix endogène. Incorporés dans l’ARN sens ou antisens, ces étiquettes sont reconnues spécifiquement par des molécules fluorescentes, permettant ainsi la visualisation de ces transcrits dans les cellules vivantes. / In female Mammals, the transcriptional silencing of one of the two X chromosomes during early embryogenesis compensates the dosage disequilibrium of X-linked genes between sexes. Random X chromosome inactivation occurs in the inner cell mass of the blastocyst and is maintained through adult life in the soma. In some Eutherian species including mice, extraembryonic tissues (trophectoderm and primitive endoderm) exhibit imprinted inactivation of the paternal X. The inactive state of the Xp can be extensively studied ex vivo in Trophoblast Stem (TS) cells derived from the trophectoderm. We were able to select from the general cell population, TS cells exhibiting partial reactivation of the Xp or showing a complete switch of imprinted X-inactivation pattern. This reveals an accrued epigenetic plasticity of imprinted X-inactivation in the trophectoderm as compared to random X-inactivation in the soma.Random X-chromosome inactivation is recapitulated during the differentiation of female Embryonic Stem (ES) cells – which serves as cellular model. This process is triggered by the cis-accumulation of Xist long non coding RNA molecules which create a nuclear repressive domain around the future inactive X chromosome. Before differentiation, the accumulation of Xist is repressed by another lncRNA, Tsix, that is transcribed antisense to Xist. In order to address the functional dynamics of Xist and Tsix RNAs, we inserted different types of tag sequences in the endogenous Xist/Tsix locus. Incorporated in the sense or antisense RNA, these tags are specifically recognized by fluorescent molecules, thereby allowing live cell imaging of these transcripts.

Seul 1,2% du génome code des protéines :98,8% est non-codant,cependant 93% du génome est transcrit, principalement en longs ARN non-codants (lncRNA). Or ces lncRNA constituent une nouvelle classe de régulateurs génomique agissant à tous les niveaux d’expression des gènes et ils sont fortement spécifiques du tissu,modulés au cours du temps et en conditions physiopathologiques.Ainsi,nous proposons que chaque cellule spécifiée exprime son répertoire de lncRNA spécifique avec une carte des zones de chromatines ouvertes renseignant son identité cellulaire.Dans cette perspective,nous avons isolé par FACS 2types cellulaires impliqués dans des pathologies: i) des neurones dopaminergiques humains(nDA) différenciés à partir d’hiPS et ii) des neurones DA et sérotoninergiques (n5-HT)murins.Sur ces 2types neuraux isolés,nous avons identifié 1363 lncRNA exprimés dans les nDA (dont 989nouveaux) constituant le répertoire des neurones DA et 1257 lncRNA dans les n5-HT (719nouveaux) constituant le répertoire des n5-HT.Or leur comparaison a montré que seuls 194 lncRNA sont communs aux 2types cellulaires:la majorité des lncRNA est exprimée soit dans les nDA soit dans les n5-HT,attestant leur spécificité cellulaire.De plus,39%des zones de chromatines ouvertes/potentiellement régulatrices des nDA ne sont pas non plus retrouvées dans les n5-HT.Ainsi, nous avons généré un catalogue d’éléments non codants constituant des signatures moléculaires spécifiques des nDA et n5-HT,ouvrant de nouvelles pistes physiopathologiques:Dans cette optique,les signatures non codantes DA ont été comparées avec les SNP associés à la maladie de Parkinson et des études de fonction sur des lncRNA candidats ont été réalisées. / Only 1.2% of the genome codes for proteins; 98.8% is thus non-coding, despite 93% of the human genome being actively transcribed, mostly in long non-coding RNA (lncRNA).These lncRNA constitute a new class of genomic regulator capable of acting at all levels of gene expression and their expression is highly tissue-specific,modulated during the time and under normal/pathological conditions.Thus, we propose that each specified cell expresses a specific repertoire of lncRNA correlated to open/active chromatin regions specifying its cellular identity.In this context, we isolated by FACS 2neural types involved in many pathologies: i) human dopaminergic neurons (nDA) differentiated from hiPS and ii) DA and serotoninergic (n5-HT) neurons. From these 2neural types, we identified 1,363 lncRNA in nDA (among which 989 new, whether 73%) constituting the repertoire of nDA, and 1,257 lncRNA (among which 719 new) constituting the repertoire of n5-HT. Moreover,their comparison has shown that only 194 lncRNA are common to both neural types:thus the majority of lncRNA is expressed either in nDA or in n5-HT, indicating a high degree of cell-specificity.In addition, 39% of open chromatin regions, potentially regulatory, were also not detected in the n5-HT.Thus, we have generated DA and 5-HT specific catalogues of non-coding elements of the genome, which constitute DA and 5-HT specific molecular signatures, that could participate in deepening our knowledge regarding nDA or n5-HT development and dysfunctions. With this in mind,these DA specific elements have been compared with the SNP described as Parkinson Disease risk variants and candidate lncRNA were selected to perform studies of function.

L'expression du gène Igf2, qui est soumis à l'empreinte génomique parentale chez les mammifères, est hautement régulée au cours du développement embryonnaire et de la période périnatale grâce à divers mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels. Ces mécanismes mettent à contribution de longs ARN non codants produits au sein même du locus, dont le plus connu est l'ARN H19. En utilisant une approche de complémentation génétique par un transgène H19 dans myoblastes H19 KO de souris, nous démontrons l'existence de plusieurs nouveaux promoteurs d'Igf2. L'un de ces promoteurs, qui est conservé chez l'homme, peut être activé par un ARN ectopique antisens d'H19 (lncARN 91H) en dépit d'une méthylation complète de la région de contrôle empreinte située en cis sur le même allèle. Nous montrons également que les lncARN 91H présentent une certaine spécificité tissulaire et que leur transcription peut être initiée à partir des séquences conservées CS4, CS5 et CS9 situées en aval du gène H19. Quant à l'ARN H19, qui est l'ARN non codant majeur du locus, il semble pouvoir réguler ses transcrits antisens dans les myoblastes H19 KO complémentés par le transgène H19, mais surtout il participe activement à la régulation post-transcriptionnelle du gène Igf2 chez la souris. Nous observons en effet qu'il favorise la coupure endoribonucléolytique de l'ARN Igf2 par un mécanisme qui reste à découvrir. Enfin, nous mettons en évidence l'existence d'un l'arrêt de l'élongation de la transcription du gène d'Igf2, pour lequel nous proposons un modèle de régulation faisant intervenir un autre long ARN non codant du locus: le lncARN PIHit. Au-delà des mécanismes qui restent à explorer, nos résultats renforcent l'idée que la structure tridimensionnelle de la chromatine participe à la régulation de l'expression des gènes chez les mammifères. / In mammals, the expression of the Igf2 gene, which is subject to parental genomic imprinting, is tightly regulated during embryonic development and the perinatal period through several transcriptional and post-transcriptional mechanisms. These mechanisms are involving long non-coding RNAs (lncRNAs) produced within the locus; among them the best known is probably the H19 RNA. Using a genetic complementation assay consisting in transfections of an H19 transgene into H19 KO myoblasts, we discovered several novel Igf2 promoters in the mouse. One of these promoters, that is conserved in the human, can be activated by ectopic H19 antisens RNAs (91H lncRNAs) despite a complete methylation of the Imprinting-Control Region located in cis on the same allele. We also show that the 91H lncRNAs possess some tissue-specific features and that their transcription can be initiated from the CS4, CS5 and CS9 conserved sequences located downstream of the H19 gene. On the other hand, the H19 RNA, that is the major lncRNA of the locus, appears to regulate its antisense transcripts in H19 KO myoblasts complemented with the H19 transgene, but its major function seems to be in regulating post-transcriptionally the Igf2 gene expression. Indeed, we have observed that it favours the endoribonucleolytic cleavage of the Igf2 messenger RNAs through a mechanism that remains to be elucidated. Finally, we reveal the existence of a premature transcriptional elongation stop of the Igf2 gene, for which we propose a regulation model involving another lncRNA of the locus: the PIHit lncRNA. Beyond the mechanisms that remain to be explored, our results strengthen the idea that, in mammals, the three-dimensional organization of the chromatin is involved in regulating gene expression.

Les applications des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) dans le domaine biomédical sont particulièrement prometteuses, aussi bien au niveau expérimental qu’au niveau clinique. Leur utilisation comme source inépuisable de cellules permettant de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques (notamment par modélisation de pathologies in vitro, criblage haut-débit et tests de cytotoxicité) s’ajoute à l’important potentiel qu’elles présentent en médecine régénérative et en thérapie cellulaire. Utilisables comme matériel biologique permettant de restaurer partiellement ou totalement un organe ou un tissu défaillant, il reste essentiel de vérifier l’intégrité génétique des lignées cellulaires utilisées afin de garantir une utilisation sécurisée pour le patient. Parmi les facteurs responsables de l’apparition d’anomalies génétiques chez les CSP, les conditions cultures jouent un rôle essentiel. Des techniques de culture inadaptées peuvent facilement provoquer l’émergence d’une instabilité génomique. Toute altération doit être détectée et documentée afin de pouvoir définir des critères d’acceptation préalable à leur utilisation clinique.Les CSP sont des cellules particulièrement sensibles au stress qui peut résulter de techniques de repiquage inappropriées. La dérive génétique qui découle de ce stress peut être précoce et apparaître dès les premiers passages des lignées cultivées. Notre équipe a pu tester de nombreuses méthodes de repiquage sur différentes lignées cellulaires pluripotentes. Nous avons notamment observé que des anomalies génétiques majeures caryotypiques (trisomies) et infra-caryotypiques (SNPs) ainsi que des changements phénotypiques (survie augmentée, acquisition de mobilité) apparaissaient rapidement suite à l’utilisation de techniques de repiquage basées sur l’utilisation d’enzyme de dissociation (TryPLE). Ces altérations apparaissent dans des lignées qui s’adaptent progressivement à la dissociation en cellules uniques (dissociation « single-cell ») provoquées par ces enzymes.Notre équipe étudie les conséquences cellulaires liées à ce phénomène d’adaptation des CSP provoquée par la dissociation « single-cell ». Grâce à des techniques de séquençage dernière génération (RNA-Seq), nous avons comparé les profils transcriptomiques de CSP repiquées par des techniques standard (comme le passage mécanique) et par des techniques basées sur la dissociation « single-cell » (comme le passage enzymatique par TryPLE). Cette comparaison a montré au niveau transcriptionnel une surexpression spectaculaire d’ARNs non codants appartenant à une classe récemment décrite : les longs ARNs non codants (lncRNAs).L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’évaluer le niveau d’implication de ces lncRNAs dans le processus d’adaptation des CSP en culture, et leur rôle fonctionnel potentiel. Nous avons ainsi dans un premier temps déterminé in silico quels lncRNAs étaient différentiellement exprimés dans les CSP adaptées, et après validation expérimentale par biologie moléculaire des candidats les plus prometteurs, nous avons utilisé des tests fonctionnels (notamment par RNA interférence (siRNA)) afin de déterminer le rôle de ces lncRNAs dans la machinerie cellulaire et la pluripotence des CSP. Autour de ce projet principal, nous avons essayé de comprendre les mécanismes régissant les changements phénotypiques et comportementaux provoquées par la dissociation « single-cell ». Nous avons notamment pu suggérer la mise en place d’un phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez des CSP dissociées. Enfin, l’attractivité que représente un sujet d’étude récent comme les lncRNAs et la disponibilité croissante de publications les concernant nous ont poussé à publier une revue approfondie ainsi qu’une méta-analyse sur l’implication des longs ARN non codants dans le développement précoce de l’embryon et dans les cellules souches pluripotentes. / The actual and future applications of human pluripotent stem cells (PSC) in the biomedical field are highly promising. Their use for the discovery of new therapeutic drugs through the development of high-throughput screening tests, cytotoxicity tests and in vitro disease modeling has been added to their tremendous interests in regenerative medicine and cellular therapy. As a source of biological material that can be used to restore partially or totally the lost functions of a damaged organ or tissue, or as a source of normal cells to study human development or test putative new drugs, their genomic integrity has to be thoroughly assessed. Therefore, an effective optimization of their culture conditions has to be considered, in order to control the absence of genomic instability and prevent their potential emergence. Any genetic or epigenetic alteration resulting from cell culturing must be detected in order to define and characterize acceptance criteria for scientific and medical purposes.PSC are particularly sensitive to stress resulting from unappropriated passaging techniques, which cause rapid genetic drift. Indeed, our team observed that many genomic abnormalities arise from aggressive single cell, enzymatic based, passaging methods, and that substantial phenotypical changes such as increased survival after cell dissociation and variation in cell shape can then occur.In order to understand the mechanisms governing the emergence of those adverse alterations, the team focused on the consequences resulting from the adaptation of PSC to single-cell dissociation. By using new generation sequencing techniques as RNA-Seq, we compared transcriptomics of PSC passaged by standard techniques (such as mechanical passaging) versus single-cell enzymatic dissociation (such as TRyPLE-based single-cell passaging). This comparison showed that the most striking difference in the gene expression pattern between adapted and non adapted cells concerned the dramatic overexpression of RNAs from a recently discovered class: long non-coding RNAs (lncRNAs).The aim of this thesis work was to determine to which extent some of these lncRNAs were functionally linked to adaptation of PSC. In order to address this matter, we first investigated in silico which lncRNAs were upregulated by single-cell dissociation, and after experimental validation of lncRNA candidates by molecular biology, we performed functional in vitro analysis (notably by siRNA-mediated loss of function) and sought their cellular localization in order to decipher their role in the cellular machinery and their level of implication. Beside this main project, other auxiliary projects were grafted. The observation of major changes in cell phenotype and behavior led to the investigation of the global mechanisms governing these modifications, underlining the potential role of epithelial-to-mesenchymal transition provoked by single-cell dissociation. Finally, the global attractiveness of lncRNAs and the emergence of exponential documentation concerning non-coding RNAs prompted the writing of an extensive review and meta-analysis concerning the implications of lncRNAs during embryo development and in pluripotent stem cells.

A chaque instant notre organisme est confronté à des agents pathogènes de nature très variable. Pourtant, malgré toutes les agressions rencontrées, il maintient une certaine intégrité. Cette dernière résulte de la mise en place d’un système de défense perfectionné, fruit de la collaboration étroite de diverses cellules :le système immunitaire. Parmi toutes les cellules qui le composent, les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant. Disséminées dans la plupart de nos organes et tissus, elles surveillent, en alerte du moindre danger. Elles orchestrent la réponse immune :elles sont capables d'initier et polariser une réponse immune ou d'instaurer la tolérance. De nombreux traitements thérapeutiques tentent d’exploiter leurs capacités intrinsèques. Ces cellules présentent en effet un grand potentiel dans la vaccination anti-tumorale et antivirale, dans l’acceptation de greffes et le contrôle de maladies auto-immunes. Toutefois, de nombreux éclaircissements restent encore à apporter que ce soit sur l’ontogénie des cellules dendritiques, leur rôle ou leur propre biologie. <p><p>Aussi, le dessein de ce travail était d’approfondir nos connaissances fondamentales sur les propriétés moléculaires et la biologie des cellules dendritiques afin de mieux appréhender la nature et l’amplitude des réponses qu’elles induisent. A cette fin, nous avons identifié deux nouveaux gènes qu’elles expriment préférentiellement et nous avons essayé de caractériser leur fonction. L’avènement de l’utilisation de la technique d’ARN interférence dans les systèmes de mammifères et le développement des vecteurs lentiviraux nous sont apparus comme des outils présentant un réel potentiel pour répondre à nos questions. Nous avons donc généré des souris qui sur- ou sous- expriment le gène d’intérêt, par infection lentivirale d’embryons, pour tenter de cerner son rôle in vivo. Cette méthode de transgénèse était très prometteuse car rapide, efficace, peu onéreuse et sollicitait peu de compétences pour la manipulation des embryons. Cependant, l’approche s’est révélée plus laborieuse que prévu. Nous avons en effet rencontré de nombreux phénomènes de variégation et de « silencing » qui a rendu plus ardue l’utilisation des souris transgéniques. Néanmoins, nous pensons aujourd’hui être à même d’élaborer une stratégie de sélection des souris générées par transgénèse lentivirale qui ne développeraient probablement pas les problèmes rencontrés. Au cours de l’étude, nous avons également observé une fluctuation de l’activité du promoteur CAG pendant le développement thymique, pointant l’importance du choix d’un promoteur optimal en fonction du projet de recherche. Enfin, l’analyse des souris, bien que préliminaire, suggère un rôle potentiel d’un des gènes examinés dans la différenciation, la mobilisation ou la survie des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes B.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez la souris, le Leukemia Inhibitory Factor (LIF) joue un rôle clé dans le maintien des cellules souches embryonnaires (ES) à l’état pluripotent. Le LIF agit en activant le facteur de transcription STAT3 via les kinases Jak. Cette activation est nécessaire et suffisante au maintien des cellules ES en autorenouvellement en présence de sérum. Une étude du transcriptome de STAT3 réalisée au laboratoire a permis d’identifier plusieurs gènes cibles de ce facteur, parmi lesquels plusieurs gènes inconnus. L’un d’eux, le gène 1456160_at, est fortement exprimé dans les cellules ES de souris et son expression diminue après induction de la différenciation. Ce gène a été appelé Asgard pour Another Self-renewal GuARDian. La caractérisation et le séquençage de ce gène ont permis de mettre en évidence qu'Asgard code pour un microARN. De nombreux microARNs jouent un rôle clé dans le maintien de l'autorenouvellement des cellules ES et dans le contrôle de la différenciation. Des expériences d’inhibition et de surexpression ont permis de montrer que Asgard est impliqué dans la régulation de la différenciation endoderme versus mésoderme. Des analyses préliminaires ont permis d’identifier Pbx3, FoxA2 et Sox17 comme cibles potentielles. Bien que les mécanismes d’action du microARN Asgard restent à confirmer, ce travail a permis d’identifier un nouveau gène clé de l'autorenouvellement des cellules ES de souris / The Leukemia Inhibitory Factor (LIF) activates the transcription factor STAT3, which results in the maintenance of mouse embryonic stem cells in the undifferentiated state by inhibiting mesodermal and endodermal differentiation. We identified several target genes of STAT3 by transcriptomic analysis. Among them, we focused on an unknown gene referred as 1456160_at on Affymetrix array. This gene is highly expressed in embryonic stem cells and its expression level decreases during differentiation. We named this gene Asgard for Another Self-renewal GuARDian. Its characterization and sequencing revealed that Asgard encodes for a microRNA sequence. Several microRNAs have been shown to play key role in the maintenance of self-renewal of mouse ES cells and in the control of differentiation. Inhibition and overexpression assays showed that Asgard inhibits endodermal differentiation in order to maintain self-renewal. Through preliminary analysis, we identified Pbx3, FoxA2 and Sox17 as potential targets of the microRNA Asgard. Our work enables us to identify a new key gene of self-renewal of mouse ES cells

La principale contribution de cette thèse est le développement d'une méthode fiable, robuste, et rapide pour la prédiction des pré-miARNs. Deux objectifs avaient été assignés : efficacité et flexibilité. L'efficacité a été rendue possible au moyen d'un algorithme quadratique. La flexibilité repose sur deux aspects, la nature des données expérimentales et la position taxonomique de l'organisme (en particulier plantes ou animaux). Mirinho accepte en entrée des séquences de génomes complets mais aussi les très nombreuses séquences résultant d'un séquençage massif de type NGS de “RNAseq”. “L'universalité” taxonomique est obtenu par la possibilité de modifier les contraintes sur les tailles de la tige (double hélice) et de la boule terminale. Dans le cas de la prédiction des miARN de plantes la plus grande longueur de leur pré-miARN conduit à des méthodes d'extraction de la structure secondaire en tige-boule moins précises. Mirinho prend en compte ce problème lui permettant de fournir des structures secondaires de pré-miARN plus semblables à celles de miRBase que les autres méthodes disponibles. Mirinho a été utilisé dans le cadre de deux questions biologiques précises l'une concernant des RNAseq l'autre de l'ADN génomique. La première question a conduit au traitement et l'analyse des données RNAseq de Acyrthosiphon pisum, le puceron du pois. L'objectif était d'identifier les miARN qui sont différentiellement exprimés au cours des quatre stades de développement de cette espèce et sont donc des candidats à la régulation des gènes au cours du développement. Pour cette analyse, nous avons développé un pipeline, appelé MirinhoPipe. La deuxieme question a permis d'aborder les problèmes liés à la prévision et l'analyse des ARN non-codants (ARNnc) dans la bactérie Mycoplasma hyopneumoniae. Alvinho a été développé pour la prédiction de cibles des miRNA autour d'une segmentation d'une séquence numérique et de la détection de la conservation des séquences entre ncRNA utilisant un graphe k-partite. Nous avons finalement abordé un problème lié à la recherche de motifs conservés dans un ensemble de séquences et pouvant ainsi correspondre à des éléments fonctionnels / The main contribution of this thesis is the development of a reliable, robust, and much faster method for the prediction of pre-miRNAs. With this method, we aimed mainly at two goals: efficiency and flexibility. Efficiency was made possible by means of a quadratic algorithm. Flexibility relies on two aspects, the input type and the organism clade. Mirinho can receive as input both a genome sequence and small RNA sequencing (sRNA-seq) data of both animal and plant species. To change from one clade to another, it suffices to change the lengths of the stem-arms and of the terminal loop. Concerning the prediction of plant miRNAs, because their pre-miRNAs are longer, the methods for extracting the hairpin secondary structure are not as accurate as for shorter sequences. With Mirinho, we also addressed this problem, which enabled to provide pre-miRNA secondary structures more similar to the ones in miRBase than the other available methods. Mirinho served as the basis to two other issues we addressed. The first issue led to the treatment and analysis of sRNA-seq data of Acyrthosiphon pisum, the pea aphid. The goal was to identify the miRNAs that are expressed during the four developmental stages of this species, allowing further biological conclusions concerning the regulatory system of such an organism. For this analysis, we developed a whole pipeline, called MirinhoPipe, at the end of which Mirinho was aggregated. We then moved on to the second issue, that involved problems related to the prediction and analysis of non-coding RNAs (ncRNAs) in the bacterium Mycoplasma hyopneumoniae. A method, called Alvinho, was thus developed for the prediction of targets in this bacterium, together with a pipeline for the segmentation of a numerical sequence and detection of conservation among ncRNA sequences using a kpartite graph. We finally addressed a problem related to motifs, that is to patterns, that may be composed of one or more parts, that appear conserved in a set of sequences and may correspond to functional elements.